李明哲　韓金秀

摘要：本文通過(guò)查閱近年來(lái)相關(guān)資料，從性狀、顯微、分子標(biāo)記、高效液相等鑒定，概述貝母類藥材鑒定技術(shù)近年來(lái)的研究進(jìn)展，為今后貝母類藥材的鑒定提供參考。

關(guān)鍵詞：貝母類藥材；鑒定技術(shù)；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)：R282.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編號(hào)：10.14025/j.cnki.jlny.2016.10.028

貝母類藥材作為臨床上的常用藥，其來(lái)源復(fù)雜，經(jīng)常出現(xiàn)偽品。本文綜述貝母類藥材的鑒定方法，對(duì)今后的貝母類藥材的應(yīng)用有較高的實(shí)踐意義。

1 性狀鑒定

性狀鑒定主要是觀察完整的中藥及中藥飲片。唐生斌等運(yùn)用性狀的不同特征對(duì)貝母類藥材及它的混淆品、偽品等進(jìn)行對(duì)比研究，得出不同樣品的性狀具有一定的差異，可以將性狀特征的差異作為貝母屬種間鑒別的參考依據(jù)。

浙貝母：扁圓球形，高10～20毫米，直徑10～35毫米，二瓣，類腎形，近等大，表面稍粗糙，類白色至淡黃色，內(nèi)表面淡棕色。

湖北貝母：扁圓球形，高6～22毫米，直徑6～35毫米，二瓣，類腎形，多數(shù)大小懸殊，表面稍粗糙（有的可見(jiàn)棕色斑點(diǎn)），類白色至淡棕色。

伊貝母：新疆貝母為類球形略扁，高5～10毫米，直徑6～12毫米，二瓣，月牙形，近等大，緊靠，類白色，表面光滑。伊犁貝母為圓錐形或類球形，高8～12毫米，直徑10～25毫米，二瓣，心形，近等大，類白色或淡黃色，表面稍粗糙。

平貝母：扁球形，高5～10毫米，直徑6～20毫米，二瓣，大小相近相對(duì)抱合，乳白色或淡黃白色，表面光潔。

川貝母：松貝為類圓錐形或近球形，高3～8毫米，直徑3～9毫米，二瓣，大小懸殊，呈懷中抱月形，類白色，表面光潔。青貝為類球形或扁球形，高4～14毫米，直徑4～16毫米，二瓣，大小相近，相對(duì)抱合，類白色，表面光潔。爐貝為長(zhǎng)圓錐形或略扁斜，高7～25毫米，直徑5～25毫米，二瓣，大小相近，相對(duì)抱合，類白色或淺棕黃色，表面有的具有棕色斑點(diǎn)。

2 顯微鑒定

顯微鑒別是鑒別貝母類藥材的重要方法之一，可以通過(guò)藥材的粉末顏色，淀粉粒大小、形狀，層紋形狀、有無(wú)，臍點(diǎn)位置、形狀等多種因素進(jìn)行區(qū)別。

通過(guò)比較可知，浙貝母粉末為淡黃色，湖北貝母、川貝母、伊貝母、平貝母粉末為類白色。浙貝母區(qū)別于其他貝母的最大區(qū)別是可見(jiàn)草酸鈣針晶，川貝母、平貝母、伊貝母粉末均有多臍點(diǎn)單粒和復(fù)粒，川貝母中多臍點(diǎn)單粒數(shù)目最多，浙貝母中復(fù)粒最多。平貝母、浙貝母、伊貝母粉末中的淀粉顆粒邊界較光滑，湖北貝母有起伏，而川貝母有短分枝，這可分別作為鑒別湖北貝母和川貝母的一大特征。湖北貝母淀粉粒層紋最為明顯，這一特點(diǎn)也成為5種貝母中湖北貝母的最大鑒別特征。

3 薄層色譜（TCL）鑒定

黃小鷗等“采用了氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水（40：40：15：10）的下層溶液和正己烷-醋酸乙酯-二乙胺（11：14：1：5）兩個(gè)溶劑系統(tǒng)作為鑒別湖北貝母、川貝母、平貝母、浙貝母和伊貝母薄層色譜法的溶劑系統(tǒng)，通過(guò)譜圖可知伊貝母中含有西貝母堿，無(wú)貝母素甲和貝母素乙，而其他四種貝母則含有貝母素甲和貝母素乙，無(wú)西貝母堿。吳曉民等運(yùn)用薄層色譜法對(duì)不同品種、產(chǎn)地、采收期的平貝母和偽品之間進(jìn)行了比較和分析，其結(jié)果顯示，不同采收期及不同產(chǎn)地的平貝母譜圖相近，而不同品種的平貝母和平貝母?jìng)纹返淖V圖之間有著明顯差異，所以采用薄層色譜（TCL）鑒定法可以對(duì)平貝母藥材的鑒別提供有利依據(jù)。

4 分子標(biāo)記鑒定

從分子遺傳學(xué)角度來(lái)看，基因型的差異是物種表現(xiàn)型的主要差異，即DNA序列上的差異，這種差異是個(gè)體的差異并且不受環(huán)境影響，所以通過(guò)對(duì)基因型差異的比較研究也能進(jìn)行植物分類和鑒定。同時(shí)隨著新科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展創(chuàng)新，出現(xiàn)了分子生物學(xué)鑒定方法，所以通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)中藥基原植物及其飲片鑒定得到了極大的發(fā)展。

4.1 隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）

李玉鋒等運(yùn)用RAPD技術(shù)分析了8種貝母其基因組DNA多態(tài)性以及構(gòu)建了樹(shù)狀聚類圖，結(jié)果顯示親緣關(guān)系最近的為產(chǎn)地相同的川貝母和康定貝母，但產(chǎn)地不同的伊貝母、浙貝母、平貝母與川貝母等相同產(chǎn)地的貝母遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)。因此可知，地理的分布距離越小，貝母的遺傳差異性越小，反之則越大。尹春萍等對(duì)暗紫貝母和湖北貝母采用RAPD法篩選出特異性高的引物進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。龔伯奇通過(guò)RAPD技術(shù)進(jìn)行分析了青海省四個(gè)地區(qū)的暗紫貝母遺傳多樣性，通過(guò)獲得的多態(tài)性信息將每個(gè)樣地的樣品準(zhǔn)確地將聚類在一起。周潔采用RAPD標(biāo)記和ISSR標(biāo)記相結(jié)合的技術(shù)對(duì)12個(gè)浙貝母的品種進(jìn)行了分子鑒定，將地種植的貝母類群和磐安引種貝母劃分開(kāi)，發(fā)現(xiàn)了RAPD的聚類結(jié)果與ISSR標(biāo)記得到的聚類結(jié)果基本一致，從而肯定了RAPD技術(shù)的鑒定準(zhǔn)確性。

4.2 簡(jiǎn)單重復(fù)區(qū)間標(biāo)記技術(shù)（inter-simple sequencerepeat，ISSR）

通過(guò)對(duì)SSR技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)后得到了新型分子標(biāo)記技術(shù)，ISSR技術(shù)是以SSR序列為引物并在3'端或者5'端加上2～4個(gè)隨機(jī)核苷酸，PCR過(guò)程中使錨定引物引起特意位點(diǎn)的退火，使重復(fù)序列間DNA片段成功擴(kuò)增。因?yàn)椴煌锓N、不同品種的SSR在基因組中的位置和數(shù)量均具有差異性，所以擴(kuò)增結(jié)果將不同，這種結(jié)果又叫做多態(tài)性。劉曉賢等對(duì)2個(gè)川貝母居群、1個(gè)皖貝母居群、1個(gè)東貝母居群和8個(gè)浙貝母居群采用ISSR-PCR技術(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明和其他產(chǎn)區(qū)浙貝居群相比，磐安地區(qū)的浙貝居群有明顯的區(qū)別，且長(zhǎng)期的留種栽培使磐安浙貝遺傳多樣性水平降低，所以形成了相對(duì)穩(wěn)定的遺傳。王果平等運(yùn)用ISSR技術(shù)對(duì)新疆貝母屬的遺傳多樣性進(jìn)行聚類分析，把十種貝母分成三個(gè)類群。結(jié)果表明聚類在一起的為托里貝母、黃花貝母、小白花貝母和大白花貝母。趙鑫等㈣探究了Mg²⁺濃度、引物、dNTP和TagDNA聚合酶用量這四個(gè)要素對(duì)伊貝母ISSR-PCR擴(kuò)增的影響，并確定了伊貝母ISSR反應(yīng)體系，這對(duì)其他貝母屬藥用植物的ISSR反應(yīng)體系的建立具有指導(dǎo)作用。

4.8 DNA條形碼技術(shù)鑒定

通過(guò)選取進(jìn)化速率較快、普遍性高以及種內(nèi)遺傳較為穩(wěn)定的DNA序列，設(shè)計(jì)相對(duì)應(yīng)的引物，使用PCR技術(shù)擴(kuò)增出待鑒定物種對(duì)應(yīng)DNA片段序列，通過(guò)直接測(cè)序的方法獲得序列信息，并運(yùn)用MEGA等軟件比對(duì)序列信息，便能對(duì)其進(jìn)行物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)件，這種技術(shù)稱為DNA條形碼技術(shù)。這種技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性強(qiáng)，不受樣品個(gè)體差異和環(huán)境影響，鑒定效率高等優(yōu)點(diǎn)。余超等在貝母屬植物中采用DNA條形碼技術(shù)從8個(gè)貝母屬21個(gè)樣品中提取了基因組DNA，進(jìn)行ITS1、ITS2序列的PCR擴(kuò)增和測(cè)序，并比較了各樣品DNA提取率、PCR擴(kuò)增率及測(cè)序成功率。最終測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)BLAST搜索法評(píng)價(jià)、SPSS軟件分析及MEGA軟件的構(gòu)建，其結(jié)果表明ITS2序列能夠更準(zhǔn)確鑒定不同物種貝母，適合作為貝母屬植物的通用條形碼序列。譚瑩等通過(guò)研究建立了川貝母DNA指紋鑒別方法，結(jié)果顯示川貝母能擴(kuò)增出的片段可達(dá)到274bp，而其余貝母均未擴(kuò)增出相應(yīng)片段。由于此種方法具有簡(jiǎn)便、快速及結(jié)果可靠的優(yōu)點(diǎn)，所以可作為川貝母及其偽品之間鑒定的有效手段。李敏等對(duì)浙貝母Fritillaria thunbergii通過(guò)特異性引物進(jìn)行特異性PCR鑒定，結(jié)果顯示浙貝母在約750 bp處出現(xiàn)特異性條帶，其他貝母品種屬則未出現(xiàn)相應(yīng)條帶。羅焜等也使用ITS2序列技術(shù)對(duì)川貝母基原植物及其混偽品進(jìn)行了準(zhǔn)確區(qū)分，并將太白貝母、梭沙貝母、瓦布貝母、暗紫貝母、卷葉貝母、甘肅貝母這六種不同的川貝母基原植物聚類在一起，驗(yàn)證了藥典的準(zhǔn)確性。

4.4 其他分子標(biāo)記技術(shù)

主要通過(guò)對(duì)編碼蛋白質(zhì)的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，同時(shí)構(gòu)建物種cDNA文庫(kù)，通過(guò)ESTs圖譜區(qū)分基因水平的差異，這種技術(shù)叫做表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，ESTs）技術(shù)。現(xiàn)今，在川貝母的cDNA文庫(kù)中，已經(jīng)有超過(guò)1343個(gè)獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄組和超過(guò)2158條高品質(zhì)的ESTs序列信息。目前發(fā)現(xiàn)的川貝母生化活性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄集合主要包括氨基酸轉(zhuǎn)移酶、FPSs、CYP450s、HMGR等數(shù)十個(gè)，為貝母甾體生物堿合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組基因鑒定技術(shù)提供了進(jìn)一步的支持。

5 傅里葉變換紅外光譜法FTIR

利用FTIR中的OMNI采樣器直接測(cè)定藥材紅外光譜，可減少萃取或粉碎過(guò)程中增加的不確定因素，增大結(jié)果的可信度。程存歸等通過(guò)本方法對(duì)小東貝、珠貝和川貝母進(jìn)行鑒別，結(jié)果表明芯芽的紅外光譜是三者之間最大的區(qū)別。葉曉鐳等采用本方法對(duì)甘肅貝母、暗紫貝母等26種貝母類藥材及其偽品進(jìn)行分析鑒定，其結(jié)果顯示對(duì)于區(qū)分不同種類的貝母及其偽品時(shí)本方法是準(zhǔn)確可行的。

6 高效液相色譜法

張國(guó)欣等運(yùn)用高效液相色譜法建立并分析了湖北貝母的指紋圖譜。李玉鋒等通過(guò)指紋圖譜研究顯示，貝母素甲是貝母類藥材主要的生物堿之一，但是含量在不同貝母之間差別比較大，本研究有助于貝母指紋圖譜的建立。蔡曉翠等對(duì)10批不同種植區(qū)的伊貝母通過(guò)HPLC-ELSD指紋圖譜進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)色譜峰整體特征具有很高的相似度，伊犁不同產(chǎn)區(qū)的伊貝母中西貝母堿含量有著顯著的差異，并且在同一產(chǎn)區(qū)不同采收期其西貝母堿含量也存在著差異。

周建良等運(yùn)用快速液相色譜對(duì)產(chǎn)于不同地區(qū)浙貝母的主要成分特征圖譜進(jìn)行比較分析，強(qiáng)調(diào)了在高度精確的定量分析基礎(chǔ)上各藥材之間含量及化學(xué)成分上的差異，可作為不同貝母品種的區(qū)分依據(jù)以及為藥材的規(guī)格、品級(jí)和同種采收季節(jié)和藥材地提供定量數(shù)據(jù)支持。賀美艷等采用高效液相色譜法對(duì)浙貝、川貝、平貝、新疆貝母中鳥(niǎo)苷、尿苷、尿嘧啶、腺苷的含量進(jìn)行檢測(cè)，最終確定尿嘧啶能夠與鳥(niǎo)苷、尿苷、腺苷線性良好，同時(shí)達(dá)到基線分離，指標(biāo)成分含量在四種貝母中具有顯著的差異。

7 三相靜態(tài)萃取HPLC鑒定法

于海英等采用不同洗脫梯度、同一流動(dòng)相系統(tǒng)，通過(guò)液-液-液三相靜態(tài)萃取技術(shù)制備樣品的方法，測(cè)定五種貝母的不同萃取餾分，其中極性萃取餾分的譜圖基線、分離度及對(duì)稱性較好，從而確定可以采用三相靜態(tài)萃取HPLC鑒定法對(duì)貝母類藥材進(jìn)行鑒定及相關(guān)質(zhì)量評(píng)價(jià)。

8 近紅外漫反射光譜法

鄧波等對(duì)東北平貝母、浙貝母、川貝母的48個(gè)樣品通過(guò)近紅外漫反射光譜和主成分分析法相結(jié)合的方法進(jìn)行分析，最終發(fā)現(xiàn)近紅外漫反射光譜分析法可以較好地表征48個(gè)樣品的類別關(guān)系，從而確定近紅外漫反射光譜法可用于鑒定及區(qū)分貝母類藥材。高越等對(duì)十種貝母藥材通過(guò)褶合變換一可視化一相似系數(shù)分析、近紅外漫反射光譜并和聚類分析等相結(jié)合的方法進(jìn)行分析，結(jié)果顯示聚類分析可將3種貝母?jìng)纹泛?種貝母正品區(qū)別開(kāi)來(lái)，褶合變換一可視化一相似系數(shù)分析方法則可以更詳細(xì)的區(qū)分貝母正品之間的微小差異，從而改善了正品貝母之間的鑒別效果，同時(shí)為貝母正品之間的鑒別提供有利依據(jù)。

9 熱分析法

王書(shū)軍等對(duì)九種貝母類藥材進(jìn)行熱分析，并得出結(jié)論，不同的氣候，不同的地理環(huán)境和不同來(lái)源的貝母的熱分析圖譜之間存在顯著差異。其中平貝母與湖北貝母的差熱圖譜有明顯差異，平貝母的熱穩(wěn)定性最差，而湖北貝母的熱穩(wěn)定性最高。因此可以通過(guò)貝母類藥材熱分析圖譜的差異，更簡(jiǎn)單的對(duì)其進(jìn)行鑒別與區(qū)分。

10 X射線粉末衍射法

王書(shū)軍等對(duì)五種貝母類藥材通過(guò)x射線衍射進(jìn)行了分析測(cè)定，通過(guò)對(duì)譜圖分析可知，湖北貝母、伊貝母、平貝母和浙貝母中淀粉屬于B型，川貝母中淀粉屬于CB型，且五種貝母的粉末結(jié)晶度完全不同，因此可運(yùn)用X射線粉末衍射圖譜分析、藥材本身淀粉顆粒的晶體類型和藥材中粉末結(jié)晶度相結(jié)合的方法，進(jìn)行貝母類藥材的分析鑒別。

11 電噴霧質(zhì)譜法

韓鳳梅等例通過(guò)電噴霧離子阱質(zhì)譜法對(duì)五種貝母中貝母生物堿進(jìn)行分析，通過(guò)五種貝母對(duì)照藥材的總生物堿提取液的一級(jí)電噴霧質(zhì)譜圖譜可知，這五種貝母主要的分子峰和離子峰基本相同，但是相對(duì)豐度差異較大。其結(jié)果顯示五種貝母類藥材生物堿提取物的電噴霧質(zhì)譜圖譜特征性較強(qiáng)，并且它們的精密度和重現(xiàn)性也較好，所以可通過(guò)此方法對(duì)不同貝母類藥材進(jìn)行鑒別。

12 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)對(duì)近十年貝母類藥材的鑒別進(jìn)行歸納總結(jié)可以看出：貝母類藥材鑒別方法已經(jīng)從傳統(tǒng)的性狀鑒別向經(jīng)典的顯微鑒別發(fā)展，從現(xiàn)代的光譜、色譜理化鑒別技術(shù)向DNA條形碼和多態(tài)性分析等為特征的分子水平延伸。同時(shí)隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，SNP技術(shù)、ESTs技術(shù)、系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)和基因芯片技術(shù)能為貝母類藥材研究提供有力的幫助。因貝母類藥材分布廣泛，同時(shí)具有良好的藥用價(jià)值，市場(chǎng)的需求量大，所以建立完整的貝母類藥材鑒定，對(duì)該類藥材的市場(chǎng)監(jiān)管具有極其重要的意義。