亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        一種從羊奶中檢測牛奶和大豆成分多重實時熒光定量PCR方法的建立

        2016-05-14 20:39:48范陽陽張犖嘉劉艷艷卞如如霍勝楠張卉張全芳步迅
        山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年6期
        關(guān)鍵詞:羊奶豆?jié){牛奶

        范陽陽 張犖嘉 劉艷艷 卞如如 霍勝楠 張卉 張全芳 步迅

        摘要:羊奶制品因其良好的營養(yǎng)功效備受消費者的青睞,也是乳制品主要摻假對象。本研究參考市場可能摻假現(xiàn)狀,分別根據(jù)羊和牛線粒體基因組16S rRNA基因序列和大豆的KTi-S基因(GI:510514)序列,設(shè)計一對牛和羊特異性引物、一對大豆特異性引物以及相應(yīng)的TaqMan-MGB 探針,建立羊奶中牛奶和大豆成分多重實時熒光定量PCR檢測方法,并引入內(nèi)標(biāo)質(zhì)控有效保證檢測體系的準(zhǔn)確性。本檢測體系對羊奶、牛奶及豆?jié){的基因組DNA檢測敏感度為0.01 ng;對羊奶中摻入牛奶和豆?jié){的體積摻假檢測靈敏度均為0.1%。因此,本研究建立的羊奶中牛奶和大豆成分多重實時熒光定量PCR檢測體系具有通量大、靈敏度高、特異性好等優(yōu)點,實現(xiàn)了對羊奶中其他源性成分快速、準(zhǔn)確的檢測,對保障相關(guān)產(chǎn)品市場安全具有重要意義。

        關(guān)鍵詞:羊奶;牛奶;豆?jié){;多重實時熒光定量PCR

        中圖分類號:S879.1文獻標(biāo)識號:A文章編號:1001-4942(2016)06-0118-06

        由于羊奶中含有的維生素和微量元素均高于牛奶,并且含有大量的乳清蛋白,其所含有的蛋白結(jié)構(gòu)成分與母乳基本相同,被營養(yǎng)學(xué)界稱之為“奶中之王”[1]。羊奶中不含引起人體過敏的異性蛋白,尤其適合胃腸較弱、體質(zhì)較差的嬰幼兒飲用,但市場上的羊奶品質(zhì)參差不齊。隨著消費者認(rèn)可度的不斷提高,在利益的驅(qū)動下,在羊奶中摻入牛奶或者豆?jié){的現(xiàn)象非常普遍,摻假手段多種多樣,不斷變換,僅靠感官鑒評和傳統(tǒng)的試驗方法已不能滿足市場需要[2],嚴(yán)重影響我國奶業(yè)的健康發(fā)展。

        目前,用于檢測羊奶摻假的方法主要有氣象色譜、液相色譜、電泳、PCR、ELISA和近紅外光譜法等[3~6]。實時熒光定量PCR方法是以DNA為基礎(chǔ)的一種檢測技術(shù),不受摻假形式的影響,可以進行快速、批量、自動、實時檢測分析,具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點,已經(jīng)在動物源性成分檢測項目上逐步取代一般PCR方法成為最常用的分子生物學(xué)檢測手段[7]。為了保障羊乳及其產(chǎn)品品質(zhì),確保消費者的利益,建立準(zhǔn)確檢測牛羊乳及豆?jié){混摻的技術(shù)越來越重要。本試驗旨在利用TaqMan探針實時熒光定量PCR方法,建立一種快速、準(zhǔn)確檢測羊奶中是否摻有牛奶和豆?jié){的方法。

        1材料與方法

        1.1材料與試劑

        1.1.1試驗材料試驗所用標(biāo)準(zhǔn)液態(tài)牛奶、液態(tài)羊奶取自山東省畜牧研究所奶牛及山羊養(yǎng)殖基地,液態(tài)豆?jié){是本實驗室用大豆加工而成。市售樣品為購自濟南市大、中、小型超市的不同品牌奶制品。

        1.1.2主要試劑與儀器試劑:Chelex-100(天根生化科技有限公司,北京)、蛋白酶K(TaKaRa,日本)、核算定量檢測試劑盒(TaKaRa,日本)。

        儀器:ABI7500實時熒光定量PCR儀(ABI,美國)、高速冷凍離心機(Eppendorf,德國)、Nanodrop 核酸蛋白含量測定儀(Eppendorf,德國)。

        1.2試驗方法

        1.2.1樣品基因組DNA的提取分別取牛奶、羊奶、豆?jié){液體樣品2 mL加入2 mL無菌離心管中,2 500 r/min、4℃恒溫離心30 min,棄上清液保留沉淀;向離心管中加入1 mL無菌磷酸鉀緩沖液(pH 7.4),輕輕混勻后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,3 500 r/min室溫離心10 min,棄上清;向沉淀中分別加入280 μL 5%Chelex-100和20 μL 20 mg/mL蛋白酶K,56℃孵育30 min,漩渦震蕩10 s混合均勻,100℃煮沸8 min,13 000 r/min離心3 min;將上清加入吸附柱中13 000 r/min離心1 min收集液體;向收集液中加入20 μL GlassMilk 和600 μL gDNA Binding Buffer充分混勻,65℃水浴15 min(其間不斷輕柔地上下翻轉(zhuǎn)離心管),室溫放置5 min(其間不斷輕柔上下翻轉(zhuǎn)離心管);4 000 r/min離心1 min,棄上清;向離心管中加入500 μL 70%乙醇,8 000 r/min離心1 min,棄上清,重復(fù)2次;加入500 μL無水乙醇輕輕混勻,8 000 r/min離心1 min,棄上清;8 000 r/min離心30 s,用10 μL槍頭吸走殘余液體,室溫放置至徹底干燥;加入100 μL TE(pH 7.0)70℃水浴5 min,瞬間離心,轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中-20℃保存?zhèn)溆?。使用Nanodrop 核酸蛋白含量測定儀測定核酸濃度。

        1.2.2引物及探針設(shè)計分別參照牛、山羊和綿羊線粒體基因組中高度保守的16S rRNA基因序列和大豆的KTi-S基因(GI:510514)序列,用Primer Premier 5.0設(shè)計牛奶、羊奶通用引物序列(UF、UR),大豆引物序列(Lectin-F、Lectin-R),內(nèi)參引物序列(IACF、 IACR)。使用Beacon Designer 2.0 設(shè)計特異分子信標(biāo)(MB)探針,其中牛奶探針(NP)用CY3標(biāo)記,羊奶探針(YP)用JOE標(biāo)記,豆?jié){探針(LectinP)用FAM標(biāo)記,內(nèi)標(biāo)探針(IACP)用ROX標(biāo)記,3′端的淬滅基團用Dabcyl修飾。引物及探針序列見表1。

        1.2.3多重實時熒光定量PCR檢測體系建立通過優(yōu)化反應(yīng)體系中的引物濃度、探針濃度和退火溫度等條件,建立分別檢測羊、牛和大豆源性成分的單重?zé)晒舛縋CR體系。將4種引物及探針組合在一起,分別或同時以羊、牛和大豆基因組DNA為模板,優(yōu)化引物、探針濃度和退火溫度等反應(yīng)體系和條件,建立能同時檢測羊、牛和大豆源性成分的多重?zé)晒舛縋CR體系。

        1.2.4結(jié)果判定實時熒光定量PCR擴增結(jié)束后獲取Ct值,當(dāng)Ct值<35時,視為檢出動物源性成分;當(dāng)Ct值≥35時,視為未檢出動物源性成分。

        1.2.5基因組DNA檢測靈敏度試驗分別提取羊奶、牛奶及豆?jié){的基因組DNA,用Nanodrop定量到50 ng/μL,做10倍梯度稀釋(10-1、10-2、10-3、10-4),對每個梯度按照優(yōu)化后的擴增體系和條件分別進行檢測。

        1.2.6羊奶中摻雜牛奶或豆?jié){靈敏度試驗將豆?jié){和羊奶以一定體積比例混合,制成豆?jié){含量分別為0、0.1%、0.5%、1%、5%、10%和20%的混合奶樣品;將牛奶和羊奶以一定比例混合,制成牛奶含量分別為0、0.1%、0.5%、1%、5%、10%和20%的混合奶樣品。按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系和條件分別進行檢測。

        1.2.7市售樣本檢測使用優(yōu)化后的熒光定量PCR方法對35份奶制品樣本進行源性鑒定,驗證檢測方法的實用價值。

        2結(jié)果與分析

        2.1多重實時熒光定量PCR檢測體系的建立

        參照優(yōu)化的單重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系及條件,將羊、牛、大豆和內(nèi)標(biāo)質(zhì)控的引物及探針組合在一起,先分別以羊、牛和大豆基因組DNA為模板優(yōu)化反應(yīng)體系,然后同時加入3種基因組DNA模板,通過調(diào)整反應(yīng)體系中主要成分濃度和體積以及反應(yīng)條件,優(yōu)化反應(yīng)體系,最終篩選出最適宜的多重實時熒光定量PCR體系。20 μL反應(yīng)體系包括5× Premix 4 μL,HS-Taq酶(5 U/μL)0.2 μL,引物 Mix(2 μmol/L)2 μL, 探針 Mix(2 μmol/L)2 μL,內(nèi)標(biāo)質(zhì)控IAC DNA模板(1 ng/μL)2 μL,檢測樣品DNA 模板2 μL,雙蒸水7.8 μL。PCR反應(yīng)條件為:95℃、30 s;95℃、5 s,60℃、34 s,40個循環(huán),60℃延伸時收集熒光信號。圖1為多重實時熒光定量PCR擴增曲線圖,其中A圖同時檢測出羊和牛源性成分,大豆源性為陰性;B圖樣本中同時檢測出大豆和牛源性成分,羊源性成分為陰性。

        2.2基因組DNA靈敏度試驗

        結(jié)果(圖2)顯示,當(dāng)模板DNA濃度稀釋至10-4倍,即DNA質(zhì)量為0.01 ng時,所建立的熒光定量PCR檢測體系仍然能夠產(chǎn)生良好的特異擴增曲線。此時純羊奶、牛奶及豆?jié){模板檢測到的Ct值分別為33.64±0.02、34.80±0.018和34.87±0.03,均<35,因此確定本研究中多重實時熒光定量PCR體系模板DNA質(zhì)量檢測下限為0.01 ng。

        2.3羊奶中摻雜牛奶或豆?jié){靈敏度試驗

        將牛奶或豆?jié){以0.1%、0.5%、1%、5%、10%和20%的體積比摻入至純羊奶中,結(jié)果顯示當(dāng)牛奶或豆?jié){含量為0.1%時,多重實時熒光定量PCR體系仍有特異性擴增曲線,并且其Ct值均<35(圖3A、B),且隨著牛奶或豆?jié){摻入比例增加,Ct值越來越小。說明本研究建立的多重實時熒光定量PCR檢測體系對牛奶和豆?jié){的體積摻假檢測限為0.1%。

        2.4市售樣本的實際檢測

        利用本研究建立的羊奶中牛奶和大豆源性多重?zé)晒舛縋CR檢測體系對35份市售羊奶、羊奶粉、牛奶、牛奶粉進行源性鑒定。結(jié)果如表2所示,15份羊奶及相關(guān)制品中都含有羊源性成分,其中10份含有牛源性成分,4份含有大豆成分,分別占樣本總數(shù)的66%和26%;20份牛奶及相關(guān)制品中全部檢出牛源性成分,9份樣品中檢測出大豆成分,占樣本總數(shù)的45%。

        3討論與結(jié)論

        目前現(xiàn)有的牛羊乳檢測方法多是依據(jù)羊乳和牛乳化學(xué)組成上的差異,以牛羊乳中蛋白質(zhì)、脂肪、DNA、維生素等為特征指標(biāo)進行檢測[8]。色譜-質(zhì)譜結(jié)合技術(shù)是分離蛋白質(zhì)、定量檢測牛羊乳混摻的重要方法,有研究表明該方法可以實現(xiàn)牛羊乳混摻的快速檢測,能檢測牛羊混合乳中牛乳含量的最低水平為5%[9]。毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)技術(shù)也在牛羊乳檢測中得到了應(yīng)用[10],但存在檢測靈敏度偏低的缺點[11]。利用近紅外光譜法檢測摻假羊奶需要足夠的專業(yè)知識,建立模型才能對檢測結(jié)果進行分析,對檢測人員的要求較高,不易普及推廣[12]。熒光定量PCR方法是基于DNA水平的檢測,克服了以上技術(shù)的不足,被越來越多地應(yīng)用到奶制品的檢測中。由于核酸比蛋白質(zhì)更穩(wěn)定,抗熱能力更強,并且含有更多遺傳信息,所以基于DNA的動物源性檢測方法比蛋白免疫法更有優(yōu)勢[13]。

        曾少靈等用多重實時熒光定量PCR檢測牛、山羊和綿羊源性成分[14];孟芳等應(yīng)用熒光定量PCR方法僅能鑒別牛、羊奶[15];劉小艷等用實時熒光定量PCR方法檢測模擬奶制品中常見谷物成分的檢出限為0.5%[16]。本研究參照牛、山羊和綿羊線粒體基因組中高保守的16S rRNA基因和大豆的KTi-S基因為靶基因設(shè)計探針建立多重實時熒光定量PCR檢測方法,該方法不僅能夠針對羊奶、牛奶和豆?jié){進行快速準(zhǔn)確的鑒別,而且能對奶制品進行摻假檢測;在擴增循環(huán)內(nèi)只出現(xiàn)特異性擴增曲線無交叉擴增曲線;對純DNA含量的最低檢出濃度為0.01 ng;對模擬摻假的奶制品中目標(biāo)成分的最低檢出限為0.1%(V/V),說明本研究建立的多重實時熒光定量PCR方法具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點。經(jīng)實際市售奶制品檢測驗證了其可行性和適用性,適用于奶類樣品摻假的快速檢測。

        參考文獻:

        [1]焦凌梅, 袁唯. 改善山羊乳風(fēng)味的方法研究[J]. 中國乳業(yè), 2006(6):56-58.

        [2]蔣儒林, 張金麗. 關(guān)于原奶摻假提高脂肪和蛋白質(zhì)含量的檢測方法 [J]. 乳品加工,2005,10(5):37-39.

        [3]Chen R K, Chang L W, Chung Y Y, et al. Quantification of cow milk adulteration in goat milk using high-performance liquid chromatography with electrospray ionization mass spectrometry [J]. Rapid Commun. Mass Spectrom., 2004, 18(10): 1167-1171.

        [4]López-Calleja I M, González I, Fajardo V, et al. Application of an indirect ELISA and a PCR technique for detection of cow s milk in sheeps and goat, milk cheeses[J]. International Dairy Journal, 2007, 17(1): 87-93.

        [5]薛海燕,胡圍圍,宋宏新,等.羊乳中摻入牛奶的間接ELISA定量檢測[J].食品科學(xué),2010,31(24):370-373.

        [6]郭美蘭,孫正鵬,張超,等. 近紅外透反射光譜用于摻假牛奶的快速識別初探[J].化學(xué)界,2010(5):270-273.

        [7]劉旭輝,馬貴平,史喜菊,等.商品中動物源性成分檢測方法的研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2007,28(10):91-94.

        [8]張曉旭,葛武斌,李寶寶,等. 牛羊乳混摻檢測鑒別技術(shù)研究進展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報,2015,6(9):3594-3601.

        [9]Ferreira I M, Caote H. Detection and quantification of bovine, ovine and caprine milk percentages in protected denomination of origin cheeses by reversed-phase high-performance liquid chromatography of beta-lactoglobulins [J]. J. Chromatogr. A, 2003, 1015(1/2):111-118.

        [10]Mu~ller L, Barták P, BednrˇP, et al. Capillary electrophoresis-mass spectrometry-a fast and reliable tool for the monitoring of milk adulteration [J]. Electrophoresis, 2008, 29(10):2088-2093.

        [11]王寧,劉佳,李書文,等. 毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究進展[J]. 氨基酸和生物資源,2015,37(2):1-5.

        [12]李亮,丁武.摻有植物性填充物牛奶的近紅外光譜判別分析[J].光譜學(xué)與光譜分析,2010,30(5):1238-1242.

        [13]邵碧英,楊婕,張體銀. 動物產(chǎn)品的DNA提取方法[J] .畜牧與獸醫(yī),2005,37(9):47-49.

        [14]曾少靈,秦智鋒,花群義,等.多重實時熒光PCR檢測牛、山羊和綿羊源性成分[J].生物技術(shù)與方法,2009,25(1):139-146.

        [15]孟芳,張卿,蔡婧怡,等.熒光定量PCR方法鑒別牛、羊奶粉[J].檢驗檢疫學(xué)刊,2013,23(1):34-36.

        [16]劉小艷,付春玲,李培,等.實時熒光PCR法檢測奶制品中常見谷物成分[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2014,26(2):123-127.

        猜你喜歡
        羊奶豆?jié){牛奶
        真空結(jié)合加熱、冷凍濃縮羊奶理化品質(zhì)分析
        送牛奶
        炫彩牛奶畫
        樹上也能擠出“牛奶”嗎?
        豆?jié){俠(9)
        喝豆?jié){能不能補充雌激素
        豆?jié){俠(4)
        豆?jié){俠(2)
        神奇的牛奶樹
        打破“一牛獨大”格局,適時發(fā)展羊奶產(chǎn)業(yè)
        亚洲av无码专区亚洲av伊甸园| 精品无码国产自产拍在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷 | 免费无码毛片一区二区app| 中文在线√天堂| 亚洲精品国产品国语在线app| 日本japanese少妇高清| 亚洲另类精品无码专区| 青草热久精品视频在线观看| 亚洲地区一区二区三区| 亚洲伊人免费综合网站| 蜜桃视频网址在线观看| 熟女肥臀白浆一区二区| 天天爽夜夜爽夜夜爽精品视频| 国产欧美日韩综合精品一区二区| 国产亚洲av无码专区a∨麻豆| 91久久青青草原线免费| 精品国产一区二区三区久久女人| 亚洲国产综合性感三级自拍 | 无码人妻丝袜在线视频| 国产熟女乱综合一区二区三区| 人妻中文字幕在线中文字幕| 久爱www人成免费网站| 国产成人无码av在线播放dvd| 国产精品欧美久久久久老妞| 久草精品手机视频在线观看| 亚洲国产精品婷婷久久| 久久精品国产99国产精偷| 欧洲精品免费一区二区三区| 欧美午夜一区二区福利视频| 亚洲免费视频网站在线| 看国产亚洲美女黄色一级片 | 久久天天躁夜夜躁狠狠躁2022 | 国产熟女露脸大叫高潮| 在线不卡av天堂| 国产高清黄色在线观看91| 日本人妻伦理片在线观看| 麻豆精品国产av在线网址| 一本久道综合在线无码人妻| 国产日b视频| 蜜桃av在线播放视频|