張坤鵬 孫瑞紅 楊洪強(qiáng)

摘要：為明確山楂葉螨、二斑葉螨和蘋果全爪螨脅迫對(duì)富士蘋果葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及山楂葉螨脅迫對(duì)葉片游離脯氨酸含量的影響，利用透射電鏡觀察了上述3種害螨取食6 d 時(shí)葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，并采用酸性茚三酮法測(cè)定了游離脯氨酸含量。結(jié)果顯示，正常蘋果葉片細(xì)胞呈長(zhǎng)方形，大小相近，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器分布有序，細(xì)胞界限清晰；細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量較多，呈船形，緊貼細(xì)胞壁分布；細(xì)胞核呈長(zhǎng)橢圓形，核仁和核膜清晰可見；細(xì)胞膜和細(xì)胞壁完整，相鄰細(xì)胞壁界限明顯。葉片被害螨刺吸為害后，葉肉細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，細(xì)胞間隙增大，葉綠體和細(xì)胞核變形，葉綠體內(nèi)有淀粉粒出現(xiàn)，嚴(yán)重影響細(xì)胞功能。山楂葉螨為害后的細(xì)胞壁上出現(xiàn)針狀結(jié)晶沉淀物。山楂葉螨刺吸取食過(guò)程中，蘋果葉片內(nèi)游離脯氨酸含量隨受害時(shí)間延長(zhǎng)和螨口密度提高總體呈先升后降的趨勢(shì)。害螨為害可破壞蘋果葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞功能喪失，抗逆性物質(zhì)游離脯氨酸含量的升高表明蘋果葉片對(duì)山楂葉螨取食的對(duì)抗。

關(guān)鍵詞：富士蘋果；山楂葉螨；二斑葉螨；蘋果全爪螨；細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；游離脯氨酸

中圖分類號(hào)：S661.103.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）06-0036-06

山楂葉螨Tetranychus viennensis、二斑葉螨T. urticae和蘋果全爪螨Panonychus ulmi是為害蘋果葉片的3種重要害螨[1]，廣泛分布于我國(guó)各蘋果產(chǎn)區(qū)，造成葉片光合作用下降甚至提前落葉，抑制樹體生長(zhǎng)和花芽形成，給蘋果生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。

植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中常會(huì)遭遇不同逆境脅迫，逆境脅迫可分為生物、化學(xué)脅迫和物理脅迫3類，蟲害脅迫屬于典型的生物脅迫[2]。植物被刺吸性害蟲取食后，葉肉細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生生理、生化及形態(tài)結(jié)構(gòu)等一系列生物學(xué)變化。研究表明，褐飛虱Laodelphax striatellus為害水稻稻葉后，會(huì)引起葉片細(xì)胞質(zhì)壁分離、葉綠體異常發(fā)育、結(jié)構(gòu)松散，膜結(jié)構(gòu)最終溶解或斷裂[3，4]。梨網(wǎng)蝽Stephanitis nashi為害梨葉后，葉肉細(xì)胞中葉綠體膜被破壞，片層結(jié)構(gòu)排列松散，最終瓦解，個(gè)別細(xì)胞線粒體內(nèi)部嵴數(shù)目減少，基質(zhì)變稀薄，有些細(xì)胞葉綠體內(nèi)出現(xiàn)淀粉粒，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞凋亡，只剩殘片[5]。桔始葉螨Eotetranychus kankitus為害柑桔葉片后，導(dǎo)致葉片葉綠體膜缺損，淀粉粒異常膨大，基粒片層排列不規(guī)則，甚至消失，嗜鋨顆粒數(shù)目明顯增多[6]。朱砂葉螨T. cinnabarinus為害棉葉后，葉綠體膜逐漸溶解，基粒片層排列混亂，片層結(jié)構(gòu)消失，淀粉粒增多，有些細(xì)胞被完全破壞[7]。桑始葉螨Eotetranychus suginamensis為害桑葉后，葉綠體外被膜出現(xiàn)多處斷裂，基粒片層和基質(zhì)片層排列雜亂并產(chǎn)生較大空洞，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)致密顆粒和膜狀物[8]。

植物體內(nèi)游離脯氨酸含量常作為評(píng)價(jià)植物抗逆性高低的一項(xiàng)生理指標(biāo)。菜豆葉片游離脯氨酸含量隨二斑葉螨為害時(shí)間延長(zhǎng)明顯增加[9]。番茄刺皮癭螨Aculops lycopersici為害后，番茄葉片游離脯氨酸含量急劇升高，并且隨為害時(shí)間延長(zhǎng)和接螨量增加而持續(xù)上升[10]。梨癭螨Eriophyes pyri和梨葉銹癭螨Epitrimerus pyri為害后，梨樹葉片游離脯氨酸含量明顯上升，并隨受害程度逐漸加重。游離脯氨酸含量升高主要集中在為害部位，同時(shí)也會(huì)引起受害部位周圍組織游離脯氨酸含量上升[11]。梨葉銹癭螨取食蘋果梨葉片引起的游離脯氨酸含量的變化與竇彩虹的研究結(jié)果相似[12]。臭椿被太行癭螨Aculops taihangensis為害后，葉片內(nèi)游離脯氨酸含量增加，反映出臭椿對(duì)太行癭螨的抵抗，但螨口數(shù)量的增長(zhǎng)會(huì)終止游離脯氨酸含量上升[13]。梅下毛癭螨Acalitus phloeocoptes為害杏樹嫩芽后，受害芽的游離脯氨酸含量最高上升69.44%[14]。

目前，關(guān)于蘋果葉片受到害螨為害后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及游離脯氨酸含量變化的研究尚未見報(bào)道。為此，本研究進(jìn)行了這方面的試驗(yàn)，旨在為研究富士蘋果對(duì)害螨為害的響應(yīng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試樹網(wǎng)室內(nèi)的盆栽蘋果樹，品種為短枝富士，樹齡3年。

1.1.2供試螨山楂葉螨、二斑葉螨和蘋果全爪螨均采自山東省泰安市郊區(qū)蘋果園。然后連續(xù)飼養(yǎng)于室內(nèi)盆栽海棠苗上，養(yǎng)蟲室條件為溫度（26±1）℃，相對(duì)濕度（60±10）%，光周期12 L∶12 D。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察選擇健康盆栽蘋果苗，按10頭/葉的螨口密度分別將上述3種害螨的雌成螨接到不同植株的成熟葉片上，在葉柄處涂抹凡士林防止螨逃逸，每種害螨接2株樹，重復(fù)3次，空白對(duì)照不接螨。

接螨6 d時(shí)，分別剪取處理葉片及對(duì)照葉片。在葉片葉螨刺吸點(diǎn)處切取0.5 mm2小塊，迅速置于4%戊二醛溶液中進(jìn)行固定。用注射器抽氣3次，固定后用pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液漂洗，然后用1%鋨酸固定，再用乙醇-丙醇梯度脫水。之后用Epon 812環(huán)氧樹脂滲透包埋，使用LKB-5型超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，置于JEM-1200EX型透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.2.2游離脯氨酸含量測(cè)定分別將山楂葉螨雌成螨按10、20、30 頭/葉3個(gè)螨口密度接到不同植株的成熟葉片上，每處理4株，重復(fù)3次，葉柄處涂抹凡士林防止螨逃逸。以不接螨處理做空白對(duì)照。分別在為害6、8、10 d時(shí)摘取各處理葉片，于-24℃低溫保存。

酸性茚三酮試劑：稱取茚三酮2.5 g，加入冰乙酸60 mL和6 mol/L磷酸40 mL，于70℃加熱溶解，冷卻后儲(chǔ)于棕色試劑瓶中，冰箱內(nèi)4℃保存。

稱取10 mg脯氨酸溶于少量80%乙醇溶液內(nèi)，蒸餾水定容至100 mL，濃度為100 μg/mL。分別吸取0、0.5、1.25、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0 mL放入50 mL容量瓶?jī)?nèi)，蒸餾水定容，配成0、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取各標(biāo)準(zhǔn)液2 mL、冰乙酸2 mL、茚三酮試劑2 mL放入10 mL帶塞刻度試管內(nèi)，在沸水中放置15 min，取出后于520 nm光波處測(cè)定吸光值。以脯氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取蘋果葉片0.3 g，剪碎，加入適量80%乙醇液和少量石英砂研磨成漿，轉(zhuǎn)移至10 mL帶塞刻度試管內(nèi)，用80%乙醇液洗滌殘?jiān)?，定容?0 mL，80℃水浴提取20 min。提取液中加入1勺人造沸石和適量活性炭，強(qiáng)烈振蕩5 min以去除干擾的氨基酸，過(guò)濾。

按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法對(duì)試樣進(jìn)行測(cè)定，每處理重復(fù)測(cè)定3次，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線和游離脯氨酸含量計(jì)算公式計(jì)算游離脯氨酸含量，用Duncans新復(fù)極差檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性分析。

脯氨酸含量（μg/gFW）=X×VFW

式中，X為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)線算得的樣品濃度值（μg/mL），V為樣品液總體積（mL），F(xiàn)W為樣品鮮重（g）。

2結(jié)果與分析

2.1蘋果葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

2.1.1正常葉片的細(xì)胞學(xué)特征正常蘋果葉片表皮和葉肉細(xì)胞呈長(zhǎng)方形，大小相近，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器分布有序，細(xì)胞間隙明顯。細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量較多，呈船形，緊貼細(xì)胞壁分布。細(xì)胞核呈長(zhǎng)橢圓形，核仁和核膜清晰可見。細(xì)胞膜和細(xì)胞壁完整，相鄰細(xì)胞壁界限明顯（圖1）。

2.1.2山楂葉螨為害葉片的細(xì)胞學(xué)特征山楂葉螨刺吸為害蘋果葉片6 d，葉肉細(xì)胞嚴(yán)重變形，細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞器散亂于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)容物溢出，有些細(xì)胞僅在細(xì)胞壁周圍殘存一些碎屑，幾乎成為空胞（圖2A、E）。葉綠體內(nèi)出現(xiàn)淀粉粒，腫脹趨于圓球狀，甚至葉綠體膜消失，葉綠體溶解散亂在細(xì)胞質(zhì)中（圖2A、B）。細(xì)胞核被其他細(xì)胞器擠壓變形，細(xì)胞膜逐漸消失，細(xì)胞核解體（圖2C）。細(xì)胞壁分解斷裂，相鄰細(xì)胞壁界限逐漸模糊，最終消失形成空胞（圖2B、C、D、E），甚至緊鄰柵欄組織的上表皮細(xì)胞壁也分解斷裂（圖2D），有些細(xì)胞壁上附著針狀結(jié)晶沉淀物（圖2F）。

2.1.3二斑葉螨為害葉片的細(xì)胞學(xué)特征二斑葉螨為害6 d，蘋果葉片細(xì)胞受到不同程度破壞，細(xì)胞質(zhì)減少，細(xì)胞間隙增大，葉綠體縮短膨脹變形，葉綠體中可見大量淀粉粒存在，細(xì)胞核核膜界限不清（圖3A），受害嚴(yán)重的細(xì)胞幾乎完全被破壞，細(xì)胞器降解甚至消失，細(xì)胞壁溶解斷裂，彎曲變形，細(xì)胞器殘?jiān)庖绲郊?xì)胞間隙內(nèi)（圖3A、B、C）。

2.1.4蘋果全爪螨為害葉片的細(xì)胞學(xué)特征蘋果全爪螨為害6 d，蘋果葉肉細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大變化，葉綠體由長(zhǎng)橢圓形變?yōu)榻鼒A形，其內(nèi)有淀粉粒沉積，受害嚴(yán)重的細(xì)胞結(jié)構(gòu)幾乎完全被破壞，細(xì)胞器只剩殘?jiān)蛳?，只剩?xì)胞壁殘余框架（圖4A）。細(xì)胞壁界限趨于模糊，細(xì)胞器殘余物從細(xì)胞壁缺口處溢出細(xì)胞（圖4B、C）。

2.2葉片內(nèi)游離脯氨酸含量變化

2.2.1游離脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線經(jīng)過(guò)Microsoft Excel分析確定，脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為Y=0.0365X-0.0237，R2=0.9964。其中Y為520 nm的吸光值，X為脯氨酸濃度（μg/mL）。

2.2.2山楂葉螨為害對(duì)蘋果葉片游離脯氨酸含量的影響從表1可知，與對(duì)照葉片相比，在山楂葉螨為害期內(nèi)，蘋果葉片中的游離脯氨酸含量發(fā)生明顯變化。為害6 d時(shí)，受害葉片內(nèi)游離脯氨酸含量隨螨口密度的增加而上升，顯著高于對(duì)照的游離脯氨酸含量。但為害8、10 d時(shí)，脯氨酸含量隨螨口密度的增加而降低。

山楂葉螨螨口密度較低時(shí)（10 頭/葉），葉片中游離脯氨酸含量隨為害時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)升高，為害10 d的含量最高，是對(duì)照葉片含量的1.79倍。隨著螨口密度的增加，游離脯氨酸含量隨為害時(shí)間延長(zhǎng)下降，為害8、10 d時(shí)，30 頭/葉含量低于對(duì)照葉片。

3討論與結(jié)論

葉螨為害可對(duì)植物產(chǎn)生諸多影響，如葉綠素含量[15，16]，糖類和礦物質(zhì)元素含量[15，17，18]，蛋白質(zhì)、氨基酸含量[9，17]，抗氧化酶活性[9，19]，蛋白酶抑制劑活性[20，21]，光合作用、蒸騰作用[15，22，23]等變化明顯，同時(shí)，葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生顯著變化[3，8]。葉綠體是植物完成光合作用的場(chǎng)所，其結(jié)構(gòu)完整是保證光合作用正常進(jìn)行的前提，而其對(duì)逆境脅迫比較敏感[24，25]。本研究結(jié)果表明，富士蘋果葉片葉肉細(xì)胞對(duì)3種害螨脅迫反應(yīng)敏感的細(xì)胞器均為葉綠體，受害后的葉綠體形狀發(fā)生改變，排列趨于混亂，內(nèi)部結(jié)構(gòu)被損壞。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，葉綠體是植物細(xì)胞中產(chǎn)生活性氧的重要場(chǎng)所之一[26]。在害螨脅迫下，植物會(huì)產(chǎn)生過(guò)多活性氧，造成細(xì)胞水平的氧傷害，葉綠體、線粒體等細(xì)胞器功能損害，DNA等其他生物大分子降解和失活，最終誘發(fā)細(xì)胞過(guò)敏性壞死[19，27]。

植物細(xì)胞內(nèi)的淀粉粒由光合作用產(chǎn)生，其運(yùn)輸一般以蔗糖-Pi形式進(jìn)行[28]。隨著害螨對(duì)葉肉細(xì)胞膜系統(tǒng)的破壞，光合作用產(chǎn)物輸送受阻，導(dǎo)致在葉綠體中積累大量淀粉粒。本研究在對(duì)山楂葉螨為害的富士蘋果葉片細(xì)胞進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察時(shí)，發(fā)現(xiàn)針狀結(jié)晶沉淀物，該類物質(zhì)可能在抵抗山楂葉螨刺吸脅迫中具有重要作用，是富士蘋果對(duì)山楂葉螨為害防衛(wèi)機(jī)制的一種表現(xiàn)形式。

游離脯氨酸作為植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，其含量高低與植物抗逆能力有關(guān)[29]。葉片中的游離脯氨酸含量與其相對(duì)含水量呈明顯負(fù)相關(guān)[30]，其含量的增加是引起滲透勢(shì)下降的一個(gè)關(guān)鍵因素，有助于細(xì)胞或組織保持水分，維持蛋白質(zhì)、膜和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。湯章城[31]和Hare等[32]研究顯示，逆境下植物體內(nèi)游離脯氨酸含量往往會(huì)升高。山楂葉螨為害初期，蘋果葉片細(xì)胞沒有受到嚴(yán)重破壞，會(huì)通過(guò)產(chǎn)生游離脯氨酸對(duì)抗葉螨，故葉片內(nèi)的游離脯氨酸含量上升，這也說(shuō)明蘋果葉片能夠通過(guò)游離脯氨酸的累積避免細(xì)胞受到滲透脅迫的傷害。隨著山楂葉螨數(shù)量增加和為害程度加重，當(dāng)超過(guò)蘋果葉片所承受的范圍時(shí)，蘋果葉片滲透調(diào)節(jié)機(jī)制失效，游離脯氨酸含量下降，甚至低于對(duì)照。

本研究只做了3種蘋果害螨在10 頭/葉下為害6 d對(duì)富士蘋果葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，不同為害時(shí)間及不同蘋果品種在不同葉螨為害下的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化情況仍待進(jìn)一步研究。前人研究發(fā)現(xiàn)脯氨酸能夠參與植物葉綠素合成[31]，其含量的變化是否有利于蘋果葉片通過(guò)光合作用對(duì)螨害進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)償值得進(jìn)一步研究。

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