任平平 馬安峰 程斐 孫朝輝 高建偉

摘要：大白菜根腫病是一種嚴(yán)重影響大白菜生長的土傳病害，已成為大白菜的重要病害之一。CRb基因是抗大白菜根腫病的重要基因。本研究對(duì)已發(fā)表的6個(gè)CRb分子標(biāo)記進(jìn)行篩選，獲得1個(gè)與CRb緊密連鎖的共顯性標(biāo)記TCR05。該標(biāo)記在抗病純和材料中產(chǎn)生279 bp的PCR擴(kuò)增片段，在感病材料中產(chǎn)生250 bp的PCR片段，在抗病雜合材料中同時(shí)產(chǎn)生279 bp和250 bp的PCR片段。利用TCR05對(duì)24份育種材料進(jìn)行篩選，均含CRb基因，其中8份為純合體，16份為雜合體，篩選結(jié)果與田間鑒定結(jié)果基本一致。

關(guān)鍵詞：大白菜；根腫??；CRb；分子標(biāo)記；種質(zhì)資源

中圖分類號(hào)：S634.102.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）06-0007-04

大白菜是原產(chǎn)于中國的重要蔬菜作物。大白菜根腫病是由蕓薹根腫菌侵染所致的一種土傳性病害[1]。根腫菌自大白菜根毛侵入細(xì)胞內(nèi)，從根部皮層進(jìn)入形成層，根部薄壁細(xì)胞受刺激而加速分裂，導(dǎo)致根部長出腫瘤，植株萎蔫死亡[2]。迄今，至少有8個(gè)大白菜抗根腫病基因得到定位，分別是Crr1、Crr2、Crr3、Crr4、CRa、CRb、CRc和 CRk[3～7]。其中，CRb對(duì)根腫菌生理小種2、4和8均具有良好抗性，并表現(xiàn)為單基因顯性遺傳特性[6]。本研究對(duì)已發(fā)表的6個(gè)CRb標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)24份抗性種質(zhì)資源進(jìn)行分析，以期在大白菜抗根腫病育種中對(duì)CRb基因的跟蹤和提供抗性種質(zhì)資源提供支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供篩選與基因CRb緊密連鎖標(biāo)記的試材為抗根腫病大白菜自交系YH-036、感根腫病自交系冠291以及兩者的雜交組合。

供篩選種質(zhì)資源共24個(gè)（表1），其中BCYM-1～BCYM-4和ZY-1～ZY-4為8個(gè)抗根腫病大白菜自交系，其他16個(gè)為日本和韓國種子公司正在測(cè)試尚未推廣的新品種。每個(gè)自交系和品種選取最優(yōu)良的單株進(jìn)行測(cè)試。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1抗根腫病基因CRb分子標(biāo)記供試引物及其序列供篩選的與基因CRb緊密連鎖的6對(duì)引物及其序列見表2。

1.2.2DNA提取及PCR擴(kuò)增利用改良CTAB法提取大白菜基因組DNA[8]。用于PCR反應(yīng)的試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

PCR反應(yīng)總體積為20 μL：在96孔的PCR板中分別加入PCR Master Mix（2×） 10 μL，上游引物和下游引物（10 U）各1 μL，50 ng/μL的模板DNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性0.5 min，62℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃重延伸10 min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電壓5 V/cm條件下電泳1 h，用Goodview染色，Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)成像，觀察并保留結(jié)果。

1.2.3分子標(biāo)記篩選分別取YH-036、冠291和其雜交組合各16株用6對(duì)候選引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和分析，篩選出最佳的分子標(biāo)記。

1.2.4大白菜種質(zhì)資源PCR鑒定利用篩選的分子標(biāo)記對(duì)24份大白菜種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定分析。

1.2.5大白菜種質(zhì)資源抗病性調(diào)查大白菜種子催芽后播種于50孔穴盤，穴盤中所用基質(zhì)均經(jīng)過高溫滅菌，放置在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每份大白菜種質(zhì)資源設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6株，隨機(jī)排列。

將高感根腫病病株的病根清洗干凈后稱重，加入適量的水，用粉碎機(jī)磨碎至勻漿與滅菌基質(zhì)混合，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)使?jié)舛冗_(dá)到2×108個(gè)孢子/g基質(zhì)，并將土壤pH值調(diào)整至5.5左右，為病菌發(fā)病營造良好條件。

待大白菜苗長至3～4片真葉時(shí)移栽至加入菌土的營養(yǎng)缽中，保持基質(zhì)濕度60%左右，置于25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40天后，對(duì)植株進(jìn)行抗病性調(diào)查。將植株取出后，洗凈根部泥土，調(diào)查記錄抗病性。主根和側(cè)根或須根都無腫瘤記為抗病，只要在主根、側(cè)根或須根出現(xiàn)腫瘤，不分大小均記為感病。

2結(jié)果與分析

2.1分子標(biāo)記篩選

6對(duì)候選引物對(duì)大白菜抗、感病自交系及其雜交組合的PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，只有TCR01和TCR05能擴(kuò)增出鑒定大白菜抗根腫病基因CRb呈陽性或隱性的共顯性特異性條帶。其中TCR05在抗病自交系YH-036中擴(kuò)增出一條279 bp的PCR片段，在感病自交系冠291中擴(kuò)增出一條250 bp的PCR片段，在其雜交組合中擴(kuò)增出與其親本對(duì)應(yīng)的兩條條帶（圖1），與文獻(xiàn)[6]報(bào)道一致，且在多次重復(fù)試驗(yàn)中表現(xiàn)穩(wěn)定。因此，TCR05可以作為鑒定大白菜抗根腫病基因CRb呈陽性或隱性的理想分子標(biāo)記。

2.2大白菜種質(zhì)資源PCR鑒定

利用分子標(biāo)記TCR05對(duì)24份大白菜種質(zhì)資源CRb基因進(jìn)行鑒定分析（表3）。如圖2所示，TCR05在24份大白菜資源中均能擴(kuò)增出PCR片段，其中1～8號(hào)種質(zhì)資源均只擴(kuò)增出一條279 bp的抗病片段，鑒定為CRb/CRb純合的種質(zhì)資源；其他16份材料中均分別擴(kuò)增出279 bp的抗病片段和250 bp的感病片段，鑒定為CRb/crb雜合的種質(zhì)資源。

2.3大白菜種質(zhì)資源抗病性鑒定結(jié)果

供試的24份大白菜種質(zhì)資源總體表現(xiàn)為抗根腫病，但11、18、24號(hào)種質(zhì)資源中個(gè)別單株出現(xiàn)了腫瘤。其中，11號(hào)供試材料的側(cè)根共出現(xiàn)3個(gè)直徑5 mm左右的腫瘤，地上部病癥表現(xiàn)不明顯；18號(hào)供試大白菜資源的主根共出現(xiàn)5個(gè)3 mm左右的腫瘤，地上部表現(xiàn)出失水萎蔫現(xiàn)象；24號(hào)僅在須根部位出現(xiàn)細(xì)微突起，地上部植株生長無明顯影響（表4）。

3討論與結(jié)論

根腫病最早于1737年在英國地中海西岸和歐洲南部發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已成為一種世界性病害[9]。近年來，我國大白菜根腫病發(fā)病范圍迅猛擴(kuò)大，面積急劇增加，造成大白菜產(chǎn)量和品質(zhì)大幅度降低，已成為大白菜主要病害之一。生產(chǎn)實(shí)踐證明，栽培措施和化學(xué)、生物等防治方法不僅效果甚微而且化學(xué)防治污染環(huán)境[10]，選育抗根腫病大白菜新品種是一條有效、經(jīng)濟(jì)和環(huán)保的途徑[11]。源于歐洲蕪菁的多個(gè)抗病基因已成功導(dǎo)入到大白菜種質(zhì)中，但目前大白菜根腫病的抗性檢測(cè)主要采用人工接種鑒定方法，接種效果受外界環(huán)境的影響大、效率低，不能鑒定抗性基因的類型[12]。因此，育種中急需運(yùn)用分子標(biāo)記輔助育種方法彌補(bǔ)人工接種的缺陷。本研究篩選出一個(gè)與抗病基因CRb緊密連鎖的SCAR標(biāo)記TCR05，具有結(jié)果穩(wěn)定可靠、操作簡便、效率高、可鑒別雜合子和純合子等優(yōu)點(diǎn)，可有效用于今后抗根腫病大白菜育種工作中。

Piao等（2004）[6]利用韓國和日本的10個(gè)感病品種和37個(gè)抗病品種對(duì)CRb位點(diǎn)開發(fā)分子標(biāo)記，在抗病品種中有18個(gè)品種含有TCR01和TCR05標(biāo)記，在感病品種中均未擴(kuò)增到這2個(gè)標(biāo)記。本研究利用TCR05對(duì)源于日本和韓國的24份較新抗根腫病種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定，均鑒定出抗病基因CRb的存在，說明抗病基因CRb在國外抗根腫病大白菜品種中已得到廣泛采用，應(yīng)引起我國育種工作者的重視。

本研究人工接種試驗(yàn)證明，含有雜合基因CRb的大白菜種質(zhì)資源11、18、24號(hào)表現(xiàn)出不同程度的感病性，而其他21份種質(zhì)資源均表現(xiàn)為抗根腫病，與分子標(biāo)記的結(jié)果不完全一致。迄今為止，對(duì)于大白菜抗根腫病基因的類別、效應(yīng)方式、基因間相互作用等研究不夠深入，目前已發(fā)現(xiàn)的8個(gè)與根腫病抗性有關(guān)的基因位點(diǎn)分別是Crr1、Crr2、Crr3、Crr4、CRa、CRb、CRc和 CRk，其中，Crr3、CRa、CRb、CRk均位于染色體A03上，Crr1、Crr2和Crr4分別位于染色體A08、A01和A06上，CRc位于染色體A02上。從大白菜種質(zhì)資源11、18、24號(hào)表現(xiàn)出不同程度的感病性來分析，基因CRb對(duì)根腫病的抗性可能與其它抗病性基因有關(guān)聯(lián)，存在加性效應(yīng)等基因互作效應(yīng)，這一假設(shè)值得進(jìn)一步驗(yàn)證，以期為今后抗病育種提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]

楊永林.十字花科蔬菜根腫病抑菌型土壤初探[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1990， 17（2）：127-131.

[2]楊佩文，尚慧，董麗英，等.大白菜根腫病發(fā)病因素分析與防治技術(shù)[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，22（3）：663-666.

[3]Suwabe K， Tsukazaki H， Iketani H， et al. Identification of two loci for resistance to clubroot （Plasmodiophora brassicae Woronin） in Brassica rapa L. [J]. Theor. Appl. Genet.， 2003，107：997-1002.

[4]Suwabe K， Tsukazaki H， Iketani H， et al. Simple sequence repeat-based comparative genomics between Brassica rapa and Arabidopsis thaliana： the genetic origin of clubroot resistance[J]. Genetics，2006，173：309-319.

[5]Hirai M， Harada T， Kubo N，et al. A novel locus for clubroot resistance in Brassica rapa and its linkage markers[J]. Theor. Appl. Genet.， 2004，108：639-643.

[6]Piao Z Y， Deng Y Q， Choi S R， et al. SCAR and CAPS mapping of CRb， a gene conferring resistance to Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage （Brassica rapa ssp. pekinensis）[J]. Theor. Appl. Genet.， 2004， 108（8）：1458-1465.

[7]Sakamoto K， Saito A， Hayashida N， et al. Mapping of isolate-specific QTLs for clubroot resistance in Chinese cabbage （Brassica rapa L. ssp. pekinensis） [J].Theor. Appl. Genet.， 2008，117：759-767.

[8]Wang X W，Lou P，Bonnema G，et al. Linkage mapping of a dominant male sterility gene Ms-cd1 in Brassica oleracea[J].Genome，2005， 48：848-854.

[9]沈向群，聶凱，吳瓊，等.大白菜根腫病主要生理小種種群分化鑒定初報(bào)[J].中國蔬菜，2009（8）：59-62.

[10]黃云.植物病害生物防治學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2010：291-292.

[11]張慧.不結(jié)球白菜抗根腫病材料創(chuàng)制、抗性遺傳及分子標(biāo)記研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[12]李巧云，張志剛，趙智中，等.大白菜抗根腫病分子標(biāo)記研究進(jìn)展[C]//中國園藝學(xué)會(huì)十字花科蔬菜分會(huì)第十屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.2012：21-29.