靳志飛　陳紅

摘要：以果梅果實(shí)為原料，利用響應(yīng)面法確定其有機(jī)酸的超聲輔助提取最佳工藝條件。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比、超聲頻率為自變量，有機(jī)酸提取量為響應(yīng)值，使用中心組合（Box-Behnken）試驗(yàn)設(shè)計(jì)對各個(gè)因素的顯著性和交互作用進(jìn)行分析。結(jié)果表明，果梅果實(shí)有機(jī)酸的最佳提取工藝為超聲溫度36℃、超聲時(shí)間30min、料液比1：19（mL/g）、超聲功率59kHz、提取次數(shù)2次。在此條件下有機(jī)酸提取量的預(yù)測值為6.40%，實(shí)測值為6.24%，兩者較接近。表明BoxBehnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法可以優(yōu)化果梅果實(shí)有機(jī)酸的超聲輔助提取工藝。

關(guān)鍵詞：果梅果實(shí)；超聲輔助提取；有機(jī)酸；響應(yīng)面法；工藝優(yōu)化

果梅（Prunus mume Sieb.et Zucc），俗稱酸梅或青梅，原產(chǎn)于中國，為薔薇科李屬多年生落葉喬木，果實(shí)富含多種營養(yǎng)保健成分，是一種藥食兼用型水果，其中最主要的營養(yǎng)成分為天然優(yōu)質(zhì)有機(jī)酸，如檸檬酸、蘋果酸、兒茶酸、酒石酸、琥珀酸、丙酮酸等。有機(jī)酸在人體代謝中具抑菌、抗病毒、增加冠脈流量、抑制腦組織脂質(zhì)過氧化物生成、抗突變等生理功能，且具有良好的保健和藥用價(jià)值。因此，進(jìn)一步開發(fā)利用果梅果實(shí)有機(jī)酸并對其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化具有重要意義。近年來，以青梅汁為原料的飲料深受消費(fèi)者喜愛，從果實(shí)中分離、提取、濃縮出有機(jī)酸成分，加工成天然梅汁和調(diào)味品已成為國內(nèi)外消費(fèi)者需求的新動向。

目前，超聲提取已廣泛地應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取，超聲輔助提取具有高效、節(jié)能、省時(shí)的特點(diǎn)。利用超聲產(chǎn)生的熱效應(yīng)、機(jī)械作用和空化效應(yīng)造成植物細(xì)胞壁破裂，加快胞內(nèi)含物的釋放、擴(kuò)散和溶解，大大縮短了提取時(shí)間，提高了提取效率。因此，合理優(yōu)化超聲提取果梅果實(shí)中的有機(jī)酸含量，不僅可以最大化提取有機(jī)酸含量而且還提高了果梅的利用價(jià)值。但是目前，有機(jī)酸的提取工藝普遍采用傳統(tǒng)的提取方法，時(shí)間較長、溫度較高，限制了有機(jī)酸的開發(fā)利用。因此，本研究采用響應(yīng)面法對超聲輔助提取果梅果實(shí)中的有機(jī)酸工藝條件進(jìn)行研究，以期為進(jìn)一步開發(fā)利用果梅有機(jī)酸提供試驗(yàn)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1材料

果梅，采自茂蘭國家級自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的洞塘鄉(xiāng)：氫氧化鈉、酚酞（1%）、鄰苯二甲酸氫鉀均為分析純。

SK8210LHC型超聲波清洗儀，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；JJ-2型組織搗碎勻漿機(jī)、HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市榮華儀器制造有限公司：CPl53型電子天平，美國奧豪斯公司：ThermoD-37520型高速冷凍離心機(jī)，德國Heraeus公司：Milli-Q型超純水系列，美國密理博公司。

1.2方法

1.2.1樣品制備 在同一地點(diǎn)選擇樹齡相同、長勢一致的果梅樹5棵，取樣時(shí)盡可能地避免外界環(huán)境條件的影響，隨機(jī)選取樹冠外圍中部不同方位、大小均勻、無病蟲害的果實(shí)，每株10-20個(gè)果實(shí)，采后迅速放入采樣裝置中帶回實(shí)驗(yàn)室。清水洗凈，自然晾干，去皮后用組織搗碎勻漿機(jī)打漿，備用。隨機(jī)稱取1，00 g左右的果漿，按一定的料液比加入適量的去離子水，在超聲輔助條件下進(jìn)行提取、過濾，濾液稀釋定容，即得樣液待測。

1.2.2可滴定酸的測定方法 根據(jù)酸堿中和原理，以酚酞作指示劑，用移液管吸取定容至50 mL的待測液25 mL于250 mL錐形瓶中，加1%酚酞指示劑2滴，用已標(biāo)定的NaOH溶液進(jìn)行滴定。滴定至溶液初顯粉紅色并在0.5 min內(nèi)不褪色時(shí)為終點(diǎn)（pH 8.1～8.3），記錄NaOH滴定液用量，根據(jù)消耗的標(biāo)定堿液量求出樣品中可滴定酸的百分含量。以檸檬酸作為其換算系數(shù)即0.064，3次重復(fù)，以去離子水為空白對照，依據(jù)下面的公式計(jì)算果梅果實(shí)中有機(jī)酸含量。

1.2.3單因素試驗(yàn)

1）超聲時(shí)間對有機(jī)酸提取量的影響：以去離子水為提取溶劑，在料液比1：10（g：mL，下同）、超聲溫度30℃、超聲功率50 kHz，提取次數(shù)2次的條件下，分別超聲提取10、20、30、40、50和60 min，考察不同超聲時(shí)間對有機(jī)酸提取量的影響。

2）超聲溫度對有機(jī)酸提取量的影響：以去離子水為提取溶劑，在料液比1：10，超聲時(shí)間30 min，超聲功率50 kHz，提取次數(shù)為2的條件下，分別選擇25、35、45、55、65和75℃的溫度進(jìn)行提取，然后考察不同超聲溫度對有機(jī)酸提取量的影響。

3）料液比對有機(jī)酸提取量的影響：以去離子水為提取溶劑，在超聲溫度35℃，超聲時(shí)間30min，超聲功率50 kHz，提取次數(shù)2次的條件下，分別選擇料液比為1：5、1：10、1：15、1：20、1：25和1：30進(jìn)行提取，然后考察不同料液比對有機(jī)酸提取量的影響。

4）超聲功率對有機(jī)酸提取量的影響：以去離子水為提取溶劑，在料液比1：10、超聲溫度35℃、超聲時(shí)間30 min、提取次數(shù)2次的條件下，研究超聲功率為40、50、60、70、80和90 kHz對果梅果實(shí)有機(jī)酸提取效果的影響。

5）提取次數(shù)對有機(jī)酸提取量的影響：以去離子水為提取溶劑，在料液比1：10、超聲溫度35℃、超聲時(shí)間30 min、超聲功率50 kHz的條件下分別提取1、2、3和4次，然后測定有機(jī)酸含量。

1，2，4響應(yīng)面法試驗(yàn) 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取料液比、超聲功率、超聲溫度及超聲時(shí)間為自變量，果梅果實(shí)提取有機(jī)酸的含量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其因素與水平見表1。通過Design Expert 8.06軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測果梅果實(shí)有機(jī)酸提取的最優(yōu)工藝。

1.3數(shù)據(jù)分析方法

利用Excel 2003程序和Design Expert 8.06軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2.結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1超聲時(shí)間對有機(jī)酸提取量的影響 由圖1可知，隨著超聲提取時(shí)間的延長，果梅果實(shí)有機(jī)酸提取量逐漸增加，當(dāng)超聲提取時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，提取量最大，之后隨超聲提取時(shí)間的延長，有機(jī)酸的提取量反而降低?？赡苁情L時(shí)間的超聲處理，揮發(fā)性有機(jī)酸的含量不斷減少。另外超聲時(shí)間越長，耗費(fèi)的能量越多，故超聲時(shí)間以30 min為宜。

2.1.2超聲溫度對有機(jī)酸提取量的影響 由圖2可知，隨著超聲溫度的不斷增加，果梅果實(shí)有機(jī)酸提取量呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)超聲溫度小于35℃時(shí)，果實(shí)有機(jī)酸提取量隨著超聲溫度的升高而增加，當(dāng)超聲溫度高于35℃時(shí)，果實(shí)有機(jī)酸隨著超聲溫度的繼續(xù)增加而下降。這可能是由于溫度高和機(jī)械波的作用造成某些熱敏感有機(jī)酸的損失。因此，選擇超聲溫度35℃為宜。

2.1.3料液比對有機(jī)酸提取量的影響 由圖3可知，果梅果實(shí)有機(jī)酸提取量隨料液比的變化而變化，當(dāng)料液比在1：5-1：20之間時(shí)，有機(jī)酸的提取量呈增加趨勢；料液比為1：20時(shí)，有機(jī)酸的提取量達(dá)到最大，之后隨著提取溶劑的增加有機(jī)酸的提取量不斷降低。因此，選擇料液比為1：20為宜。

2.1.4超聲功率對有機(jī)酸提取量的影響 由圖4可知，隨超聲波功率的增加，果梅果實(shí)有機(jī)酸提取量先增大后降低，超聲功率在40～60 kHz范圍內(nèi)，有機(jī)酸提取量隨超聲功率的增大而升高，當(dāng)超聲頻率為60 kHz時(shí)，有機(jī)酸提取量達(dá)到最高值。當(dāng)超聲功率繼續(xù)增大時(shí)，有機(jī)酸的提取量反而下降。因此，選擇超聲功率60kHz為宜。

2.1.5提取次數(shù)對有機(jī)酸提取量的影響 由圖5可知，隨著提取次數(shù)的增加，果梅果實(shí)有機(jī)酸提取量越來越低，當(dāng)提取次數(shù)為3時(shí)，有機(jī)酸提取量僅為0.30%，可見，經(jīng)第2次提取后，有機(jī)酸的提取量已經(jīng)很低，綜合考慮產(chǎn)量和能耗等因素，選擇提取2次為宜。

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化果梅果實(shí)有機(jī)酸提取工藝

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取料液比（X1），超聲功率（X2）、超聲溫度（X3）及超聲時(shí)間（X4）作為自變量，以有機(jī)酸的提取量作為響應(yīng)值，共設(shè)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中24個(gè)為析因試驗(yàn)，5個(gè)為中心試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

采用Design Expert 8.06軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到有機(jī)酸提取量與料液比（X1）、超聲功率（X2）、超聲溫度（X3）、超聲時(shí)間（X4）的二次多項(xiàng)回歸方程：y=6.37-0.12X，-0.052X2+0.19X3+0.020X4+0.021X1X2-0.30X1X3-0.065X1X4-0.010X2X3-0.14X2X4-0.054X3X4-0.44X12-0.55X22-0.5 1X3-0.34X42。從方程中可以反映出各因素對提取量的影響程度，方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對值越多，影響越大，系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向。

2.2.2響應(yīng)面法優(yōu)化回歸方程的方差分析 由表3可知，該回歸方差模型極顯著（P=0.000 1<0.01），回歸模型的決定系數(shù)R2=0.912 0，說明該模型能夠解釋91.20%的變化，失擬項(xiàng)P=0.235 9>0.05，失擬性檢驗(yàn)結(jié)果不顯著。表明有機(jī)酸提取量（Y）實(shí)際值與預(yù)測值之間擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小，可用該模型分析和預(yù)測果梅果實(shí)有機(jī)酸超聲提取的結(jié)果。對模型回歸方程系數(shù)的顯著性試驗(yàn)表明，一次項(xiàng)中X1的偏回歸系數(shù)顯著、X3偏回歸系數(shù)極顯著，交互項(xiàng)X1X3極顯著，二次項(xiàng)中X1、X2、X3和X4均極顯著，表明這些響應(yīng)值對有機(jī)酸的提取具有顯著影響。結(jié)合模型回歸中的線性和回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，對有機(jī)酸提取影響因素的大小順序依次為超聲溫度、料液比、超聲功率、超聲時(shí)間。

2.2.3響應(yīng)面的曲面分析 圖6直觀地反映了各因素對響應(yīng)值的影響，在試驗(yàn)設(shè)定的水平范圍內(nèi)，隨著每個(gè)因素取值的增大，其相應(yīng)面值相應(yīng)也增大，但當(dāng)響應(yīng)值達(dá)到最大值后，其不再隨因素取值的增大而增大。從中可以看出，X1X2（P=0.822 7）、X1X4（P=0.0.4911）、X2X3（P=0.912 6）、X2X4（P=0.157 5）和X3X4（P=0.566 2）的等高線形狀為圓形，曲面的陡峭程度較為平緩，交互作用較弱。X1X3（P=0.005 3）等高線為橢圓形，曲面較陡峭，反映其交互作用顯著。

2.2.4最佳工藝條件的預(yù)測與檢驗(yàn) 通過響應(yīng)面優(yōu)化得到果梅果實(shí)有機(jī)酸提取的最佳工藝方案為料液比1：18.86、超聲功率59.40 kHz、超聲溫度36.26℃、超聲時(shí)間30.21 min，預(yù)測有機(jī)酸提取量可達(dá)到6.40%。在最優(yōu)條件下進(jìn)行4組驗(yàn)證試驗(yàn)，所得果梅果實(shí)有機(jī)酸提取量為6.24%，與理論預(yù)測值的誤差為0.16%?？梢娀貧w方程能較真實(shí)地反映各因素對果梅果實(shí)有機(jī)酸提取量的影響，由響應(yīng)面法建立的回歸模型具有可靠性，

3.小結(jié)

通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面法，對超聲提取果梅果實(shí)有機(jī)酸的工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到的最佳工藝條件為料液比1：19、超聲功率59 kHz、超聲溫度36℃、超聲時(shí)間30 min，提取次數(shù)為2次。在此最佳工藝條件下，果梅果實(shí)有機(jī)酸的提取量為6.24%。