李拓凡　梁雄燕　葉麗珣　萬亮　楊玉瑩

摘要：為了解禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒（AERs）在湖北地方雞種洪山雞和麻城綠殼蛋雞基因組中的存在狀況，利用禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒EAV、ev loci和ev/J特異性引物對(duì)兩種雞的基因組進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果表明。洪山雞和麻城綠殼蛋雞中均檢測(cè)出EAV、ev loci和ev/J三種禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒基因序列：核酸序列同源性分析顯示，洪山雞和麻城綠殼蛋雞基因組中的EAV、ev loci和ev/J之間的同源性分別為98.8%，99.6%和99.6%；進(jìn)化樹分析顯示，兩種雞內(nèi)的三種禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒均分別位于進(jìn)化樹的同一分支，表明洪山雞和麻城綠殼蛋雞內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒具有共同的祖先并且進(jìn)化路徑相似。洪山雞和麻城綠殼蛋雞的ev/J與ALV-J原型株HPRS-103同源性高于98%，且進(jìn)化樹處于同一分支。而與ALV-J國內(nèi)分離株SD9901、YZ9901毒株的同源性較低，并且進(jìn)化樹位于不同分支，表明這兩種雞的ev/J可能與ALV-J原型株HPRS-103親緣關(guān)系更近，而與國內(nèi)的外源性ALV-J分離毒株SD9901、YZ9901親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

關(guān)鍵詞：禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒：ev loci：ev/J

禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒（Avian endogenous retrovirus，AERs）是一類存在于雞基因組中，隨宿主基因組遺傳復(fù)制的前病毒DNA序列。在外源性J亞群禽白血病病毒（ALV-J）出現(xiàn)以前，禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒一直未引起人們重視，直到發(fā)現(xiàn)ALV-J囊膜基因與雞基因組中內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ev/J部分序列高度同源，人們才逐漸意識(shí)到禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒可能參與了外源性禽白血病病毒新亞群的形成，是外源性ALV-J形成的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。然而，禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒在中國地方雞種雞群中的存在狀況尚不清楚，本研究采用特異性引物對(duì)湖北省兩個(gè)地方品種雞群進(jìn)行禽了內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒PCR檢測(cè)與分析，旨在了解這兩種雞種基因組中禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的相關(guān)狀況，為進(jìn)一步探索內(nèi)源性禽反轉(zhuǎn)錄病毒與外源性病毒的傳播、進(jìn)化、致病機(jī)理的相關(guān)性等提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1主要材料與試劑

洪山雞、麻城綠殼蛋雞種蛋分別購自隨州市譚龍畜禽開發(fā)有限公司洪山雞保種場(chǎng)、麻城綠殼蛋雞原種保種場(chǎng)：M199細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；PCR相關(guān)試劑和PMD19T-Vector購自寶生物工程（大連）有限公司：瓊脂糖凝膠回收試劑盒為北京鼎國昌盛公司產(chǎn)品：DM2000PlusDNA Marker為北京康為世紀(jì)生物公司產(chǎn)品：引物參照相關(guān)文獻(xiàn)及Genebank相關(guān)序列設(shè)計(jì)，均由上海捷瑞生物公司合成，各引物序列相關(guān)信息見表1。其中H5/H7，F(xiàn)2/R2，F(xiàn)5/R5為檢測(cè)引物，擴(kuò)增片段不測(cè)序。

1.2模板DNA提取

分別取洪山雞（縮寫為HS）和麻城綠殼蛋雞（縮寫為ML）的10日齡雞胚進(jìn)行原代雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層，取每個(gè)品種雞細(xì)胞各一瓶，分別收集細(xì)胞，用SDS法提取基因組DNA，用ALV-J特異性引物H5/H7進(jìn)行PCR檢測(cè)，無外源性ALV-J感染的基因組DNA作為擴(kuò)增禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒基因的DNA模板。

1.3PCR反應(yīng)體系及條件

PCR均采用25μL反應(yīng)體系：10xPCR Buffer2.5μL，Mg²⁺2μL，dNTP2 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，Ex Tag 0.25μL，加去離子水H₂O至25μL。PCR循環(huán)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，退火30 s（不同引物對(duì)應(yīng)的退火溫度見表1），72℃延伸1～2 min（延伸時(shí)間，按Taq酶效率1 kb/min計(jì)算），共33個(gè)循環(huán)：72℃10min，4℃10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.4目的片段的克隆與測(cè)序

用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物并與pMDTM19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐青霉素平板，篩選陽性克隆菌，用M13通用引物對(duì)轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行進(jìn)行PCR鑒定，送武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司測(cè)序。

1.5序列分析

測(cè)序結(jié)果用核酸分析軟件DNAStar進(jìn)行分析，所引用的相關(guān)基因序列均來自NCBI GenBank：EAV-0（X59844）；ev loci：Clonel（AY013303）；Clone3（AY013304）；Clone6（AY013305）；ev/J：EAV-HP （NC005947）；ALV-J：HPRS-103（Z46390），SD9901（AY897220），YZ9901（AY897222）。

2.結(jié)果與分析

2.1模板DNA提取及外源性ALV-J感染排除

以特異性引物H5/H7對(duì)所提取的洪山雞和麻城綠殼蛋雞DNA進(jìn)行外源性ALV-J PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)顯示陽性對(duì)照擴(kuò)增出ALV-J對(duì)應(yīng)的片段，本試驗(yàn)所提取的DNA未擴(kuò)增出片段，如圖1所示。

2.2洪山雞和麻城綠殼蛋雞基因組內(nèi)禽反轉(zhuǎn)錄病毒PCR檢測(cè)

分別以洪山雞和麻城綠殼蛋雞基因組DNA為模板，分別用禽反轉(zhuǎn)錄病毒EAV、ev loci、ev/J特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果洪山雞和麻城綠殼蛋雞均檢測(cè)出與EAV、ev loci、ev/J對(duì)應(yīng)的目標(biāo)片段（圖2和圖3）。依據(jù)DNA模板及所使用的引物將從洪山雞基因組中擴(kuò)增出的禽內(nèi)源性病毒反轉(zhuǎn)錄片段依次命名為HS1、HS2、HS3、HS4、HS5、HS6；將從洪山雞基因組中擴(kuò)增出的禽內(nèi)源性病毒反轉(zhuǎn)錄片段依次命名為ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6。

2.3目的片段克隆與測(cè)序結(jié)果

將篩選的洪山雞和麻城綠殼蛋雞基因組內(nèi)禽反轉(zhuǎn)錄病毒各片段陽性克隆菌送武漢擎科生物技術(shù)公司測(cè)序，得到HS1、HS3、HS4、HS6片段的大小分別為241、881、713、1 479 bp；MLl、ML3、ML4、ML6的大小分別為241、881、713、1 479 bp。

2.4EAV核酸序列分析

測(cè)序結(jié)果DNAStar分析顯示，洪山雞與麻城綠殼蛋雞的EAV中TM（跨膜糖蛋白單位）、LTR（長(zhǎng)末端重復(fù)序列）基因之間區(qū)域的核酸序列（EAV-HS、EAV-ML）同源性為98.8%，而二者與EAV-0內(nèi)源性序列的相應(yīng)區(qū)域同源性分別為98.3%和99.6%：與E51內(nèi)源性序列的同源性分別為74.7%和75.9%（圖4）。進(jìn)化樹分析顯示，EAV-HS、EAV-ML與EAV-0處于同一分支而與E51處于不同的分支（圖5）。

2.5ev loci核酸序列分析結(jié)果

DNAStar分析顯示，洪山雞與麻城綠殼蛋雞基因組中ev loci的env基因之間的同源性為99.6%，而二者與原型株Clonel，Clone3，Clone6核酸同源性在98.6%-99.0%之間（圖6）。進(jìn)化樹分析顯示eyHS、ev-ML處于同于分支，而與三個(gè)原型株處于不同的分支（圖7）。

2.5 ev/J核酸序列分析結(jié)果

洪山雞與麻城綠殼蛋雞中ev/J的env基因部分核酸序列之間同源性為99.6%，與EAV-HP相應(yīng)區(qū)域的核酸同源性分別為98.5%、98.9%：與外源性ALV-J原型株HPRS-103及SD9901、YZ9901分離株的同源性為95.5%-98.1%（圖8）。進(jìn)化樹分析顯示，ev/J-HS、ev/J-ML與ALV-J原型株HPRS-103處于進(jìn)化樹同一分支，而與外源性ALV-J的SD9901、YZ9901處于不同分支（圖9）。

3.討論

禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒（Avian Endogenous Retrovirus，AERs）是一類存在于雞基因組中，隨宿主基因組遺傳復(fù)制的前病毒DNA序列，是外源性禽白血病病毒早期感染留下的“內(nèi)影像”。在外源性J亞群禽白血病病毒（ALV-J）出現(xiàn)以前，禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒一直未引起人們重視，直到發(fā)現(xiàn)ALV-J的env基因與禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ev/J（EAV-HP）的eny序列具有高達(dá)96%的同源性后，人們才逐漸意識(shí)到禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的重要性。當(dāng)前的研究結(jié)果表明，外源性的ALV-J可能是內(nèi)源性ev/J與其他外源性ALV發(fā)生重組產(chǎn)生的新的亞群，禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒可能是外源性禽白血病新亞群形成的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究利用特異性PCR引物對(duì)湖北省地方品種洪山雞和麻城綠殼蛋雞基因組進(jìn)行了部分禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒檢測(cè)。結(jié)果表明，2個(gè)品種的雞基因組中均檢測(cè)到ev loci、ev/J、EAV 3種禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒。核酸序列同源性分析顯示這兩種雞中的禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒EAV、ev loci座、ev/J均具有高度同源性，分別為98.8%、99.6%、98.5%；進(jìn)化樹分析顯示，在相應(yīng)的病毒進(jìn)化樹中兩種雞的3種禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒均分別處于同一分支。這可能提示，洪山雞和麻城綠殼蛋雞內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒具有共同的祖先并且進(jìn)化路徑相似。

另外，洪山雞和麻城綠殼蛋雞的ev/J與原型株HPRS-103同源性高于98%，且進(jìn)化樹處于同一分支。而與國內(nèi)SD9901、YZ9901毒株的同源性只有95%，并且進(jìn)化樹也不處于同一分支，結(jié)果表明這2種雞以前所感染的外源性病毒與原型株HPRS-103關(guān)系密切，而與國內(nèi)的一些分離毒株存在一定的差異。