賀海波　秦文　曾建紅　張敏

摘要：為了研究預知子三萜皂苷（TSAF）抗脂質過氧化和紅細胞溶血作用，以昆明小鼠作為試驗對象，采用分光光度法測定TSAF對自發(fā)性及CCl₄、H₂O₂、Fe²⁺-VC誘導的小鼠肝脂質過氧化的影響，測定TSAF對H₂O₂誘導的小鼠紅細胞溶血的影響。結果表明，TSAF可抑制肝自發(fā)性脂質過氧化，對CCl₄、H₂O₂、Fe₂₊-VC誘導的肝過氧化損傷具有保護作用，能有效地抑制過氧化產物MDA的生成，具有抑制H₂O₂誘導紅細胞溶血的作用，抑制率與TSAF濃度呈良好的量效關系。TSAF具有較強的體外抗脂質過氧化和紅細胞溶血的作用，并呈一定的量效關系。

關鍵詞：預知子三萜皂苷；脂質過氧化；丙二醛；紅細胞溶血；抗氧化活性

預知子為木通科植物木通、三葉木通或白木通的干燥近成熟果實，是中醫(yī)臨床防治肝癌行氣活血治法中的常用藥物。其果味甜可食，也可釀酒，種子可榨油。三萜皂苷類成分是預知子中的主要成分，具有抗癌、抗憂郁和改善腦卒中后神經功能等廣泛的生物活性和功效，迄今為止未發(fā)現(xiàn)毒性報道，故其在新藥研究方面具有廣闊的前景。本試驗對預知子三萜皂苷（Triterpenoid saponins of akebiae fructus，TSAF）類成分的體外抗脂質過氧化作用進行研究，為后續(xù)的研發(fā)奠定基礎。

1.材料與方法

1.1試驗動物

健康清潔級雄性昆明種小鼠，體重（20±2）g，購自桂林醫(yī)學院實驗動物中心（生產許可證：SCXK桂2013-0002）。

1.2材料與試劑

丙二醛（Malondialdehvde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。三氯醋酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）、自由基誘導劑CCl₄、H₂O₂和鐵離子一抗壞血酸（Fe²⁺-VC）等均為國產分析純。

1.3儀器與設備

HP70A冷凍超速離心機（Hitachi日立公司）：FSH-2A可調高速勻漿機（金壇市華控實驗儀器廠）；D-1006-D2超純水機（上海必能信有限公司）；SGW-1全自動旋轉蒸發(fā)儀（上海摩速科學器材有限公司）：DU800紫外可見分光光度計（美國Beckman公司）。

1.4方法

1.4.1對小鼠肝臟自發(fā)性脂質過氧化的影響 小鼠禁食過夜后于次日頸椎脫臼處死，立即解剖取出肝臟，4℃生理鹽水沖洗血液，剔除脂肪和結締組織，濾紙吸干稱重后剪碎，在4℃生理鹽水中進行研磨，制成10%肝組織勻漿。試驗分為對照組和5個劑量的TSAF組，取6支離心管，先在各管中分別加入1.0mL肝組織勻漿，然后在5個劑量的rSAF組中分別加入濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL TSAF 0.1 mL，對照組加入蒸餾水0.1 mL。每組平行3管，混勻，將各組離心管于37℃水浴恒溫振蕩反應1.0 h，取出后流水冷卻，然后向各管分別加入1.0 mL的20%TCA和1.0 mL的0，67%TBA，混勻，置沸水浴中振蕩反應15min，取出后流水冷卻，于3 500 r/min離心10 min，去除蛋白質沉淀，取上清液，-20℃冰箱保存待測MDA含量，按試劑盒說明測定肝組織勻漿中MDA含量，并計算抑制率（%）。

抑制率（IR）=[（對照組MDA-提取物組MDA）/對照組MDA]×100%

1.4.2對CCl₄誘導小鼠肝脂質過氧化的影響 按“1.4.1”方法制備10%肝組織勻漿。試驗分為對照組（肝組織勻漿、蒸餾水和CCl4）和5個劑量的TSAF組（肝組織勻漿、各劑量的TSAF和CCl₄），取6支離心管，先在各管中分別加入1.0 mL肝組織勻漿，然后在5個劑量的TSAF組中分別加入濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL TSAF 0.1 mL，對照組加入蒸餾水0.1 mL。每組平行3管，混勻，將各組離心管于37℃水浴恒溫振蕩反應30 min，取出后流水冷卻，然后向各管分別加入20 μL CCl₄，混勻，繼續(xù)水浴恒溫振蕩反應30 min，取出后流水冷卻，以下步驟與“1.4.1”相同。

1.4.3對H₂O₂誘導小鼠肝脂質過氧化的影響 按“1.4.1”方法制備10%肝組織勻漿。試驗分為對照組（肝組織勻漿、蒸餾水和H₂O₂）和5個劑量的TSAF組（肝組織勻漿、各劑量的TSAF和H₂O₂）。取6支離心管，先在各管中分別加入1.0 mL肝組織勻漿，然后在5個劑量的TSAF組中分別加入濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL TSAF 0.1 mL，對照組加入蒸餾水0.1 mL。每組平行3管，混勻，將各組離心管于37℃水浴恒溫振蕩反應30 min，取出后流水冷卻，然后向各管分別加入1.0 mL的0.1 mol/L H₂O₂，混勻，水浴恒溫振蕩反應30 min，取出后流水冷卻，以下步驟與“1.4.1”相同。

1.4.4對Fe²⁺-VC誘導小鼠肝脂質過氧化的影響按“1.4.1”方法制備10%肝組織勻漿。試驗分為對照組（肝組織勻漿、蒸餾水、FeSO₄·7H₂O和VC）和5個劑量的TSAF組（肝組織勻漿、各劑量的TSAF、FeSO₄·7H₂O和VC）。取6支離心管，先在各管中分別加入1.0mL肝組織勻漿，然后在5個劑量的TSAF組中分別加入濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL TSAF 0.1mL，對照組加入蒸餾水0.1 mL。再向各管中分別加入50 μL FeSO₄·7H₂O（終濃度為2.0 mmol/L）和50 μLVC（終濃度為1.0 mmol/L）。每組平行3管，混勻，以下步驟與“1.4.1”相同。

1.4.5對紅細胞溶血的影響 小鼠眼眶采血1～2 mL，加入肝素鈉抗凝劑后，于3 500r/min離心10min，分取紅細胞沉淀后，用生理鹽水洗滌3次，制成終濃度為0.5%小鼠紅細胞懸浮液。試驗分為對照組（紅細胞懸浮液、蒸餾水）和5個劑量的TSAF組（紅細胞懸浮液、各劑量的TSAF）。取6支離心管，先在各管中分別加入1.0 mL紅細胞懸浮液，然后在5個劑量的TSAF組中分別加入濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL TSAF 0.1 mL，對照組加入蒸餾水0.1 mL。接著在5個劑量的TSAF組中再加入0.05 mL 100mmol L H₂O₂，對照組加蒸餾水補足體積。每組平行5管，混勻，將各組離心管于37℃水浴1 h，用生理鹽水稀釋5倍，于3 000 r/min離心10min，分取上清液，采用紫外可見分光光度計于540 nm處測定吸光度值（A_540nm），計算溶血抑制率。

溶血抑制率=[（對照組A-提取物組A）/對照組A]×100%

1.4.6統(tǒng)計學方法 所有計量資料采用均數(shù)±標準差表示（x±s）。采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據分析，計數(shù)資料比較用X²檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結果與分析

2.1對肝自發(fā)性和CCl₄、H₂O₂、Fe²⁺-VC誘導脂質過氧化的抑制作用

由表1可知，與對照組比較，自發(fā)性脂質過氧化、CCl₄、H₂O₂、Fe²⁺-VC誘導脂質過氧化試驗中5個劑量TSAF組小鼠肝組織中MDA含量與對照組相比均顯著或極顯著降低（P<0.05或P<0.01）。隨著TSAF濃度的增加，MDA含量逐漸下降，且其抑制率隨濃度的增加而呈上升的趨勢。表明TSAF不僅對小鼠肝自發(fā)性脂質過氧化產物MDA的生成有抑制作用，而且對CCl₄、H₂O₂、Fe²⁺-VC誘導的脂質過氧化產物MDA的生成也表現(xiàn)有相同的抑制作用，其抑制作用與TSAF濃度存在一定的量效關系。

2.2對紅細胞溶血的影響

由表2可知，與對照組相比，5個劑量TSAF組吸光度值均顯著或極顯著降低（P<0.05或P<0.01）。隨著TSAF濃度的增大，吸光度逐漸減小，抑制率逐漸加強，最高溶血抑制率達到91.27%，表明TSAF具有很好的抑制紅細胞溶血的作用，說明TSAF對紅細胞溶血的抑制作用與其濃度存在一定的量效關系，

3.討論

機體在正常狀態(tài)下，不僅有氧自由基產生系統(tǒng)，而且還有清除自由基的抗氧化系統(tǒng)，一方面通過正常的組織代謝產生自由基，另一方面依靠自身的自由基清除系統(tǒng)使體內自由基的產生和清除處于一個動態(tài)平衡的狀態(tài)。而當機體在病理情況下，自由基的產生和清除失衡，自由基產生的數(shù)量會急劇增加，過多高活性的自由基在體內存在時，可對機體產生一系列的損害作用。脂質過氧化是體內氧自由基能攻擊生物膜中多聚不飽和脂肪酸而引起的一系列有害氧化反應，它大部分由肝細胞產生，其分解也主要在肝臟。當自由基在體內的產生增加時，可以產生一系列脂質過氧化物，MDA是由自由基引發(fā)的脂質過氧化物的最終產物。MDA含量越高，提示細胞膜脂質過氧化程度就越高，細胞膜損傷也就越嚴重。MDA可導致人體細胞氧化損害、老化、癌變等，它與腫瘤、心血管疾病、衰老、炎癥、自身免疫等疾病的發(fā)生密切相關。MDA含量可間接反映機體的脂質過氧化水平，它是目前評價氧自由基損傷的最常用方法。

CCl₄是一種典型致肝臟損傷的化學性毒物，CCl₄經肝氧化酶系統(tǒng)作用后，生成過氧化三氯甲基自由基（·OOCCl₃）和三氯甲基游離基（·CCl₃）等自由基，它們通過攻擊肝細胞膜上的磷脂分子而引起脂質過氧化反應，使MDA含量增加。Fe²⁺是一種常見的自由基鏈式反應促進劑，F(xiàn)e²⁺也可促進脂質過氧化反應的發(fā)生，使MDA的生成量增加。H₂O₂是活性氧家族中的一員，在H₂O₂氧化劑的作用下，可以產生更強活性的·OH，并誘發(fā)多聚不飽和脂肪酸氧化，MDA增加，生物膜的功能和結構受到破壞。本研究結果表明，TSAF可明顯抑制小鼠肝自發(fā)性脂質過氧化產物MDA的生成，并且TSAF以劑量依賴方式抑制體系MDA的產生，TSAF的這種抑制作用不但表現(xiàn)在肝自發(fā)性脂質過氧化，而且還表現(xiàn)在由CCl₄、H₂O₂和Fe²⁺-VC等氧化劑誘導的脂質過氧化，表明TSAF具有良好的抗氧化作用。H₂O₂能單獨與紅細胞作用使紅細胞溶血及膜脂質發(fā)生過氧化。紅細胞在體外與H₂O₂反應后也可產生脂質過氧化的主要產物MDA，損傷紅細胞膜，使之容易產生溶血。此次試驗結果顯示，TSAF對紅細胞溶血有明顯的抑制作用，隨濃度增加抑制效果逐漸增強，提示TSAF對H₂O₂誘導的紅細胞溶血有明顯的抵抗作用。總之，TSAF在體外具有較強的抗脂質過氧化和紅細胞溶血的作用，這為進一步開發(fā)預知子藥用和食用價值提供了理論依據。