黃佩蓓　陳世華　王飛　曾賢

摘要：采用SRAP標(biāo)記技術(shù)，對(duì)木通屬25份藥用植物材料進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，在選用的12對(duì)引物中，共檢測(cè)到173條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率達(dá)83.2%，相似系數(shù)變化范圍為0.275 8～0.931 0，UPGMA聚類分析將25個(gè)供試樣品分為二類：五葉木通為一類，白木通和三葉木通聚為一類：SRAP標(biāo)記適合木通屬植物的遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析。

關(guān)鍵詞：木通屬；相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）；遺傳多樣性

木通屬植物作為中國(guó)傳統(tǒng)中藥材，目前國(guó)內(nèi)外研究的主要有3種：木通（俗稱五葉木通）、三葉木通及其變種白木通。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，近年來RAPD、AFLP分子標(biāo)記技術(shù)相繼成功應(yīng)用于木通屬植物的研究，但RAPD穩(wěn)定性差、擴(kuò)增產(chǎn)率低，AFLP技術(shù)復(fù)雜，使其應(yīng)用受限。SRAP（Sequence-related amplified polymorphism，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）是一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)，它結(jié)合了RAPD和AFLP分析的優(yōu)點(diǎn)，操作簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定、中等產(chǎn)率、成本低，目前已被廣泛應(yīng)用，但利用SRAP標(biāo)記技術(shù)分析木通屬植物遺傳多樣性的研究尚未見報(bào)道。為此，運(yùn)用SRAP標(biāo)記技術(shù)分析25份木通屬藥用植物的遺傳多樣性，旨在為木通屬藥用植物的選種栽培提供參考，并探討SRAP標(biāo)記在木通屬藥用植物種質(zhì)資源研究中的可行性。

1.材料與方法

1.1材料

供試材料均采自江西省境內(nèi)，由江西中醫(yī)藥大學(xué)賴學(xué)文教授鑒定。具體材料名稱及來源地見表1。

1.2方法

1.2.1DNA提取 取新鮮嫩葉約0.1 g，參照王飛等的方法分別提取不同材料的總DNA。

1.2.2SRAP分析 SRAP引物采用Li等公布的序列，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表2）。

SRAP-PCR反應(yīng)體系（25 μL總體積）：模板DNA90 ng，dNTPs 200 μmol/L，Taq DNA聚合酶1 u，引物0.4 μmol/L，10xPCR Buffer 2.5 μL，其余用ddH2O補(bǔ)齊。SRAP-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃1 min，35℃1 min，72℃2 min，5個(gè)循環(huán)；94℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)：72℃延伸10 min；4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察和記錄。

1.2.3數(shù)據(jù)處理 根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，每個(gè)樣品的擴(kuò)增帶數(shù)按有帶賦值為“1”（強(qiáng)帶和弱帶同記），無帶為“0”，建立“1”和“0”型數(shù)據(jù)。利用NTSYS軟件計(jì)算相似系數(shù)，用UPGMA進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樹狀圖。

2.結(jié)果與分析

2.1SRAP多態(tài)性分析

采用42對(duì)引物組合對(duì)25份木通屬植物材料進(jìn)行擴(kuò)增，其中12對(duì)引物組合可擴(kuò)增出清晰的多態(tài)性條帶，擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性信息見表3。從表3可以看出，共檢測(cè)到清晰條帶208條，其中多態(tài)性條帶173條，平均每對(duì)引物產(chǎn)生14.4條多態(tài)性條帶，平均多態(tài)率為83.2%，表明木通屬植物具有較為豐富的遺傳多樣性。不同引物組合擴(kuò)增條帶大小集中在100～1 400bp。

引物組合Me4-Em8擴(kuò)增結(jié)果見圖1。圖1表明，SRAP分子標(biāo)記能檢測(cè)出較多的木通屬植物的遺傳位點(diǎn)，獲得多態(tài)性相對(duì)較好的PCR結(jié)果，SRAP標(biāo)記適合木通屬植物的遺傳多樣性分析。

2.2聚類分析

采用NTSYS-PC軟件對(duì)這些擴(kuò)增條帶進(jìn)行遺傳差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其相似系數(shù)結(jié)果見表4，聚類分析結(jié)果見圖2。

從表4可以看出，25份供試材料的相似系數(shù)變化范圍在0.275 8-0.931 0之間。白木通和三葉木通的相似系數(shù)在0.517 2～0.758 6之間，均值為0.637 9：白木通和五葉木通的相似系數(shù)在0.275 8-0.620 6之間，均值為0.448 2：而三葉木通和五葉木通的相似系數(shù)在0.310 3-0.689 6之間，均值為0.500 0。由相似系數(shù)可以看出，三葉木通和白木通的遺傳相似系數(shù)最大，二者親緣關(guān)系較近：白木通與五葉木通的遺傳相似系數(shù)最小，二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

從圖2可以看出，根據(jù)SRAP標(biāo)記得到25份材料的聚類結(jié)果顯示，在相似系數(shù)0.45處可將參試材料分為2類，白木通和三葉木通聚為一類，五葉木通聚為一類：白木通與三葉木通聚為一類后，最終和五葉木通聚為一類。大部分來自相同或相似生態(tài)地理環(huán)境的能聚為一類，表現(xiàn)地域相似性，如來自廬山的白木通聚為一類（C2、C3），來自井岡山的白木通聚為一類（c4、v5），來自南昌梅嶺的三葉木通聚為一類（V8、V9、V10和V11、V12、V14、），三清山的聚為一類（V16、V17），云居山的聚為一類（V18、V19）。

3.小結(jié)

試驗(yàn)采用12對(duì)SRAP標(biāo)記引物對(duì)25個(gè)木通屬植物樣品基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到清晰條帶208條，多態(tài)性條帶173條，多態(tài)性比率為83.2%，表明SRAP技術(shù)對(duì)木通屬植物的擴(kuò)增具有較高的效率，適于其種質(zhì)遺傳變異檢測(cè)，是一種有效、可靠的分子標(biāo)記，將為進(jìn)一步開展木通屬種質(zhì)資源的鑒定及其良種選育工作奠定基礎(chǔ)。

聚類分析結(jié)果表明，3種木通屬植物有明顯的界限，白木通聚為一類，三葉木通聚為一類，五葉木通聚為一類，白木通與三葉木通聚為一類后，最終和五葉木通聚為一類：此結(jié)果與傳統(tǒng)分類結(jié)果相符。