靳遠(yuǎn)航 余春娥 鄭育聲

摘 要 本課題從擬南芥中克隆了超長鏈脂肪酸代謝相關(guān)的功能基因AtKCS12，轉(zhuǎn)入酵母（INVSC1）表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，檢測酵母細(xì)胞中脂肪酸組成。脂肪酸組成結(jié)果分析表明，AtKCS12使酵母中棕櫚酸（16∶0）和硬脂酸（18∶0）的相對含量顯著增加了，十八烯酸（18∶1）的相對含量顯著減少了。這些結(jié)果共同提示，AtKCS12表達(dá)的蛋白不能利用酵母中的脂肪酸作為催化底物合成超長鏈脂肪酸，或者AtKCS12蛋白無酶活性。

關(guān)鍵詞 擬南芥；β-酮脂酰輔酶A合成酶；超長鏈脂肪酸；表達(dá)載體

中圖分類號：S565.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.21.109

超長鏈脂肪酸（VLCFA）是生物體中碳原子數(shù)超過18碳的脂肪酸，直接參與油料作物中甘油脂、生物膜膜脂和鞘脂的生物合成，同時也為角質(zhì)層蠟質(zhì)的生物合成提供前體物質(zhì)[1]。在超長鏈脂肪酸合成過程中，KCS酶是催化第一步縮合反應(yīng)的調(diào)控延伸反應(yīng)的限速酶[2]。它以?；?CoA（≥C18）和丙二酰-CoA為原料，合成碳鏈延伸了2個C的β-酮脂酰-CoA[3]。研究顯示，擬南芥KCS基因家族有21個成員，依據(jù)氨基酸序列的同源性可將21個成員劃分為FAE1、KCS1、FDH、CER6四個亞組[3]；而依據(jù)基因組構(gòu)成、親緣關(guān)系、蛋白質(zhì)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和3D構(gòu)象，21個基因成員又可分為8個亞類[4]。這些KCS基因在植物體的不同組織、器官特異性表達(dá)，并具有底物特異性。

雖然KCS家族在植物形成長鏈脂肪酸中發(fā)揮重要功能已有報道，部分家族成員的具體作用機制也已被證實，但其成員AtKCS12在不同種類脂肪酸形成過程的功能卻鮮有報道。本研究利用分子遺傳的方法，對在擬南芥中編碼脂肪酸代謝途徑中關(guān)鍵酶的基因AtKCS12的功能進(jìn)行研究，為下一步克隆油料作物中的AtKCS12，改善油料作物的含油量，提供更多長鏈以及超長鏈脂肪酸打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

野生型擬南芥（Arabidopsis）的種子采自本實驗室。TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；INVSc1酵母本實驗室保存；轉(zhuǎn)化入pYES2的E·Coli本實驗室保存。其他相關(guān)試劑購自上海生物工程公司。

1.2 擬南芥RNA提取及cDNA合成

擬南芥葉片的RNA采用CTAB-LiCl法提取[5]。cDNA合成參見TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒（TIANGEN，China）。

1.3 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

分別用SacI和XbaI，SacI和EcoRI兩種酶對KCS-pEASY質(zhì)粒和pYES2質(zhì)粒進(jìn)行酶切，T4連接酶連接，重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。

1.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入INVSc1酵母細(xì)胞

INVSc1酵母在缺His、Leu、Try、Ura的缺陷培養(yǎng)基上不能生長。pYES2質(zhì)?？珊铣赡蜞奏?，故用尿嘧啶缺陷篩選。挑單個菌落接種于20 mL YPD液體培養(yǎng)基中，將1μg質(zhì)粒DNA，10μL變性鮭魚精子DNA（10 mg/mL）于上述酵母溶液混勻；加入1×LiAc/40%PEG-4000/1×TE，混勻；加入88 μLDMSO混勻，42 ℃加熱7 min；

12 000 rpm離心10 s，重懸細(xì)胞，12 000 rpm再離心；涂布于SC-U固體培養(yǎng)基。

1.5 酵母脂肪酸的分析

收集酵母菌體后進(jìn)行酵母脂肪酸的提取與甲酯化[6]。石英毛細(xì)管柱HP-5（30 m×0.35 mm，0.25 μm），程序升溫：從180 ℃開始，以5 ℃/min升到230 ℃，保持20 min；載氣為He，柱流量1.5 mL/min，進(jìn)樣口溫度230 ℃，檢測器溫度為FID為230 ℃，分流比30∶1。色譜柱信息：Agilent Technologies，Inc。貨號：125-3237。型號：

DB-FFAP 30 m×0.530 mm，0.5Micro[7]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 6.0統(tǒng)計軟件分析，比較轉(zhuǎn)基因酵母與對照組酵母中脂肪酸含量的差異。若概率P<0.05，則認(rèn)為結(jié)果是顯著的；若P<0.01，則認(rèn)為結(jié)果是極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 AtKCS12的克隆和序列分析

克隆AtKCS12 cDNA序列片段（見圖1A），將其連接到pEASY 載體后雙酶切（SacI和EcoRI）驗證。結(jié)果如圖1B所示，雙酶切（SacI，XbaI）和（SacI，EcoRI）后兩條帶的大小分別為1 500 bp左右與5 900 bp左右，結(jié)果與目的基因預(yù)期分子量大小相符合。

AtKCS12含有一個1431bp的開放閱讀框架（ORF），編碼一個含476個氨基酸的多肽。AtKCS12基因編碼的氨基酸多肽，是縮合酶超家族的一員，包含查爾酮合酶（CHS_like）高度同源區(qū)域，該區(qū)域為91-1266bp編碼的392個氨基酸序列，結(jié)果表明，該cDNA序列很可能編碼脂肪酸代謝途徑中3-ketoacyl-CoA synthase。

2.2 酵母轉(zhuǎn)化子鑒定

將目的基因-pYES2重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入INVSc1酵母中，轉(zhuǎn)化效果良好，隨機挑選4個單菌落將其進(jìn)行擴培，提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR驗證是否成功將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母，結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，含目的基因的pYES2重組表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入酵母中，接下來將通過誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，收集菌體，進(jìn)行脂肪酸的提取與檢測分析。

2.3 AtKCS12功能分析

利用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析酵母主要脂肪酸種類以及總脂肪酸含量。分別培養(yǎng)、誘導(dǎo)酵母轉(zhuǎn)化子和對照酵母，收集菌體，提取油脂，經(jīng)甲酯化后進(jìn)行氣相質(zhì)譜分析，主要有4個脂肪酸甲酯的峰，分別為C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1。將所得的數(shù)據(jù)用SAS軟件分析，比較轉(zhuǎn)基因酵母與對照組酵母脂肪酸含量的差異。分析結(jié)果如表1，數(shù)據(jù)以平均值標(biāo)準(zhǔn)方差的形式表示，而*表示樣品與對照組之間的差異顯著，**表示樣品與對照組之間的差異極顯著。

AtKCS12轉(zhuǎn)基因酵母和對照的脂肪酸組成分析結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯?，與對照組相比，AtKCS12在轉(zhuǎn)基因酵母中表達(dá)使得酵母中的棕櫚酸（16∶0），硬脂酸（18∶0）的相對含量增加了4.5%，22.78%，十八烯酸（18∶1）的相對含量減少了5.85%，棕櫚烯酸（16∶1）的含量變化不顯著。

3 討論

本實驗克隆了擬南芥cDNA文庫中的AtKCS12基因，并在酵母（INVSc1）中進(jìn)行表達(dá)。分析脂肪酸組成發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因酵母和空白對照中只有C16∶0、C16∶1、C18∶0和C18∶1這4種長鏈脂肪酸，與空白對照相比，轉(zhuǎn)AtKCS12基因的酵母沒有檢測到超長鏈脂肪酸的合成。推測AtKCS12蛋白不能利用酵母中的C16∶0、C16∶1、C18∶0和C18∶1脂肪酸作為催化底物合成超長鏈脂肪酸，或者在酵母中異源表達(dá)的AtKCS12蛋白沒有酶活性。

參考文獻(xiàn)

[1]鄭德松.油脂合成過程中甘油三磷酸脫氫酶基因及乙酰輔酶A羧化酶基因的克隆與鑒定[D].濟南：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[2]周丹，趙江哲，柏楊，等.植物油脂合成代謝及調(diào)控的研究進(jìn)展[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，35（5）：77-86.

[3] Wu G， Wu Y， Xiao L， et al. Zero Erucic Acid trait of Rapeseed （Brassica napus L.） Results from a Deletion of Four Base Pairs in the Fatty Acid Elongase 1 Gene[J].Theoretical and Applied Genetics，2008， 16（4）：491-499.

[4] Costaglioli P， Joubès J， Garcia C， et al. Profiling Candidate Genes Involved in Wax Biosynthesis in Arabidopsis Thaliana by Microarray Analysis[J]. Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-Molecular and Cell Biology of Lipids， 2005， 1734（3）： 247-258.

[5] Joubès J， Raffaele S， Bourdenx B， et al. The VLCFA Elongase Gene Family in Arabidopsis Thaliana： Phylogenetic Analysis， 3D Modelling and Expression Profiling[J]. Plant molecular biology， 2008， 67（5）： 547-566.

[6]Paul S， Gable K， Beaudoin F， et al. Members of the Arabidopsis FAE1-like 3-ketoacyl-CoA Synthase Gene Family Substitute for the Elop Proteins of Saccharomyces Cerevisiae[J]. Journal of Biological Chemistry， 2006， 281（14）： 9018-9029.

[7]Chi X，Yang Q，Pan L， et al. Isolation and Characterization of Fatty Acid Desaturase Genes from Peanut （Arachis hypogaea L.）[J].Plant Cell Reperts，2011（30）：1393-1404.

（責(zé)任編輯：劉昀）