李可 高彥林 王楚南 蔣春號(hào) 郭堅(jiān)華

摘 要：利用前期試驗(yàn)結(jié)果篩選出叢枝菌根真菌刺狀無(wú)梗囊霉XJ27，將菌根番茄苗移栽至江蘇大豐市大棚中，30 d后進(jìn)行生物量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種XJ27后，番茄移栽成活率以及生物量顯著增加；大田間自然發(fā)病采樣后，經(jīng)特異性引物檢測(cè)，確定為番茄黃化曲葉病毒病，經(jīng)病害嚴(yán)重度統(tǒng)計(jì)后，發(fā)現(xiàn)刺狀無(wú)梗囊霉XJ27對(duì)番茄黃化曲葉病毒病具有一定的生防效果，防效達(dá)到50.44%。

關(guān)鍵詞：刺狀無(wú)梗囊霉；促生作用；番茄黃化曲葉病毒病

中圖分類號(hào)：S641.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-3547（2016）16-0077-04

叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizal，AM）是自然界中普遍存在的植物和真菌的互惠互利共生體，植物能夠?yàn)榫婢峁┥L(zhǎng)需要的碳源和能量，AM真菌可以通過(guò)根外菌絲擴(kuò)大根系吸收范圍，從而提高植物根系對(duì)養(yǎng)分和水分的吸收，尤其是對(duì)土壤磷的吸收[1]。除了在改善植物養(yǎng)分吸收方面的作用外，AM真菌與植物病害的關(guān)系也是目前研究的重點(diǎn)。

隨著番茄種植面積的逐年增加，我國(guó)番茄種植上陸續(xù)出現(xiàn)多種病害問(wèn)題，其中由雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）的番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）引起的番茄黃化曲葉病毒病（Tomato yellow leaf curl virus disease，TYLCD）為害較為嚴(yán)重。該病毒由煙粉虱介導(dǎo)傳播，是一種具有孿生顆粒形態(tài)的單鏈環(huán)狀DNA植物病毒[2]。近年來(lái)，TYLCD在世界范圍內(nèi)大暴發(fā)，遍及40多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，已成為番茄生產(chǎn)上的毀滅性病害[3]，給農(nóng)民的生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]，嚴(yán)重制約了番茄產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。目前，主要通過(guò)培育抗性品種和采用化學(xué)藥劑來(lái)防治煙粉虱防治該病害，但效果不穩(wěn)定。國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有報(bào)道對(duì)TYLCV有顯著抑制效果的生防菌，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上也沒(méi)有出現(xiàn)能有效防治番茄黃化曲葉病毒病的生物農(nóng)藥。本研究首次發(fā)現(xiàn)AM真菌可以在一定程度上降低番茄黃化曲葉病毒病的為害程度，為今后生防產(chǎn)品的研發(fā)以及利用奠定了一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試番茄（Lycopersicon esculentum）品種為合作 903，于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院購(gòu)買(mǎi)。

供試刺狀無(wú)梗囊霉XJ27（Acaulospora spinosa），分離自新疆地區(qū)番茄根際土壤。實(shí)驗(yàn)室之前的研究表明XJ27對(duì)Micro-Tom番茄具有促生及提高果實(shí)中番茄紅素含量的效果[4]。

1.2 試驗(yàn)方法

①田間處理以及小區(qū)設(shè)置 試驗(yàn)于2014年在江蘇大豐市進(jìn)行，共設(shè)置2個(gè)處理，即接種刺狀無(wú)梗囊霉XJ27組和空白對(duì)照組（CK）。將番茄種子用10% H2O2表面消毒 10 min，用無(wú)菌水洗凈后晾干備用。先在穴盤(pán)內(nèi)進(jìn)行菌根苗培育[4]，20 d后連根部土壤一起移栽至田間。每株番茄根部施用2 g AM菌劑（每份菌劑大約100個(gè)孢子），對(duì)照組加入等量滅菌菌劑。每個(gè)處理4個(gè)小區(qū)，每小區(qū)3壟，每壟20株，每處理共240株。生長(zhǎng)期間按常規(guī)方法進(jìn)行管理。

④移栽成活率以及生物量檢測(cè) 移栽后30 d（即育苗后50 d）進(jìn)行移栽成活率的統(tǒng)計(jì)，植株生物量的測(cè)定，每小區(qū)取24株，每處理共96株，分別測(cè)定莖粗、株高及葉片數(shù)。生物量測(cè)定方法：將植株用蒸餾水沖洗，分為地上、根，用吸水紙吸干表面水分，測(cè)定鮮質(zhì)量（FW），記錄葉片數(shù)。

⑤試驗(yàn)田土壤相關(guān)測(cè)定 番茄移栽30 d后，使用五點(diǎn)取樣法對(duì)番茄根圍土壤進(jìn)行采樣。采集方法：小心地從盆缽中收集根圍土樣和非根圍土樣（根圍土樣的樣品包括3株幼苗緊緊附著于根系上的土壤），取樣時(shí)，將幼苗根部挖開(kāi)，小心的用刷子刷下根上附著的土樣，取完后再將根部埋好，確保根部的完整性。并使用土壤養(yǎng)分測(cè)定儀對(duì)其速效N、P和K 3種元素進(jìn)行測(cè)定。

⑥病害鑒定 使用植物DNA提取試劑盒提取植物的總DNA，利用雙生病毒通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

擴(kuò)增引物：PF-TAATATTACCKGWKGVCCSC；PR-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA。

擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性4 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，變性到延伸34個(gè)循環(huán)，最后72℃，10 min。

⑦病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 育苗后70 d按照TYLCD病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行病害嚴(yán)重度以及生防效果的計(jì)算。

病害嚴(yán)重度（%）=[∑（發(fā)病植株數(shù)×病級(jí)數(shù)）/（總植株數(shù)×最高病級(jí)數(shù)）]×100%。

生防效果（%）=[（對(duì)照病害嚴(yán)重度-處理病害嚴(yán)重度）/對(duì)照病害嚴(yán)重度]×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS軟件統(tǒng)計(jì)分析，采用LSD法進(jìn)行多重比較，于5%顯著水平下檢驗(yàn)各處理平均值間的差異顯著性（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄病害的鑒定以及生防效果測(cè)定

使用植物DNA提取試劑盒提取田間番茄病葉的總DNA，利用雙生病毒通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增出660 bp左右長(zhǎng)度的片段，經(jīng)鑒定為番茄黃化曲葉病毒（圖1）。據(jù)病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)田間病害發(fā)生情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分級(jí)，最后計(jì)算出處理組的生防效果。結(jié)果顯示，刺狀無(wú)梗囊霉XJ27對(duì)番茄黃化曲葉病毒病有一定的生防效果，防效為50.44%（表1）。

2.2 AM真菌對(duì)移栽番茄的促生作用

菌根苗移栽后50 d，刺狀無(wú)梗囊霉處理組的番茄存活率、株高、莖粗以及葉片數(shù)均顯著高于對(duì)照組（表2），表明刺狀無(wú)梗囊霉XJ27對(duì)番茄具有一定的促生作用。

2.3 AM真菌對(duì)土壤營(yíng)養(yǎng)元素的影響

番茄移栽后50 d，測(cè)定其根圍土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的變化情況。試驗(yàn)結(jié)果顯示，AM真菌處理組顯著增加了土壤中有效P的含量，增加了有效K的含量（表3）。

3 討論與結(jié)論

TYLCV 已成為全球番茄種植的巨大威脅。檢測(cè)植株體內(nèi)病毒的含量有利于了解病毒的發(fā)生、流行動(dòng)態(tài)，為控制其蔓延打下基礎(chǔ)。目前，常用于檢測(cè)TYLCV的方法有生物學(xué)檢測(cè)法、血清學(xué)檢測(cè)法和分子生物學(xué)檢測(cè)法等。Martinez-Culebras等[6]設(shè)計(jì)了2對(duì)病毒引物，其中一對(duì)可以同時(shí)檢測(cè)到 TYLCV 和 TYLCSV，另一對(duì)卻只能檢測(cè)到 TYLCSV，因此這2對(duì)引物可以用于區(qū)別TYLCV 和 TYLCSV。

本試驗(yàn)中根據(jù)番茄前期病株癥狀，初步判定為病毒病害。隨后采樣，根據(jù)雙生病毒基因組的DNA特征，設(shè)計(jì)針對(duì)該種病毒的特異性引物，使其只能檢測(cè)該種病毒，最終確定該病毒為T(mén)YLCV。

最近10 a中，AM真菌被發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)植物抵御植株地上部病害[7～9]，因此當(dāng)前AM真菌已經(jīng)作為一種代替化學(xué)農(nóng)藥及殺蟲(chóng)劑的生物肥料及農(nóng)藥來(lái)研究[10～12]，為其在可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展應(yīng)用中提供了理論依據(jù) 。有研究發(fā)現(xiàn)，使用分根系統(tǒng)，AM真菌對(duì)不同的病原物都具有誘導(dǎo)其產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的能力。但是AM真菌的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病不僅僅局限于根系，F(xiàn)ritz 等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，AM真菌對(duì)番茄葉部病害同樣具有抗性。研究認(rèn)為，菌根植物表現(xiàn)出抗性主要表現(xiàn)為昆蟲(chóng)拒食素的積累[14]、抗病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[15]、分泌更多的揮發(fā)性物質(zhì)，吸引蚜蟲(chóng)的天敵寄生蜂[16]。因此，推測(cè)AM真菌減輕病害發(fā)生程度主要是因?yàn)锳M真菌在與植物的共生過(guò)程中，誘導(dǎo)植物地上部產(chǎn)生系統(tǒng)防御，或是誘導(dǎo)植物植株地上部分泌出某些物質(zhì)，從而抑制了煙粉虱的傳毒過(guò)程。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，AM真菌可以提高番茄植株對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的利用率，這與前人的研究結(jié)果相符。其原理是AM真菌活化了土壤中的難溶營(yíng)養(yǎng)元素，使這些元素更易于被植株轉(zhuǎn)運(yùn)利用。本研究首次發(fā)現(xiàn)AM真菌對(duì)番茄黃化曲葉病毒病具有一定的生防效果，但是對(duì)其內(nèi)在的機(jī)理還需進(jìn)行深入研究。

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Abstract： We inoculated AMF XJ27 screened out in previous experiments on tomato seedlings， and transplanted them to the field. After 30 days， we analyzed the biomass data of different treatments. The results showed that AMF treatment had increased the biomass and survival rate of tomato. We also tested the leaf sample of disease plants， and it was diagnosed as tomato yellow leaf curl disease （TYLCD）. After the determination of disease severity， the results showed that AMF XJ27 had a certain biocontrol effect on tomato yellow leaf virus disease， which was 50.44%.

Key words： Acaulospora spinosa； Growth promoting effect； Tomato yellow leaf curl disease