寧豫昌　喬宏興　潘春梅　張曉靜

摘要：采用HPLC對(duì)發(fā)酵前后的絞股藍(lán)皂苷（Gvpenoside）進(jìn)行了分析，選用75只健康小鼠，隨機(jī)分為陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組、低劑量試驗(yàn)組、中劑量試驗(yàn)組、高劑量試驗(yàn)組共5個(gè)處理組，每組5只小鼠，3個(gè)重復(fù)。陰性對(duì)照組每日灌服0.5mL生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組每日灌服0.5mL未發(fā)酵的絞股藍(lán)皂苷溶液，3個(gè)試驗(yàn)組分別每日灌服發(fā)酵的絞股藍(lán)皂苷溶液0.2、0.5、0.8mL，連續(xù)灌服10d。結(jié)果表明，HPLC分析顯示，經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵后的絞股藍(lán)皂苷成分發(fā)生了明顯變化，且與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)發(fā)酵的絞股藍(lán)皂苷能夠顯著提高小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)（P<0.05），同時(shí)還能顯著提高小鼠血清中IgG和IgA的含量（P<0.05），對(duì)小鼠血清中IL-2的產(chǎn)生也有一定的促進(jìn)作用。說(shuō)明枯草芽孢桿菌對(duì)絞股藍(lán)皂苷具有一定的生物轉(zhuǎn)化作用，且經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化后的絞股藍(lán)皂苷具有促進(jìn)小鼠免疫器官發(fā)育和增強(qiáng)體液免疫的功效。

關(guān)鍵詞：絞股藍(lán)皂苷；枯草芽孢桿菌；發(fā)酵；小鼠；免疫功能

中圖分類號(hào)：R285.5；R593 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）09-2304-04

絞股藍(lán)[Gynostemmapentaphyllum（Thunb.）Makion]為葫蘆科（Cucurbitaceae）絞股藍(lán)屬（Gyuos-temma）植物，在動(dòng)物醫(yī)學(xué)上具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、鎮(zhèn)靜止痛等作用。藥理學(xué)研究表明，絞股藍(lán)含有多種化學(xué)成分，其中以絞股藍(lán)皂苷為主要的藥理活性物質(zhì)。近年來(lái)。隨著中藥制劑研究的不斷深入。國(guó)內(nèi)開(kāi)展了利用微生物發(fā)酵技術(shù)對(duì)中草藥有效成分進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化作用的研究，但是目前國(guó)內(nèi)關(guān)于絞股藍(lán)皂苷微生物轉(zhuǎn)化作用的研究尚不多見(jiàn)，如陳良華等的研究表明，黑曲霉可對(duì)絞股藍(lán)皂苷進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。且轉(zhuǎn)化后的成分具有抗癌活性：樸香蘭等的研究證明，經(jīng)保加利亞乳桿菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化后的絞股藍(lán)皂苷較轉(zhuǎn)化前具有更強(qiáng)的抗癌活性。但是，上述研究均未表明絞股藍(lán)皂苷經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化后，其轉(zhuǎn)化成分是否還具有諸如增強(qiáng)免疫器官指數(shù)和體液免疫水平等其他的生物學(xué)特性。因此，本研究將以絞股藍(lán)皂苷為底物，利用微生物對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵，并檢測(cè)發(fā)酵后的絞股藍(lán)皂苷對(duì)小鼠的各項(xiàng)免疫功能具有何種作用，從而為微生物發(fā)酵絞股藍(lán)在畜牧業(yè)上的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

絞股藍(lán)原藥購(gòu)自河南順康醫(yī)藥有限責(zé)任公司：發(fā)酵用菌種為河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存的枯草芽孢桿菌，

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 絞股藍(lán)皂苷的提取與發(fā)酵 用粉碎機(jī)將適量的絞股藍(lán)粉碎，以25倍量（m/v）的75%乙醇溶液80℃提取2h，將提取液過(guò)濾并減壓濃縮成浸膏狀，將浸膏用適量蒸餾水懸浮，在梨形分液漏斗中用正丁醇萃取3次，萃取液減壓濃縮后再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到干燥的絞股藍(lán)皂苷發(fā)酵底物。將絞股藍(lán)皂苷發(fā)酵底物按3%比例加入液體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基（葡萄糖1.0g，KH₂PO₄1.0g，蛋白胨5.0g，MgSO₄·7H₂O0.5g，蒸餾水1000mL），經(jīng)高壓蒸汽滅菌后備用。將枯草芽孢桿菌按5%接種到上述培養(yǎng)基，于37℃靜置培養(yǎng)4d。

1.2.2 絞股藍(lán)皂苷發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC檢測(cè) 發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液10000r/min離心5min，取上清液用等體積的飽和正丁醇萃取3次，所得有機(jī)溶劑在45℃減壓濃縮得殘留物，將殘留物中加入2mL甲醇，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。分別將絞股藍(lán)皂苷發(fā)酵后的提取物與未發(fā)酵的絞股藍(lán)皂苷進(jìn)行HPLC分析。HPLC的分析條件為，色譜柱：PhenomexC₁₈柱（250min×4.6min×5μm）；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203nm；進(jìn)樣量20μL；流速1.0mL/min；流動(dòng)相為水（A）/乙腈（B）梯度洗脫：洗脫程序如表1所示。

1.2.3 絞股藍(lán)皂苷發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響75只體重20g左右的健康小鼠，平均隨機(jī)分為5組，每組5只小鼠，3個(gè)重復(fù)。分別為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量試驗(yàn)組、中劑量試驗(yàn)組、高劑量試驗(yàn)組，其中陰性對(duì)照組每只小鼠每日灌服0.5mL生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組每只小鼠每日灌服未經(jīng)發(fā)酵的絞股藍(lán)皂苷溶液f絞股藍(lán)皂苷：水：1：1，V：V）0.5mL。低劑量、中劑量和高劑量試驗(yàn)組每只小鼠每日灌服經(jīng)過(guò)發(fā)酵的絞股藍(lán)皂苷溶液0.2、0.5、0.8mL，各組小鼠連續(xù)灌服10d，常規(guī)飼養(yǎng)管理。試驗(yàn)期結(jié)束后24h，將各組小鼠摘眼球采血處死。利用精密電子天平稱量體重后，分別摘取脾臟和胸腺并稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)（脾臟重/體重）和胸腺指數(shù)（胸腺重/體重）。

1.2.4 絞股藍(lán)皂苷發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)小鼠體液免疫因子的影響 上述各組小鼠摘眼球采血后，將血液離心獲得血清，分別測(cè)定各組小鼠血清中的IgG、IgA、IL-2含量，具體方法按照各相應(yīng)的ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.5

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 絞股藍(lán)皂苷發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC檢測(cè)

由圖1可知，未經(jīng)發(fā)酵的絞股藍(lán)皂苷只在26.0min和28.0min處有2個(gè)峰，而經(jīng)過(guò)枯草芽孢桿菌B9株發(fā)酵作用的絞股藍(lán)皂苷，其26.0min和28.0min處的2個(gè)峰面積明顯減小，并且在29.9-35.2min之間出現(xiàn)了6個(gè)新的峰，說(shuō)明枯草芽孢桿菌對(duì)絞股藍(lán)皂苷具有明顯的生物轉(zhuǎn)化作用。

2.2 絞股藍(lán)皂苷發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

由表2可知，各試驗(yàn)組的脾臟指數(shù)均大于陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，其中低劑量試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組間的差異不顯著，而中劑量試驗(yàn)組和高劑量試驗(yàn)組相比陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組均差異顯著（P<0.05），高劑量試驗(yàn)組的脾臟指數(shù)亦顯著大于中劑量試驗(yàn)組（P<0.05）。各試驗(yàn)組的胸腺指數(shù)均顯著大于陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.05）。各試驗(yàn)組中，中劑量試驗(yàn)組和高劑量試驗(yàn)組的胸腺指數(shù)顯著高于低劑量試驗(yàn)組（P<0.05）。高劑量試驗(yàn)與中劑量試驗(yàn)組差異不顯著。結(jié)果表明，相比發(fā)酵前的絞股藍(lán)皂苷，絞股藍(lán)皂苷發(fā)酵產(chǎn)物能夠提高小鼠的免疫器官指數(shù)，且作用效果與濃度間呈正相關(guān)。

2.3 絞股藍(lán)皂苷發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)小鼠體液免疫因子的影響

由表3可見(jiàn)，相比陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，中劑量和高劑量的發(fā)酵絞股藍(lán)皂苷均能顯著提高小鼠血清中的IgG和IgA含量（P<0.05），但中劑量試驗(yàn)組與高劑量試驗(yàn)組間的IgG和IgA含量無(wú)顯著差異：小鼠血清中的IL-2含量在各處理組間均無(wú)顯著差異，但是可以看出，各試驗(yàn)組小鼠血清中的IL-2含量仍然高于陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。結(jié)果表明。中、高劑量的絞股藍(lán)皂苷發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)小鼠的體液免疫具有促進(jìn)作用。

3 討論

3.1 絞股藍(lán)皂苷發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析

研究表明，微生物能夠分泌產(chǎn)生各種活性較強(qiáng)的胞外酶系，如蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、纖維素酶、糖苷酶等，利用微生物豐富的胞外酶，人們廣泛地開(kāi)展了中草藥的微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化研究，證明微生物可以將中草藥中的某些有效成分作為前體，通過(guò)酶的作用轉(zhuǎn)化為新的代謝產(chǎn)物。王明君等利用朱紅密孔菌將香草酸轉(zhuǎn)化生成了香草醛。嚴(yán)梅楨等研究證明，黃芩經(jīng)腸道微生物轉(zhuǎn)化后，生成了新的活性成分，其體內(nèi)和體外的抑菌活性均得到提高。絞股藍(lán)皂苷是絞股藍(lán)中主要的藥用成分，與人參皂苷同屬達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷，目前關(guān)于人參皂苷的微生物轉(zhuǎn)化研究進(jìn)行的比較深入，研究證實(shí)微生物轉(zhuǎn)化人參皂苷的主要機(jī)理是微生物以皂苷側(cè)鏈上的糖基為碳源，通過(guò)酶的水解作用減少或切除皂苷分子中的糖鏈，從而獲得一系列低分子量的皂苷或苷元。但是，目前關(guān)于絞股藍(lán)皂苷的微生物轉(zhuǎn)化研究剛剛起步，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的對(duì)絞股藍(lán)皂苷具有轉(zhuǎn)化作用的微生物有黑曲霉和保加利亞乳桿菌，本研究中，利用實(shí)驗(yàn)室保存的豬源枯草芽孢桿菌B9株作為發(fā)酵菌種對(duì)絞股藍(lán)皂苷進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)HPLC分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)發(fā)酵的絞股藍(lán)皂苷原有的2個(gè)吸收峰面積明顯降低，并且有新的吸收峰產(chǎn)生，說(shuō)明枯草芽孢桿菌B9株對(duì)絞股藍(lán)皂苷也有明顯的生物轉(zhuǎn)化作用，但其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

3.2 絞股藍(lán)皂苷發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

胸腺是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)重要的中樞免疫器官，是哺乳動(dòng)物T淋巴細(xì)胞分化成熟的場(chǎng)所，脾臟則是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)最大的外周免疫器官，參與全身的體液免疫和細(xì)胞免疫，因此，胸腺和脾臟對(duì)于維持機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫具有重要作用，它們的功能狀態(tài)直接影響到機(jī)體免疫水平的高低。Rivas等的研究證明，胸腺和脾臟在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)所占的相對(duì)重量可以非常直觀的反映出機(jī)體內(nèi)細(xì)胞免疫和體液免疫狀態(tài)的好壞：康佳的研究表明，超微發(fā)酵的絞股藍(lán)能夠明顯提高小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，本研究表明，相比未發(fā)酵的絞股藍(lán)皂苷，經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵的絞股藍(lán)皂苷，即便是較低的濃度，均能夠提高小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，且其作用效果與其濃度間有量效關(guān)系。說(shuō)明相比未發(fā)酵的絞股藍(lán)皂苷，經(jīng)過(guò)發(fā)酵的絞股藍(lán)皂苷，在促進(jìn)免疫器官發(fā)育方面的藥效得到了明顯提高，這與康佳的研究類似。

3.3 絞股藍(lán)皂苷發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)小鼠體液免疫因子的影響

IgG是哺乳動(dòng)物體液內(nèi)最主要的免疫球蛋白，約占血液中免疫球蛋白總量的70%-75%，其在激活補(bǔ)體、增強(qiáng)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，以及中和病毒與細(xì)菌毒素等方面發(fā)揮著重要作用。IgA在健康動(dòng)物體液中的含量?jī)H次于IgG，具有IgG的某些功能，主要在黏膜免疫中發(fā)揮作用。IL-2即白細(xì)胞介素-2，是免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的重要介質(zhì)，能夠刺激T淋巴細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)周期，并能促使B淋巴細(xì)胞增殖和產(chǎn)生免疫球蛋白，此外還具有促進(jìn)T淋巴細(xì)胞殺傷活力、增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性等多種免疫調(diào)節(jié)功能。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵的絞股藍(lán)皂苷具有顯著地調(diào)節(jié)機(jī)體體液免疫功能的作用，能有效提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力。試驗(yàn)中，相比陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，各試驗(yàn)組均能不同程度地提高小鼠血清中IgG和IgA的水平，其中中劑量試驗(yàn)組和高劑量試驗(yàn)組的作用效果更加顯著：相比對(duì)照組，各試驗(yàn)組對(duì)IL-2水平的提高作用雖然并不顯著。但仍有一定效果。試驗(yàn)說(shuō)明，相比未經(jīng)發(fā)酵的絞股藍(lán)皂苷，微生物發(fā)酵后的絞股藍(lán)皂苷對(duì)于小鼠體液免疫的提高具有一定的促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

枯草芽孢桿菌對(duì)絞股藍(lán)皂苷具有一定的生物轉(zhuǎn)化功能，且經(jīng)過(guò)微生物轉(zhuǎn)化的絞股藍(lán)皂苷，對(duì)動(dòng)物機(jī)體的免疫器官發(fā)育和體液免疫因子生成均具有一定的促進(jìn)作用。