王珂珂 王威 謝倩 陳清西

摘要：比較了4種栽培模式下鐵皮石斛提取物的抗氧化活性，為鐵皮石斛的栽培進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。用煎煮法回流提取了4種栽培模式鐵皮石斛，濃縮凍干得到鐵皮石斛提取物，以抗壞血酸（Vc）為對照，分別測定了提取物的清除DPPH自由基、羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O-2）能力。結(jié)果表明：4種栽培模式下鐵皮石斛提取物均具有不同程度的抗氧化活性，且抗氧化活性與提取物質(zhì)量濃度呈量效關(guān)系。林下床栽鐵皮石斛提取物的·OH清除活性（IC50值為4.329 mg/mL）在4種栽培模式中最好；林下附生鐵皮石斛提取物的DPPH（IC50值為4.494 mg/mL）和O-2（IC50值為2.773 mg/mL）清除能力在4種栽培模式中均最強，且林下附生鐵皮石斛提取物的O-2清除活性于對照抗壞血酸（Vc）的IC50值與無顯著性差異。結(jié)論：鐵皮石斛提取物可以抑制抗氧化活性，且林下仿野生栽培鐵皮石斛的抗氧化活性優(yōu)于大棚床栽。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；提取物；抗氧化活性

中圖分類號：R284

文獻標識碼：A 文章編號：16749944（2016）09000403

1 引言

生物體內(nèi)的活性氧自由基，在一般情況下處于平衡狀態(tài)，但自由基處于輻射或化學物質(zhì)誘導等情況下，會造成平衡狀態(tài)的缺失。此時生物體的各種疾病就會出現(xiàn)[1～3]。目前抗氧化劑分為化學合成抗氧化劑和天然食品抗氧化劑，以天然食品為原材料的抗氧化劑因健康、無毒而成為當前抗氧化劑發(fā)展的主要趨勢[4]。鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）植物，為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有藥用價值高，市場需求大等特點[5]。但野生鐵皮石斛資源早在20世紀80年代已非常稀缺，被列為國家重點保護的瀕危藥用植物，因此當前鐵皮石斛主要來源于人工栽培[6，7]。鐵皮石斛人工栽培模式主要分為林下仿野生栽培、大棚設(shè)施栽培、盆栽等系列栽培模式[8，9]。同時，不同栽培模式鐵皮石斛的生長環(huán)境存在一定的差異性[11]，但目前關(guān)于鐵皮石斛栽培模式與抗氧化活性方面的比較尚未深入研究。因此本試驗以4種栽培模式下鐵皮石斛為材料制備提取物，研究林下附生、林下床栽、林下懸掛3種仿野生栽培模式與大棚栽培模式下的鐵皮石斛提取物體外抗氧化活性的差異，以明確鐵皮石斛抗氧化活性的最佳栽培模式，為鐵皮石斛的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料、試劑與儀器

2.1.1 材料

試驗設(shè)在漳州揚基生物科技有限公司的龍眼果場與設(shè)施大棚內(nèi)進行。選擇同一來源，同一批次，同一品種的鐵皮石斛組培苗，于溫室內(nèi)馴化1年，2013年7月選取長勢一致、健康、無病蟲害、飽滿的鐵皮石斛幼苗分別移植于龍眼樹下和大棚內(nèi)，栽培模式詳見表1。于2015年3月采收樣品，并去除葉片、根和葉鞘，鮮莖置-20 ℃冰箱備用。

2.1.2 試劑

二苯代苦味酰基自由基（DPPH）、鄰苯三酚、鄰二氮菲，硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、H2O2等試劑均為均為國產(chǎn)分析純。

2.1.3 儀器與設(shè)備

TU-1810 紫外可見光分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；AKWL-IV-50 艾柯超純水系統(tǒng)（成都康氏康寧科技發(fā)展有限公司）；BS214D電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；臺式離心機（美國 Kendro 儀器公司）；DK-S24型電熱恒溫水浴箱（上海景宏試驗設(shè)備有限公司）；N1001 EYELA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；奧立龍 Model868 型酸度計（北京長風儀器儀表公司）。

2.2 方法

2.2.1 提取物的制備

取鐵皮石斛鮮莖，洗凈后剪段并精密稱量置于500 mL燒杯中，按1∶2（m/V）料液比加入蒸餾水浸泡1 h，加熱回流2 h，同樣的方法提取2次，合并提取液，離心（3500 r/min，10 min，2次），取上清液減壓濃縮，隨后真空冷干，置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 鐵皮石斛抗氧化性的測定

將鐵皮石斛提取物及Vc標準品（陽性對照）分別配制成濃度為2、4 mg/mL、6、8、10、12、14、16 mg/mL的樣品液，用于抗氧化活性測定。

參照黃琴等[12]的方法測定鐵皮石斛提取物對DPPH、·OH自由基清除活性，并計算IC50值（當清除率為50%時的樣品濃度）；參照Sarikurkcu C等[13]的方法測定鐵皮石斛提取物對O-2自由基清除活性，并計算IC50值（當清除率為50%時的樣品濃度）。所有試驗平行測定3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010整理、統(tǒng)計、做圖；使用SPSS 17.0對組間數(shù)據(jù)進行單因素試驗分析及處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 鐵皮石斛清除DPPH自由基活性的評價

由圖1可知，3種林下仿野生栽培模式在濃度為2～8 mg/mL時，對鐵皮石斛提取物清除DPPH自由基能力的趨勢線相近；在濃度為8～16 mg/mL時林下附生鐵皮石斛提取物清除DPPH自由基能力的上升趨勢加快，并大于其他2種林下仿野生栽培模式。同時隨著濃度增加，4種栽培模式下鐵皮石斛提取物清除DPPH自由基能力與Vc的差距逐漸減小，在16 mg/mL時，鐵皮石斛提取物于Vc相近，并接近飽和。其中林下附生鐵皮石斛提取物清除DPPH自由基的效果最好，大棚床栽鐵皮石斛最差。

3.2 鐵皮石斛清除羥基自由基活性的評價

羥自由基是最強的氧化劑之一，在活性氧中其具有化學性質(zhì)活潑，壽命短，反應強等特點?？梢院偷鞍踪|(zhì)、核酸等發(fā)生反應，并損傷生物體，引起癌癥等疾病。因此清除·OH是對抗疾病的有效手段之一。

由圖2可知，4種栽培模式下的鐵皮石斛提取物對·OH有不同程度的清除作用，其清除能力隨石斛濃度的增大而增強，呈現(xiàn)顯著的量效關(guān)系。在濃度為8 mg/mL時，林下附生和林下床栽鐵皮石斛提取物顯示了較強的清除·OH能力，其清除能力分別達到了83.43%、84.08%， 而林下懸掛和大棚床栽只達到了63.37%和64.03%的清除活性。且林下附生和林下床栽的穩(wěn)定性比Vc要好，在10 mg/mL時清除能力達到飽和。

3.3 鐵皮石斛清除超氧陰離子活性的評價

O-2是生物體內(nèi)主要的自由基之一，其經(jīng)過一系列反應后能生成其他的氧自由基，從而引起細胞膜結(jié)構(gòu)及功能的改變。

由圖3可知，4種栽培模式下鐵皮石斛提取物對O-2均具有促進氧化作用，且隨濃度的變化氧化作用不斷升高。同時，不同栽培模式下鐵皮石斛提取物的氧化效果有一定的差異，林下附生鐵皮石斛提取物的氧化效果最好，在8 mg/mL時已接近飽和，其氧化效果等同于Vc對照；林下床栽、林下懸掛和大棚床栽鐵皮石斛提取物分別在12 mg/mL、16 mg/mL和16 mg/mL時與Vc對照達到無顯著性差異。同時在濃度為2～10 mg/mL時，林下懸掛鐵皮石斛提取物的氧化效果高于林下床栽；在濃度為10～16 mg/mL時，林下床栽鐵皮石斛提取物的氧化效果高于林下懸掛鐵皮石斛提取物。

3.4 抗氧化活性的IC50值

由表2可知，在4種栽培模式下鐵皮石斛提取物的清除DPPH、·OH、O-2自由基等抗氧化試驗中，鐵皮石斛提取物對清除DPPH的IC50從大到小為林下附生>林下床栽>林下懸掛>大棚床栽；對清除·OH的IC50從大到小為林下床栽>林下附生>大棚床栽>林下懸掛；對清除O-2的IC50從大到小為林下附生>林下懸掛>林下床栽>大棚床栽。同時，林下附生鐵皮石斛提取物對清除O-2的IC50值與Vc對照無顯著性差異。但總的來說，4種栽培模式下鐵皮石斛提取物的抗氧化活性要弱于Vc對照。

4 討論

本試驗結(jié)果表明，鐵皮石斛提取物在一定的濃度下具有較好的抗氧化活性。其中林下附生鐵皮石斛提取物的還原性最好，對清除DPPH、O-2自由基的效果最佳，其IC50分別為3.402 mg/mL、4.494 mg/mL、2.773 mg/mL；林下床栽鐵皮石斛提取物對清除·OH的效果最好，其IC50為4.329 mg/mL。同時，已有研究表明，鐵皮石斛多糖[14]、鐵皮石斛花[15]、鐵皮石斛極性提取物[16]對DPPH、·OH自由基及還原力等均表現(xiàn)出較強的抗氧化能力，這與本文的結(jié)果一致，表明鐵皮石斛提取物的抗氧化活性能夠替代人工合成的抗氧化劑。

在4種栽培模式下鐵皮石斛提取物對體外抗氧化活性研究中，發(fā)現(xiàn)林下仿野生栽培鐵皮石斛提取物的抗氧化活性優(yōu)于大棚設(shè)施栽培，尤其是林下附生和林下床栽的栽培模式。這可能一方面是林下仿野生栽培模式具有光照充足、通風、透氣性好等特點；另一方面龍眼樹皮及周圍布滿大量的苔蘚，加強了龍眼樹對雨露的截留和長效保持的能力，同時提供鐵皮石斛的肥料來源[17]。但大棚床栽的栽培模式，其氧化活性穩(wěn)定，可能與大棚床栽的地理位置方便，利于定期施肥、噴水管理，而其他3種林下立體栽培模式地處基地，需要來往查探，不便于隨時管理。因此對鐵皮石斛的栽培如何進一步研究，以提高大棚和林下栽培的鐵皮石斛品質(zhì)具有重要意義。

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