楊文婧　趙瑞力

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·基礎(chǔ)研究·

Dermol與N-cadherin在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究

楊文婧趙瑞力＊

【摘要】目的探討喉鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)組織中Dermol與N-cadherin的表達(dá)及意義。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)Dermol與N-cadherin在48例LSCC組織及30例癌旁正常組織中的表達(dá)情況，分析它們?cè)诓煌M織中的相互關(guān)系及與LSCC臨床參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果Dermol、N-cadherin在LSCC中的陽性表達(dá)率分別為58.33%和75.00%，高于喉正常黏膜的16.67%和40.00% (P<0.05)；Dermol、N-cadherin在LSCC中的陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N+組高于N0組，P<0.05)、臨床分期(Ⅲ、Ⅳ期高于Ⅰ、Ⅱ期，P<0.05)相關(guān)；而與腫瘤病理學(xué)分級(jí)、臨床分型及年齡分組無關(guān)(P>0.05)。LSCC中Dermol的陽性表達(dá)與N-cadherin的陽性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.390，P=0.016)。結(jié)論Dermol與N-cadherin在LSCC發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，Dermol與N-cadherin的協(xié)同作用可能影響LSCC的轉(zhuǎn)移。(中國眼耳鼻喉科雜志，2016，16：88-91)

【關(guān)鍵詞】喉鱗狀細(xì)胞癌；Dermol；N-cadherin；免疫組織化學(xué)

喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)在喉癌中最為多見，具有較高的侵襲性，發(fā)生局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的能力較強(qiáng)[1]。堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)家族因子參與了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系。Dermol(也稱為Twist2)屬于bHLH蛋白家族成員。國外有研究[2]發(fā)現(xiàn)，Dermol蛋白在頭頸部腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并與N-cadherin協(xié)同作用誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的發(fā)生。Dermol在LSCC中的表達(dá)研究尚屬空白。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)LSCC組織中Dermol和N-cadherin的表達(dá)，探討兩者的表達(dá)與LSCC發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1資料與方法

1.1資料收集LSCC組織48例及癌旁安全切緣1 cm以上正常組織30例，來自于本院耳鼻喉科2010年2月～2013年3月LSCC手術(shù)切除的標(biāo)本和手術(shù)切除的癌旁正常組織(均經(jīng)病理檢查證實(shí))。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過。所有LSCC患者術(shù)前都未行放、化療，臨床資料完整。LSCC病例中，高分化13例、中分化19例、低分化16例；Ⅰ、Ⅱ期(早期)18例，Ⅲ、Ⅳ期(晚期)30例；聲門上型17例、聲門型31例。年齡41～80歲，中位年齡60.2歲。喉癌患者中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者24例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者24例。

1.2方法

1.2.1主要試劑Dermol鼠單克隆抗體(Twist2C1a)(sc-81417, Santa Cruz Biotechnology Inc)；N-cadherin鼠單克隆抗體(ZM-0094,北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)；鼠二抗免疫組織化學(xué)試劑盒(SP-9002，北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液 (ZLI-9032，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2.2免疫組織化學(xué)S-P方法所選標(biāo)本均制成石蠟標(biāo)本，4 μm連續(xù)切片。一抗所選濃度：Dermol鼠單克隆抗體為1∶100，N-cadherin鼠抗人單克隆抗體為1∶50。采用免疫組織化學(xué)S-P法，嚴(yán)格遵守操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。設(shè)置磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對(duì)照，為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)；癌旁正常組織為正常對(duì)照組。

1.3結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)Dermol、N-cadherin蛋白陽性著色位于細(xì)胞質(zhì)，出現(xiàn)片狀或顆粒狀的胞質(zhì)或胞核呈棕褐色的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。結(jié)果采用半定量記分法判定[3]，按陽性著色程度評(píng)分：0分為無著色；1分為淺黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。再按陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分：0分為陰性；1分為<10%；2分為11%～50%；3分為51%～75%；4分為>75%。用兩者的乘積來判定結(jié)果：4～12分定為陽性，4分以下定為陰性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理得出數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理，并應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Dermol和N-cadherin在LSCC及癌旁組織中的表達(dá)Dermol蛋白表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕褐色。Dermol在LSCC組織中呈高表達(dá)，在癌旁組織中呈低表達(dá)或不表達(dá)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)：48例LSCC組織中Dermol的陽性表達(dá)率為58.33%(28/48)，30例癌旁正常組織的陽性表達(dá)率為16.67%(5/30)，前者明顯高于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.131，P<0.01)(圖1～2，表1)。

N-cadherin陽性著色呈淺黃至棕黃色，小片狀或彌漫性分布于細(xì)胞質(zhì)中。N-cadherin的高表達(dá)出現(xiàn)在LSCC組織中，中、低表達(dá)或不表達(dá)出現(xiàn)于癌旁正常組織中。免疫組織化學(xué)檢測(cè)：48例LSCC組織中N-cadherin的陽性表達(dá)率為75.00%(36/48)，30例癌旁正常組織的陽性表達(dá)率為40.00%(12/30)。LSCC組織高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.555，P<0.01)(圖3～4、表1)。

圖1.　Dermol在正常組織中呈陰性表達(dá)(IHC 400×)

圖2.　Dermol在LSCC組織中呈陽性表達(dá)(IHC 400×)

圖3.　N-cadherin在正常組織中呈陰性表達(dá)(IHC 400×)

圖4.　N-cadherin在LSCC組織中呈陽性表達(dá) (IHC 400×)

組別nDermol+-P值N-cadherin+-P值正常組織30525LSCC組織4828200.000121836120.000

2.2LSCC中Dermol、N-cadherin的表達(dá)及與LSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

1)在LSCC組織中，Dermol在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；N-cadherin在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

2)根據(jù)TMN分期，Dermol在Ⅰ、Ⅱ期(早期)病例組的陽性表達(dá)率低于Ⅲ、Ⅳ期(晚期)病例組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ；N-cadherin在Ⅰ、Ⅱ期(早期)病例組的陽性表達(dá)率低于Ⅲ、Ⅳ期(晚期)病例組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2　Dermol和N-cadherin與LSCC臨床參數(shù)的相關(guān)性

3)Dermol和N-cadherin在高分化LSCC中的陽性表達(dá)率與在中、低分化LSCC中的陽性表達(dá)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

4)Dermol與N-cadherin在聲門上型LSCC的陽性表達(dá)率與在聲門型LSCC的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表2)。

5)以60周歲為分界線，Dermol與N-cadherin在年齡分組中比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表2)。2.3Dermol和N-cadherin在LSCC中的相關(guān)性經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，兩者表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.390，P=0.016) (表3)。

表3　LSCC組織中Dermol和N-cadherin表達(dá)的相關(guān)性

3討論

EMT在惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，是腫瘤發(fā)展過程中的關(guān)鍵程序之一。Twist1、Dermol同屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族,在不同的種屬之間其核苷酸和氨基酸序列高度保守。Dermol是在使用E12作為引物的一種雙酵母雜交體中首次被發(fā)現(xiàn)的，由于它的表達(dá)模式是在老鼠胚胎的真皮組織中，所以稱為Dermol[4]。后來由于Dermol與Twist1的高度同源和表達(dá)模式的重疊性被命名為Twist2。目前有研究[5]表明，Twist1可以誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。Dermol與Twist1高度同源，可能具有與Twist1相似的誘導(dǎo)EMT發(fā)生的作用。Dermol在乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、甲狀腺癌及肝癌中表達(dá)上調(diào)在國內(nèi)外已有相關(guān)報(bào)道[6-13]。目前在對(duì)頭頸部LSCC患者的研究中發(fā)現(xiàn)，Dermol通過EMT、抑制細(xì)胞凋亡有助于頭頸部LSCC的侵襲[2]。但其在LSCC中的表達(dá)研究罕見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示： Dermol在LSCC組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，且其表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N+組高于N0組)、臨床分期(Ⅲ、Ⅳ期高于Ⅰ、Ⅱ期)中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與腫瘤病理學(xué)分級(jí)、臨床分型及年齡分組無關(guān)(P>0.05)。由此可推斷，Dermol高表達(dá)的LSCC組織具有更強(qiáng)的侵襲能力。Dermol可能成為判斷LSCC預(yù)防或預(yù)后的檢測(cè)指標(biāo)之一。

N-cadherin表達(dá)異常是EMT過程中的重要分子事件。在上皮組織中，N-cadherin的異位表達(dá)影響了上皮細(xì)胞的行為及形態(tài)，誘導(dǎo)上皮組織向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，即產(chǎn)生EMT。目前的研究發(fā)現(xiàn)，N-cadherin在腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[14]、前列腺癌[15]及乳腺癌[16]中表達(dá)上調(diào)，協(xié)同E-cadherin表達(dá)下調(diào)在腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移方面起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，LSCC中N-cadherin陽性表達(dá)明顯高于癌旁正常組織；LSCC的轉(zhuǎn)移、侵襲能力越高，N-cadherin的陽性表達(dá)率越高，也同樣證實(shí)了N-cadherin與LSCC的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，此研究結(jié)果與國內(nèi)外研究結(jié)果一致。

綜上所述，通過對(duì)EMT機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，Dermol形成Twist1/Twist2/Mi2/NuRD蛋白復(fù)合物，其與E-box的啟動(dòng)子結(jié)合，下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，導(dǎo)致了EMT的發(fā)生。在E-cadherin表達(dá)減少的區(qū)域，N-cadherin 的表達(dá)明顯增多。由此一些學(xué)者[17-18]認(rèn)為，可能存在E-cadherin向N-cadherin轉(zhuǎn)化，從而使細(xì)胞由良性轉(zhuǎn)化為浸潤性的惡性表型。這同樣可能是LSCC侵襲和轉(zhuǎn)移的途徑之一。本研究結(jié)果同時(shí)顯示：Dermol的陽性表達(dá)率越高，N-cadherin的陽性表達(dá)率越高，LSCC的侵襲、轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)，Dermol蛋白表達(dá)與N-cadherin的表達(dá)之間存在明顯正相關(guān)(r=0.390,P=0.016)。由此可推測(cè)：Dermol、N-cadherin的過度表達(dá)可能協(xié)同促進(jìn)了EMT的發(fā)生，導(dǎo)致了LSCC的發(fā)生和侵襲。同時(shí)檢測(cè)LSCC中Dermol和N-cadherin的表達(dá)可能有助于對(duì)腫瘤進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)性的分級(jí)。Dermol在LSCC中的調(diào)控機(jī)制及與患者預(yù)后和生存率的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)

[1]黃選兆，汪吉寶，孔維佳.實(shí)用耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：488.

[2]Gasparotto D，Polesel J，Marzotto M, et al.Overexpression of TWIS T2 correlates with poor prognosis in head and neck squamous cell carcinomas[J]. Oncotarget，2011，2(12): 1165-1175.

[3]趙杰，楊春雨，王麗華，等.Twist蛋白、E-cadherin、VEGF在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)[J].遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，29(6)：506-508.

[4]Li L，Cserjesi P，Olson EN, et al. Dermo1：a noveltwist-related bHLH protein expressed in the developing dermis[J].Dev Biol，1995，172(1)：280-292.

[5]黃志宏，左約維，聞安民，等.年輕婦女子宮內(nèi)膜癌53例臨床分析[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27(12)：1955-1957.

[6]Martin TA，Goyal A，Watkins G，et al. Expression of the transcription factors snail，slug，and twist and their clinical significance in human breast cancer[J]. Ann Surg Oncol，2005，12(6)：488-496.

[7]Lee TK，Poon RT，Yuen AP，et al. Twist overexpression correlates with hepatocellular carcinoma metastasis through induction of epithelial-mesenchymal transition[J].Clin Cancer Res，2006，12(18)：5369-5376.

[8]Vasko V，Espinosa AV，Scouten W，et al. Gene expression and functional evidence of epithelial-to-mesenchymal transition in papillary thyroid carcinoma invasion[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104(8)：2803-2808.

[9]Castro Alves C， Rosivatz E，Schott C，et al. Slug is overexpressed in gastric carcinomas and may act synergistically with SIP1 and snail in the down-regulation of E-cadherin[J]. Pathol，2007，211(5):507-515.

[10]Higashikawa K，Yoneda S，Taki M，et al. Gene expression profiling to identify genes associated with high-invasiveness in human squamous cell carcinoma with epithelial-to-mesenchymal transition[J]. Cancer Lett，2008，264(2)：256-264.

[11]Song LB，Liao WT，Mai HQ，et al.The clinical significance of twist expression in nasopharyngeal carcinoma[J].Cancer Lett，2006，242(2)：258-265.

[12]Eckert MA，Yang J.Targeting invadopodia to block breast cancer metastasis[J].Oncotarget，2011，2(7)：562-568.

[13]Maestro R， Dei Tos AP， Hamamori Y, et al. Twist is a potential oncogene that inhibits apoptosis[J]. Genes Dev, 1999，13(17)：2207-2217.

[14]Utsuki S，Sato Y，Oka H，et al.Relationship between the expression of E-，N-cadherins and beta-catenin and tumor grade in astrocytomas[J].J Neurooncol， 2002，57(3)：187-192．

[15]Jaggi M，Nazemi T，Abrahams NA，et al.N-cadherin switching occurs in high Gleason grade prostate cancer[J].Prostate，2006，66(2)：193-199.

[16]Nagi C，Guttman M，Jaffer S，et al.N-cadherin expression in breast cancer：correlation with an aggressive histologic variantinvasive micropapillary carcinoma[J].Breast Cancer Res Treat，2005，94(3)：225-235.

[17]Gravdal K，Halvorsen OJ，Haukaas SA，et al.A switch from E-cadherin to N-cadherin expression indicates epithelial to mesenchymal transition and is of strong and independent importance for the progress of prostate cancer[J].Clin Cancer Res， 2007，13(23)：7003-7011．

[18]Cavalaro U，Schaffhauser B，Christofori G.Cadherins and the tumour progression： is it all in a switch？[J].Cancer Lett，2002，176(2)：123-128.

(本文編輯楊美琴)

Expression of Dermol and N-cadherin in laryngeal squamous cell carcinoma and their correlation

YANGWen-jing,ZHAORui-li＊.

DepartmentofOtorhinolaryngology,CangzhouPeople’sHospitalofHebeiProvince,Cangzhou061600,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of Dermol and N-cadherin in laryngeal squamous cell carcinoma(LSCC). MethodsThe expression of Dermol and N-cadherin was detected by immunohistochemistry S-P method in 48 LSCC tissues and 30 tumor-adjacent normal tissues . The relationship between two factors and the clinical pathological features of LSCC were investigated. ResultsThe positive expression rates of Dermol and N-cadherin in LSCC tissues were 58.33% and 75.00%,and were 16.67% and 40.00% in the adjacent tissues (P<0.05). Expressions of Dermol and N-cadherin in LSCC tissues were correlated with lymph node metastasis(the expressions in N+ were higher than those in N0, P<0.05),clinical stage(the expressions in phrase Ⅲ and Ⅳ were higher than those in phrase Ⅰ and Ⅱ,P<0.05),but weren’t correlated with pathological grading of the tumor, patients clinical classification and age (P>0.05). The positive expression of Dermol was related to that of N-cadherin( r=0.390, P=0.016). ConclusionsDermol and N-cadherin play an important role in the pathogenesis, infiltration and metastasis of LSCC. The synergism of Dermol and N-cadherin may have some effects on the infiltration and metastasis of LSCC. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16:88-91)

【Key words】Laryngeal squamous cell carcinoma; Dermol; N-cadherin；Immunohistochemistry

(收稿日期2015-05-24)

DOI:10.14166/j.issn.1671-2420.2016.02.006

通訊作者：楊文婧(Email: 15075733387@139.com)

Corresponding author：YANG Wen-jing, Email: 15075733387@139.com

作者單位：河北省滄州市人民醫(yī)院耳鼻喉科滄州061600；＊河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院耳鼻喉科石家莊050000