張建偉，戎志全，喬文本，張毅，朱傳福(1山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所，濟南 250014；2山東省精神衛(wèi)生中心；山東省血液中心)

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利用唾液標(biāo)本進行HLA分型的可行性分析

張建偉1,2，戎志全3，喬文本3，張毅3，朱傳福3(1山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所，濟南 250014；2山東省精神衛(wèi)生中心；3山東省血液中心)

摘要：目的探討利用唾液樣本提取DNA進行HLA高分辨分型的可行性。方法采集6例造血干細胞移植患者和10例供者唾液樣本各2 mL，EDTA抗凝靜脈全血3 mL。采用Qiagen全血基因組提取試劑盒和Oragene唾液DNA提取試劑盒分別于全血和唾液樣本中提取DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。采用PCR-SSOP和PCR-SBT方法對血液提取DNA和唾液提取DNA進行HLA高分辨分型，并對分型結(jié)果進行比較。結(jié)果唾液提取DNA濃度69.75±44.96，A(260)/A(280)比值為1.77±0.07；血液提取DNA濃度63.06±33.99，A(260)/A(280)比值為1.75±0.04。唾液來源DNA PCR-SSOP結(jié)果明確，DNA PCR-SBT高分辨分型中無雜峰和堿基錯配。16例樣本唾液來源DNA的HLA高分辨分型結(jié)果和血液來源DNA的結(jié)果完全一致，符合率為100%。結(jié)論唾液提取的DNA可用于HLA高分辨分型。

關(guān)鍵詞：唾液；脫氧核糖核苷酸；HLA高分辨分型

目前，臨床造血干細胞和實體器官移植的患者和供者需采集靜脈全血進行HLA分型，中華骨髓庫志愿捐獻者亦需采集全血樣本進行HLA分型。這種樣本采集方式需要進行靜脈穿刺，會對被采集者造成一定程度的傷害，且有引起感染的風(fēng)險。從唾液中提取DNA的技術(shù)已經(jīng)比較成熟[1～3]，并且已經(jīng)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)中的個體識別以及疾病的輔助診斷等領(lǐng)域[4～7]，然而采集唾液樣本用于器官移植配型和中華骨髓庫造血干細胞志愿捐獻者HLA分型工作目前尚未見報道。本研究采集了6例造血干細胞移植患者和10例供者的唾液和血液樣本，從兩種樣本中提取DNA并進行HLA高分辨分型，探討利用唾液樣本提取DNA進行HLA高分辨分型的可行性。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源2014年7～8月進行HLA高分辨分型的6例造血干細胞移植患者和10例供者，每人分別采集EDTA抗凝靜脈全血3 mL和唾液樣本2 mL(采集唾液樣本前需純凈水漱口3次，10 min后采集)。

1.2試劑與儀器全血DNA提取試劑為Qiagen全血基因組提取試劑盒(德國Qiagen公司，批號：430114872)，唾液DNA提取試劑為Oragene self-collection kit OG510唾液收集試劑盒(加拿大DNA Genotek公司，批號：NE0103549)，HD-SSOP分型采用LABType試劑盒(美國One Lambda公司,批號：A004、B006、DR007)，SBT分型為Rose HLA-ABDR試劑盒(德國Rose-Europe，批號：201401/001)。GeneQuant紫外分光光度計(英國Amersham公司)，PE-9700型DNA擴增儀(美國PE公司),GeneGenius全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(英國Syngene公司)，Luminex100流式細胞分析儀(美國Luminex公司)，ABI-3730測序儀(美國ABI公司)。

1.3DNA提取利用全血DNA提取試劑盒和唾液DNA收集試劑盒分別提取血液和唾液中的基因組DNA，嚴格按照操作說明進行，最后均用100 μL TE溶解DNA。分別取唾液和全血提取DNA 4 μL，1%瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.4HLA高分辨分型①PCR-SSOP高分辨基因分型：采用LABType HD-SSOP分型試劑盒進行基因分型。反應(yīng)體系配置：16例份需Primer 32 μL，D-mix 120 μL，Taq酶(5 U/μL)A、B位點1.4 μL，DRB位點1.15 μL，每孔加9 μL D-mix/Primer/Taq酶混合液，1.5 μL DNA。擴增程序：96 ℃ 3 min；96 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72℃ 20 s，5個循環(huán)；96 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保溫。雜交操作嚴格按照試劑盒說明進行，軟件自動判讀結(jié)果。②PCR-SBT高分辨基因分型：嚴格按照試劑盒說明書操作步驟進行PCR-SBT分型,其中對屬于HLA Ⅰ類基因的A、B位點進行第2、3和4外顯子雙向測序,而對于HLA Ⅱ類DRB 1進行第2外顯子雙向測序。測序反應(yīng)產(chǎn)物置于ABI 3730測序儀上進行電泳分析，導(dǎo)出的結(jié)果由ATF軟件(澳大利亞Conexio Genomics公司，版本號1.0.2.41)進行分析。對無法確定高分辨結(jié)果的樣本，選擇序列特異性測序引物對該樣本再次測序，得到最終的高分辨結(jié)果。

2結(jié)果

兩種來源DNA瓊脂糖凝膠電泳后均呈現(xiàn)明亮條帶。唾液提取DNA濃度69.75±44.96，A260/A280比值為1.77±0.07；血液提取DNA濃度63.06±33.99，A260/A280比值為1.75±0.04。

唾液來源DNA PCR-SSOP實驗無假陽性或假陰性反應(yīng)探針，可得到確切HLA分型結(jié)果(圖1)。唾液提取DNA PCR-SBT高分辨分型中無雜峰和堿基錯配，可指定惟一的分型結(jié)果(圖2)。16例樣本唾液來源DNA的HLA高分辨分型結(jié)果和血液來源DNA的結(jié)果一致，兩組樣本所得結(jié)果符合率為100%。

圖1　1例份唾液DNA PCR-SSOP高分辨分型結(jié)果

圖2　1例份唾液DNA PCR-SBT高分辨分型結(jié)果

3討論

血液樣本是臨床基因檢測最常見的DNA來源，但理論上DNA可以從任何有核細胞獲取，唾液中含有口腔黏膜脫落的上皮細胞，這些脫落的上皮細胞具有完整的細胞核，因此理論上唾液可以代替血液成為人類基因組DNA的來源[2]。本研究采集了16例個體的血液樣本和唾液樣本，分別提取了兩種樣本的DNA，結(jié)果顯示唾液和血液樣本所得DNA濃度平均值分別為69.75和63.06，A260/A280比值平均值分別為1.77和1.75，兩種來源的DNA凝膠電泳成像后均呈現(xiàn)明亮條帶。

PCR-SSOP和PCR-SBT是目前最主要的兩種HLA高分辨分型方法，前者具有操作簡單、通量高的特點，但其探針是根據(jù)目前已知的等位基因序列設(shè)計研制的，如遇到未知的基因序列會出現(xiàn)異常的反應(yīng)格局而無法得到確切的結(jié)果[8～10]。PCR-SBT直接對HLA等位基因進行DNA序列分析，具有分型準(zhǔn)確、分辨率高、可以確定新的等位基因的特點[11～13]，但其實驗步驟多、操作復(fù)雜、對設(shè)備要求高[14]。因此，實際工作中兩種方法互為補充，結(jié)合使用可取得最佳效果。本研究采用了PCR-SSOP和PCR-SBT兩種高分辨分型方法，結(jié)果表明兩種來源的DNA用兩種分型方法得出的高分辨分型結(jié)果完全一致。唾液DNA樣本在PCR-SSOP實驗中內(nèi)對照探針反應(yīng)良好、無假反應(yīng)探針，在PCR-SBT實驗中無雜峰和堿基錯配，結(jié)果明確。留取唾液樣本無需進行靜脈穿刺、取材方便安全、不需要專業(yè)技術(shù)人員，是一種非侵入性、簡單易行的樣本采集方式，易于被患者接受。另外，有些白血病患者的白細胞計數(shù)非常低，此時從血液樣本中提取DNA往往較困難，留取唾液樣本更成為一種較為理想的樣本采集方式?；谏鲜鎏攸c，留取唾液樣本進行HLA分型值得在臨床器官移植配型和中華骨髓庫造血干細胞志愿捐獻者的樣本采集工作中應(yīng)用和推廣。唾液樣本能否長期儲存及儲存后對DNA質(zhì)量和HLA分型的影響有待于進一步的研究。

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(收稿日期：2015-09-07)

中圖分類號：R446.11

文獻標(biāo)志碼：B

文章編號：1002-266X(2016)11-0070-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.027

通信作者：朱傳福(E-mail： shbiochem@163.com)