王民，楊永安，耿垚，劉芳，李偉，王小磊 (河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定 071000)

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七氟醚預(yù)處理對缺血再灌注損傷小鼠腦組織的保護(hù)作用及其機(jī)制探討

王民，楊永安，耿垚，劉芳，李偉，王小磊 (河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定 071000)

摘要：目的觀察七氟醚預(yù)處理對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并探討其可能機(jī)制。方法60只雄性健康昆明小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和預(yù)處理組，每組20只。假手術(shù)組和模型組輸純氧氣60 min，預(yù)處理組輸入氧氣及2.4%七氟醚60 min，用純氧洗脫10 min。模型組和預(yù)處理組利用線栓法建立小鼠腦缺血再灌注損傷模型，于再灌注24 h時，計算小鼠神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死體積百分比，利用RT-PCR檢測小鼠海馬組織中的TREK-2、Caspase-3 mRNA。結(jié)果預(yù)處理組和模型組小鼠神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死體積百分比較假手術(shù)組高，且預(yù)處理組較模型組低(P均<0.05)。預(yù)處理組和模型組小鼠海馬組織TREK-2 mRNA相對表達(dá)量較假手術(shù)組高，且預(yù)處理組較模型組高(P均<0.05)。預(yù)處理組和模型組小鼠海馬組織Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量較假手術(shù)組高，且預(yù)處理組較模型組低(P均<0.05)。結(jié)論七氟醚預(yù)處理對缺血再灌注損傷小鼠腦組織具有保護(hù)作用，可能與其增加海馬組織TREK-2表達(dá)、減少Caspase-3表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：七氟醚；腦缺血再灌注損傷；TREK-2基因

腦缺血再灌注損傷作為神經(jīng)外科較為常見的圍術(shù)期不良事件，嚴(yán)重影響手術(shù)治療效果及患者預(yù)后[1]。七氟醚作為常用的吸入性全麻藥，有研究[2]指出，顱腦手術(shù)行七氟醚預(yù)處理可有效保護(hù)腦組織，減輕缺血再灌注對腦組織的損傷作用。研究[3]表明，雙孔鉀通道含有4個跨膜片段與2個孔道結(jié)構(gòu)，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理功能關(guān)系密切，在調(diào)節(jié)神經(jīng)元膜電位及體溫、腦缺血保護(hù)等功能中發(fā)揮重要作用。TREK-2作為雙孔鉀通道重要類型，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布具有特異性，可通過減少細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流而保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞[4]。本研究觀察了七氟醚預(yù)處理對缺血再灌注損傷小鼠腦組織的保護(hù)作用，并探討其可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組清潔級雄性健康昆明小鼠60只由河南省實驗動物中心提供(合格證號：醫(yī)動字第99013號)，8周齡，體質(zhì)量22～28 g，飼養(yǎng)于通風(fēng)、清潔環(huán)境中，溫度20～24 ℃，相對濕度50%～70%，自由飲水。利用隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和預(yù)處理組，每組20只。

1.2主要試劑與設(shè)備七氟醚購自上海恒瑞醫(yī)藥有限公司(批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字p0070172)，TREK-2、Caspase-3及內(nèi)參引物均由上海生工公司設(shè)計完成，TRIzol總RNA提取試劑盒購自美國Gibco公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒均購自美國Invitrogen公司，紫外分光光度計購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，數(shù)碼相機(jī)購自日本Sony公司，PCR儀購自瑞士Roch公司。

1.3小鼠腦缺血再灌注損傷模型制備及七氟醚用法所有小鼠禁食12 h后，置于半封閉有機(jī)玻璃箱中，鈉石灰鋪于箱底，使箱內(nèi)PCO2低于375 mmHg，并采取燈泡加熱，維持箱內(nèi)溫度在35～38 ℃。箱側(cè)面留2個通氣孔，假手術(shù)組和模型組一孔用于輸入純氧氣60 min；預(yù)處理組一孔連接麻醉氣體揮發(fā)罐輸入氧氣及2.4%七氟醚60 min，用純氧洗脫10 min，另一孔連接麻醉氣體分析儀，對氧氣、七氟醚及二氧化碳進(jìn)行監(jiān)測。于60 min后，行10%水合氯醛腹腔注射麻醉，根據(jù)文獻(xiàn)[5]中的方法利用線栓法構(gòu)建小鼠缺血再灌注損傷模型。取頸部正中切口，對右側(cè)頸總動脈、頸外動脈進(jìn)行分離，將頸外動脈分支進(jìn)行結(jié)扎，將頸總動脈于近心端結(jié)扎，假手術(shù)組小鼠完成操作；模型組和預(yù)處理組小鼠繼續(xù)將頸總動脈遠(yuǎn)端用血管夾進(jìn)行夾閉，于頸總動脈分叉處剪一小口，并將50 mm長的尼龍魚線置入頸內(nèi)動脈，直到出現(xiàn)輕微阻力時停止放入，深度為1.8～2.0 cm；缺血持續(xù)120 min后，將線栓取出使血液恢復(fù)灌注。手術(shù)操作過程中小鼠均自主呼吸，直腸溫度維持在37～38 ℃。麻醉清醒后，小鼠均放回籠子飼養(yǎng)，自由飲食、飲水。

1.4小鼠神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死體積百分比計算方法于再灌注24 h時，對所有小鼠神經(jīng)功能缺損情況進(jìn)行評估[6]：運(yùn)動功能評分實驗(小鼠放地上可正常行走0分，能直線行走1分，往癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈2分，倒向癱瘓側(cè)3分；將小鼠尾巴提起，后肢屈曲或前肢屈曲或頭部在30 s內(nèi)偏離身體縱軸>10°記1分)、平衡功能評分實驗(完成并保持平衡記0分，將平衡木一端完全抓住記1分，將平衡木抱住時一個肢體出現(xiàn)滑落記2分，將平衡木抱住時兩個肢體滑落或旋轉(zhuǎn)超過60 s記3分，旋轉(zhuǎn)在41～60 s滑落記4分，旋轉(zhuǎn)在20～40 s滑落記5分，旋轉(zhuǎn)在20 s內(nèi)滑落記6分)、反射或運(yùn)動異常評分(角膜反射或羽翼反射或驚恐反應(yīng)消失或出現(xiàn)肌張力障礙、抽搐、肌陣攣均記1分)。于神經(jīng)功能缺損評估后，每組各取小鼠10只，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后處死并取腦組織，置于冰鹽水15 min，于冠狀面對腦組織進(jìn)行切片，厚度2 mm，置于37 ℃ TTC溶液中，行染色40 min，用甲醛固定24 h，利用數(shù)碼相機(jī)拍照后轉(zhuǎn)入電腦，用專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行分析，為避免同側(cè)腦水腫對腦體積產(chǎn)生的影響，用對側(cè)正常腦組織體積進(jìn)行計算。腦梗死體積百分比=(對側(cè)正常腦體積-同側(cè)正常腦體積)/對側(cè)正常腦體積×100%[7]。

1.5小鼠海馬組織TREK-2、Caspase-3 mRNA檢測采用熒光定量PCR。將每組余下的10只小鼠處死后，取海馬組織進(jìn)行研磨，利用細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，用TRIzol總RNA提取試劑盒獲得總RNA，利用紫外分光光度計進(jìn)行檢測，取A260/A280>1.80樣品完成后續(xù)實驗。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板用PCR試劑盒完成PCR，TREK-2引物序列上游：5′-CGTCCATCGTCCCAAATT-3′，下游：5′-TTGGAGGAGTTTCCTACCG-3′；Caspase-3引物序列上游：5′-TCGAGGTCGACGGATTCGATG-3′，下游：5′-CCGCTCTAGAACTAGTGGATC-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性60 s，56 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，連續(xù)進(jìn)行38個循環(huán)。每個樣品均設(shè)置3個平行反應(yīng)復(fù)孔。以β-actin為內(nèi)參，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后拍照，利用圖像分析軟件對條帶灰度值進(jìn)行分析，獲得TREK-2 mRNA和Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量。

2結(jié)果

3組小鼠神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死體積百分比比較見表1。3組小鼠海馬組織TREK-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)比較見表2。

表1　　　　3組小鼠神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死體積

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

表2　　　　3組小鼠海馬組織TREK-2、Caspase-3 mRNA

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3討論

腦缺血再灌注損傷作為神經(jīng)外科圍術(shù)期常見的不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響手術(shù)治療效果及患者預(yù)后，增加了患者手術(shù)風(fēng)險[8]。因此，如何有效預(yù)防或減輕腦缺血再灌注損傷已成為臨床研究重點(diǎn)。本研究參考文獻(xiàn)[5]采用線栓法制備小鼠腦缺血再灌注損傷模型，結(jié)果顯示預(yù)處理組和模型組小鼠神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死體積百分比均高于假手術(shù)組，說明小鼠腦缺血再灌注損傷模型建立成功。在確定七氟醚預(yù)處理吸入劑量時，主要參照有關(guān)文獻(xiàn)[9]及預(yù)實驗結(jié)果，本研究采取麻醉氣體揮發(fā)罐輸入氧氣及2.4%七氟醚60 min進(jìn)行處理。

TREK-2是重要的雙孔鉀通道亞型，可被細(xì)胞膨脹、張力、負(fù)壓等機(jī)械張力和多不飽和脂肪酸激活，在病理狀態(tài)下可能發(fā)揮保護(hù)作用[10]。本研究顯示，當(dāng)小鼠發(fā)生腦缺血再灌注損傷時海馬組織中TREK-2 mRNA相對表達(dá)量顯著增加，且七氟醚預(yù)處理會進(jìn)一步增加TREK-2表達(dá)。TREK-2通道的開放增加可引發(fā)神經(jīng)元超級化，抑制電壓依賴性鈣離子通道及NMDA受體相關(guān)鈣通道，減少Ca2+內(nèi)流，有效保護(hù)神經(jīng)元。TREK-2表達(dá)升高可能是神經(jīng)元損傷后的反饋性保護(hù)調(diào)節(jié)機(jī)制，而七氟醚預(yù)處理更有利于TREK-2的表達(dá)[11]。在發(fā)生缺血再灌注損傷時，七氟醚預(yù)處理可進(jìn)一步促進(jìn)TREK-2通道大量開放，鉀電流增加可對靜息膜電位進(jìn)行調(diào)節(jié)而抑制其他離子通道的活性，從而有效保護(hù)腦細(xì)胞[12]，同時，TREK-2通道大量開放可使神經(jīng)元超極化，通過抑制鈣通道而減少Ca2+內(nèi)流，減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平而減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Caspase-3作為凋亡執(zhí)行蛋白，其表達(dá)水平可反映細(xì)胞發(fā)生凋亡的程度[13]。本研究結(jié)果還顯示，七氟醚預(yù)處理可抑制海馬組織中Caspase-3表達(dá)，說明七氟醚預(yù)處理有助于保護(hù)腦組織，減少神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。

綜上所述，七氟醚預(yù)處理對缺血再灌注損傷小鼠腦組織具有保護(hù)作用，可能與其增加海馬組織TREK-2表達(dá)、減少Caspase-3表達(dá)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Liu J, Li J, Yang Y, et al. Neuronal apoptosis in cerebral ischemia/reperfusion area following electrical stimulation of fastigial nucleus[J]. Neural Regen Res, 2014,9(7):727-734.

[2] Shi H, Sun BL, Zhang J, et al. miR-15b suppression of Bcl-2 contributes to cerebral ischemic injury and is reversed by sevoflurane preconditioning[J]. CNS Neurol Disord Drug Targets, 2013,12(3):381-391.

[3] Kuang Q, Purhonen P, Hebert H. Structure of potassium channels[J]. Cell Mol Life Sci, 2015,72(19):3677-3693.

[4] Noel J, Sandoz G, Lesage F. Molecular regulations governing TREK and TRAAK channel functions[J]. Channels (Austin), 2011,5(5):402-409.

[5] Savchenko AS, Borissoff JI, Martinod K, et al. VWF-mediated leukocyte recruitment with chromatin decondensation by PAD4 increases myocardial ischemia/reperfusion injury in mice[J]. Blood, 2014,123(1):141-148.

[6] 黃騰,黃振興,楊承祥,等.TREK-1在七氟醚預(yù)處理減輕小鼠腦缺血再灌注損傷中的作用[J].中華麻醉學(xué)雜志,2015,35(4):506-509.

[7] Lee SK, Kim JH, Kim JS, et al. Polyphenol (-)-epigallocatechin gallate-induced cardioprotection may attenuate ischemia-reperfusion injury through adenosine receptor activation: a preliminary study[J]. Korean J Anesthesiol, 2012,63(4):340-345.

[8] Gao HJ, Liu PF, Li PW, et al. Ligustrazine monomer against cerebral ischemia/reperfusion injury[J]. Neural Regen Res, 2015,10(5):832-840.

[9] Yang Q, Yan W, Li X, et al. Activation of canonical notch signaling pathway is involved in the ischemic tolerance induced by sevoflurane preconditioning in mice[J]. Anesthesiology, 2012,117(5):996-1005.

[10] Schneider ER, Anderson EO, Gracheva EO, et al. Temperature sensitivity of two-pore (K2P) potassium channels[J]. Curr Top Membr, 2014,74(5):113-133.

[11] Huang D, Yu B. Recent advance and possible future in TREK-2: a two-pore potassium channel may involved in the process of NPP, brain ischemia and memory impairment[J]. Med Hypotheses, 2008,70(3):618-624.

[12] Kim EJ, Kang D, Han J. Baicalein and wogonin are activators of rat TREK-2 two-pore domain K+channel[J]. Acta Physiol (Oxf), 2011,202(2):185-192.

[13] Chen H, Yang X, Feng Z, et al. Prognostic value of Caspase-3 expression in cancers of digestive tract: a meta-analysis and systematic review[J]. Int J Clin Exp Med, 2015,8(7):10225-10234.

(收稿日期：2015-10-05)

中圖分類號：R743.33

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)11-0025-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.009

通信作者：王小磊(E-mail： 2019945399@qq.com)