雷以會(huì)，徐平，楊利玲 (遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義 563000)

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·基礎(chǔ)研究·

貴州遵義地區(qū)82只健康蝙蝠腦組織博爾納病毒核蛋白檢測(cè)

雷以會(huì)，徐平，楊利玲 (遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義 563000)

摘要：目的觀察貴州遵義地區(qū)蝙蝠腦組織博爾納病毒(BDV)感染情況。方法 采用Western blotting法檢測(cè)貴州遵義地區(qū)82只健康蝙蝠腦組織中BDV核蛋白。結(jié)果蝙蝠腦組織BDV核蛋白陽性率為12.2%(10/82)。結(jié)論貴州遵義地區(qū)健康蝙蝠存在BDV感染。

關(guān)鍵詞：博爾納病毒；蝙蝠；核蛋白；蛋白質(zhì)免疫印跡法

博爾納病毒(BDV)[1]是一種非細(xì)胞溶解性和嚴(yán)格嗜神經(jīng)性的RNA病毒，可以持續(xù)感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)。健康嚙齒動(dòng)物感染BDV后，表現(xiàn)出以行為異常、運(yùn)動(dòng)障礙及精神異常為特征的嚴(yán)重神經(jīng)功能紊亂[2]。目前關(guān)于人和動(dòng)物BDV自然感染的研究[3～5]遍布全球，在中國也存在BDV的散在感染。學(xué)者們?cè)隍痼w內(nèi)分離出80多種病毒，除狂犬病毒、SARS樣冠狀病毒、乙型腦炎病毒等常見病毒外，還有亨德拉病毒[6]和尼帕病毒[7]等新發(fā)病毒。由此可見，蝙蝠可成為多種病毒性人畜共患病的重要傳媒。BDV作為一種新發(fā)的傳染性病毒，國內(nèi)外尚無蝙蝠與BDV相關(guān)性的研究。本研究采用蛋白質(zhì)免疫印跡法對(duì)貴州遵義地區(qū)82只健康蝙蝠腦組織BDV核蛋白進(jìn)行檢測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本82只蝙蝠采集于貴州省遵義市，樣本采集時(shí)間為2014年5～9月，未區(qū)分蝙蝠種類、雌雄及年齡等，每例取同側(cè)新鮮額顳葉腦組織約250 mg，分裝在去RNA酶EP管中，-80 ℃冰箱保存。

1.2主要試劑及儀器磷酸化蛋白提取試劑盒(Key GEN)；蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Beyotime)；BDV核蛋白(BDV-P40)多克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、BDV陽性蛋白均由重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心提供。電泳儀(美國Bio-Rad)，電轉(zhuǎn)儀(美國Bio-Rad)，水平搖床(北京恒奧)，熒光顯微照相系統(tǒng)(日本Nikon)。

1.3腦組織BDV核蛋白檢測(cè)每只蝙蝠稱取額顳葉腦組織100 mg，加入RIPA蛋白提取試劑，超聲裂解，10 000 r/min離心5 min，取上清液，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，取樣品蛋白150 μL，用4×loading buffer按1∶4稀釋，100 ℃恒溫箱放置10 min，保存于-20 ℃冰箱備用。將BDV陽性標(biāo)本蛋白上樣于12%SDS-PAGE膠上電泳，采用半干轉(zhuǎn)膜法，轉(zhuǎn)膜40 min，將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h，封閉完畢后，將PVDF膜切成0.5 cm寬的小條，分別與不同稀釋濃度的BDV-P40多克隆抗體(1∶500、1∶1 000、1∶1 500、1∶2 000)和堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000、1∶10 000)的組合交叉體系進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)曝光效果，確定最佳抗體稀釋濃度。樣本蛋白上樣后經(jīng)電泳、電轉(zhuǎn)、封閉，BDV-P40多克隆抗體按1∶1 000稀釋，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗滌3次，10 min/次，堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG按1∶5 000稀釋，搖床孵育2 h，TBST洗滌3次，10 min/次，將膜晾干后，在膜上滴適量顯影液，反應(yīng)3 min，膠片曝光。將目的條帶處于40 kD處的標(biāo)本視為陽性，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陽性對(duì)照。反復(fù)驗(yàn)證陽性標(biāo)本，最終確定陽性結(jié)果。

2結(jié)果

蝙蝠腦組織BDV核蛋白陽性率為12.2%(10/82)，其電泳結(jié)果見圖1。

3討論

BDV可以引起傳染性腦脊髓炎，即博爾納病(BD)，可以感染包括人在內(nèi)的所有恒溫動(dòng)物。BD是一種免疫介導(dǎo)的神經(jīng)綜合征，以大量炎癥細(xì)胞浸潤腦膜及腦實(shí)質(zhì)、特異性抗原在邊緣系統(tǒng)神經(jīng)元中聚集為特征，BDV在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要破壞大腦齒狀回及邊緣系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞，臨床上主要表現(xiàn)為認(rèn)知、行為及情感的異常等[8]。BDV廣泛存在于人類疾病中，主要與抑郁癥、雙向情感障礙、精神分裂癥、慢性疲勞綜合征、獲得性免疫缺陷綜合征性腦病、多發(fā)性硬化、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病、帕金森綜合征和腦腫瘤等神經(jīng)精神疾病相關(guān)[9，10]。

注：1～10為陽性標(biāo)本，+為陽性對(duì)照。

圖1蝙蝠腦組織BDV核蛋白電泳結(jié)果

王長明等[11]用巢式逆轉(zhuǎn)錄PCR(FQ-nRT-PCR)對(duì)貴州遵義及周邊地區(qū)的300只山羊進(jìn)行檢測(cè)，其中有20例標(biāo)本發(fā)現(xiàn)了BDV-P24基因片段；劉海軍等[12]采用相同方法對(duì)貴州省及部分周邊地區(qū)牛的BDV-P24基因片段進(jìn)行檢測(cè)，陽性率為4.17%；還有研究者[13，14]在一些神經(jīng)精神疾病患者的血液或腦脊液檢測(cè)出BDV感染；證實(shí)貴州地區(qū)人和動(dòng)物存在BDV自然感染。貴州地屬喀斯特地形，且貴州地區(qū)屬于亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候區(qū)，氣候溫暖濕潤，為蝙蝠的生活創(chuàng)造了有利的條件。隨著生活水平的不斷提高，城鄉(xiāng)結(jié)合越發(fā)緊密，部分蝙蝠可能在城中定居，使人類與蝙蝠的接觸愈發(fā)密切。一般認(rèn)為，BDV可以通過動(dòng)物的唾液和鼻腔分泌物等進(jìn)行傳播，動(dòng)物可通過直接接觸患病動(dòng)物的分泌物或食用被污染的食物而感染。根據(jù)貴州的地理環(huán)境及蝙蝠的生活習(xí)性，蝙蝠作為BDV自然宿主的可能性較大。

本研究在課題組其他成員前期研究的基礎(chǔ)上，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法對(duì)蝙蝠腦組織BDV核蛋白進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)BDV核蛋白陽性標(biāo)本10例，BDV-P40檢出率12.2%。本實(shí)驗(yàn)選用了敏感性及特異性均較高的Western blotting法，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更具說服力。本實(shí)驗(yàn)采用的BDV-P40多克隆抗體由重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心提供，具有良好的特異性及敏感性。本實(shí)驗(yàn)對(duì)待測(cè)標(biāo)本分別進(jìn)行了3次檢測(cè)，對(duì)2次及以上陽性的標(biāo)本進(jìn)行了多次確認(rèn)，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無變化，充分體現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)的特異性。

不同地域不同物種BDV檢出率不同，法國學(xué)者采用nRT-PCR對(duì)171只動(dòng)物(包括馬、牛、狐貍、狗、羊)進(jìn)行BDV檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)只有1例牛腦組織中含有BDV-P24基因片段[15]。劉建等[16]采用FQ-nRT-PCR對(duì)寧夏地區(qū)163只綿羊腦組織中BDV-P24、BDV-P40進(jìn)行檢測(cè)，其中兩者均為陽性的有6例(3.68%)。馮裕星等[17]采用FQ-nRT-PCR分別對(duì)新疆伊犁地區(qū)200匹馬、75頭驢及100只牧羊犬腦組織中BDV-P24基因片段進(jìn)行檢測(cè)，陽性率依次為1.5%、5.3%、9.0%，而陽性標(biāo)本檢測(cè)BDV-P40則為陰性。貴州遵義地區(qū)蝙蝠B(yǎng)DV自然感染率較其他地方高，可能存在以下原因：①本次實(shí)驗(yàn)采用Western blotting法檢測(cè)BDV核蛋白，其特異性較PCR高。研究[18]發(fā)現(xiàn)BDV-P40的轉(zhuǎn)錄水平較BDV-P24低，在基因片段復(fù)制過程中，BDV-P40所需模板量比BDV-P24高，故單純采用PCR法檢測(cè)BDV-P40基因片段可能會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。②采樣處于感染的不同時(shí)期對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)造成影響。③BDV自然感染具有地域性及物種差異，可能貴州遵義地區(qū)蝙蝠B(yǎng)DV自然感染率較高。④不同取材部位和樣本量的多少會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Nakamura等[19]對(duì)1例血BDV陽性精神分裂癥患者不同部位的腦組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在海馬、小腦、腦橋中只能檢測(cè)出BDV-P24，而在顳葉中只能檢測(cè)出BDV-P40。此外，不同的實(shí)驗(yàn)室條件、實(shí)驗(yàn)室污染情況也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

可見，貴州遵義地區(qū)蝙蝠存在BDV自然感染，蝙蝠有可能是BDV的自然宿主之一，人感染BDV可能存在潛在的動(dòng)物源性。

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(收稿日期：2015-08-07)

中圖分類號(hào)：R373

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)11-0023-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.008

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31160210)。