許浩然，呂艷超，韓雙雙，王麗紅，岳洪娟，王嘉(承德市中心醫(yī)院，河北承德 067000；保定市第一中心醫(yī)院總院；河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院)

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非小細胞肺癌組織中p-mTOR、p70s6k的表達變化及其臨床意義

許浩然1，呂艷超2，韓雙雙3，王麗紅3，岳洪娟3，王嘉3(1承德市中心醫(yī)院，河北承德 067000；2保定市第一中心醫(yī)院總院；3河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院)

摘要：目的觀察非小細胞肺癌組織中磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)及核糖體40s小亞基S6蛋白激酶(p70s6k)蛋白的表達變化，并探討其意義。方法非小細胞肺癌患者82例，手術(shù)切除腫瘤組織作為肺癌組，取患者肺癌同側(cè)遠端的肺泡正常組織46例份作為對照組1，正常支氣管黏膜組織50例份為對照組2。免疫組化方法檢測3組組織中的p-mTOR及p70s6k蛋白，并分析其與非小細胞肺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果肺癌組、對照組1、對照組2 p-mTOR蛋白表達陽性率分別為68.29%、17.39%、32.0%，p70s6k蛋白表達陽性率分別為85.37%、21.74%、32.00%，肺癌組與對照組1、對照組2相比，P均<0.01。非小細胞肺癌低分化p-mTOR蛋白表達陽性率高于中高分化(P<0.01)。肺癌組織中p-mTOR和p70s6k蛋白的表達呈正相關(guān)(r=0.21，P=0.003 2)。結(jié)論p-mTOR、p70s6k蛋白在非小細胞肺癌組織中高表達，可作為早期診斷肺癌的指標或抗癌藥物作用的新靶點。

關(guān)鍵詞：肺腫瘤；非小細胞肺癌；磷酸化雷帕霉素靶蛋白；核糖體40s小亞基S6蛋白激酶

肺癌發(fā)病機制尚未明確，目前認為是由于吸煙、職業(yè)暴露、大氣污染等多種外部因素誘發(fā)細胞基因改變，進而導(dǎo)致細胞生長失控和癌癥的發(fā)生[1,2]。研究[3,4]表明，雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路在多種惡性腫瘤中發(fā)揮作用，磷酸化的mTOR(p-mTOR)是mTOR信號通路被激活的生物學(xué)標志。p-mTOR可促使其作用底物——核糖體40s小亞基S6蛋白激酶(p70s6k)活化，增強mRNAs翻譯產(chǎn)生核糖體、起始因子及延伸因子，促進腫瘤的發(fā)生和擴散。因此，研究p-mTOR和p70s6k在肺癌中的作用具有重要意義。本研究觀察非小細胞肺癌組織中p-mTOR、p70s6k蛋白的表達變化，并分析其與非小細胞肺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，為肺癌的早期診斷、預(yù)后判斷及治療提供新思路。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇2011年3月～2014年3月在承德市中心醫(yī)院行手術(shù)治療的非小細胞肺癌患者82例，術(shù)前均未進行化療或放療，其中男64例、女18例，年齡42～76(63.57±9.06)歲，鱗狀細胞癌(以下簡稱鱗癌)42例、腺癌40例，低分化32例、中高分化50例，伴有周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例。手術(shù)切除非小細胞肺癌患者腫瘤組織作為肺癌組。本研究設(shè)雙對照組，標本取自患者肺癌同側(cè)遠端的肺泡及支氣管正常組織，其中正常肺泡對照組46例(對照組1)，正常支氣管黏膜對照組50例(對照組2)。全部標本均經(jīng)兩位高年資病理醫(yī)師診斷證實。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2p-mTOR、p70s6k蛋白檢測方法所有標本均經(jīng)4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色供病理學(xué)觀察。腫瘤組織學(xué)分級參照2004年版世界衛(wèi)生組織(WHO)肺癌組織學(xué)分類標準。兔抗人p-mTOR及p70s6k單克隆抗體購自美國santa cruz公司，免疫組化試劑盒、濃縮型DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。p-mTOR、p70s6k蛋白檢測采用SP免疫組化法染色，檸檬酸緩沖液煮沸修復(fù)，按照免疫組化試劑盒說明書步驟進行，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，以已知蛋白陽性切片作陽性對照，以PBS液代替一抗作陰性對照。結(jié)果判定標準:采用雙盲法顯微鏡下觀察結(jié)果，如出現(xiàn)結(jié)果不一致時，由第三位研究者最后認定。p-mTOR及p70s6k蛋白為細胞胞質(zhì)染色，胞質(zhì)棕黃色為陽性，不著色為陰性。每張切片隨機取5個400倍視野，陽性判定以陽性細胞數(shù)及染色強度綜合判定。陽性細胞百分比計分按視野內(nèi)陽性細胞所占總細胞數(shù)的比例計分，<5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，≥51%計3分；染色強度：不著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分[5]；二者相加，≤3分為陰性，>3分為陽性。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

p-mTOR蛋白在正常肺泡細胞及支氣管黏膜上皮細胞胞質(zhì)呈淡灰黃色及不顯色，呈弱陽性及陰性表達；p-mTOR蛋白在肺癌細胞胞質(zhì)呈金棕黃色，呈強陽性表達。肺癌組、對照組1、對照組2 p-mTOR蛋白表達陽性率分別為68.29%、17.39%、32.0%，肺癌組與對照組1、對照組2相比，P均<0.01。非小細胞肺癌低分化p-mTOR蛋白表達陽性率高于中高分化(P<0.01)，見表1。p70s6k蛋白在肺泡細胞及支氣管黏膜上皮細胞胞質(zhì)呈淡灰黃色及不顯色，呈弱陽性及陰性表達；p70s6k蛋白在肺癌細胞胞質(zhì)呈金棕黃色，呈強陽性表達。肺癌組、對照組1、對照組2 p70s6k蛋白表達陽性率分別為85.37%、21.74%、32.00%，肺癌組與對照組1、對照組2相比，P均<0.01。p70s6k蛋白表達與非小細胞肺癌患者性別、年齡和腫瘤的大小、組織學(xué)類型、分化程度及是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P均>0.05)，見表1。肺癌組織中p-mTOR和p70s6k蛋白的表達呈正相關(guān)(r=0.21，P=0.003 2)。

表1　　　　p-mTOR、p70s6k蛋白表達與非小細胞肺癌

3討論

mTOR基因定位于人類1號染色體短臂(1p36.2)，其編碼大分子蛋白由2 549個氨基酸組成。mTOR信號通路處于多種信號通路調(diào)控的中心位置，參與調(diào)控多種細胞功能。研究[5～7]表明，在前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌和胰腺癌中都可發(fā)現(xiàn)mTOR的活化及過表達。p-mTOR是mTOR的激活狀態(tài)，在正常組織細胞中呈低表達，在多種腫瘤中呈異常高表達，并與臨床病理特征具有相關(guān)性[8]。p70s6k是mTOR通路的下游作用底物，為絲/蘇氨酸蛋白激酶。mTOR可使p70s6k的第412位蘇氨酸殘基磷酸化，使其活性上升100倍左右，促進蛋白質(zhì)的生物合成[9]。p-mTOR/p70s6k信號通路通過調(diào)控下游基因的表達，來影響蛋白合成、細胞增殖及凋亡，與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān)，已成為目前的研究熱點。鱗癌和腺癌是非小細胞肺癌的常見病理類型，多數(shù)發(fā)生于支氣管黏膜上皮細胞，少部分發(fā)生于肺泡上皮細胞。為了提高研究的可靠性，本研究設(shè)支氣管和肺泡雙正常對照組。本研究結(jié)果顯示，p-mTOR和p70s6k蛋白在肺癌組中的表達均高于肺泡對照組或支氣管對照組，提示在非小細胞肺癌組織中存在p-mTOR/p70s6k信號通路激活的現(xiàn)象，在兩種病理類型的非小細胞肺癌發(fā)病過程存在相似的促癌機制。研究[10～12]報道，p-mTOR在乳腺浸潤癌、前列腺癌、肝細胞癌中表達顯著增高；p70s6k蛋白過表達與乳腺癌、肝癌及卵巢癌等多種腫瘤密切相關(guān)；進一步表明，p-mTOR和p70s6k在多種惡性腫瘤中發(fā)揮作用，并可能存在相同的作用機制。

本研究結(jié)果顯示，低分化及中高分化肺癌組織中p-mTOR蛋白的陽性率分別為87.5%、56.0%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示p-mTOR與肺癌的分化程度有關(guān)，癌的惡性程度越高p-mTOR表達水平越高，佐證了p-mTOR作為蛋白質(zhì)合成的正調(diào)控信號,伴隨腫瘤惡性度的提高其表達量升高，對于判斷預(yù)后有一定的意義。晏淼等[13]研究發(fā)現(xiàn)，p-mTOR表達水平與胃腺癌分化程度有關(guān)。朱倫等[14]提出p-mTOR的陽性表達率隨著食管鱗癌分化程度降低而升高。兩者的研究結(jié)果均與本組相近，進一步提示p-mTOR在不同臟器的鱗癌和腺癌中的作用機制相似。本研究結(jié)果顯示，p-mTOR表達水平與肺癌患者的性別、年齡、腫瘤直徑大小、組織學(xué)類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)，p70s6k蛋白表達與肺癌患者的性別、年齡、腫瘤的大小、組織學(xué)類型、分化程度及是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)。汪砥等[15]研究表明，p-mTOR的表達水平在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌腫瘤組織中顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤。岳文濤等[16]發(fā)現(xiàn)，p70s6k的表達與肺癌分化程度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均顯著相關(guān)。兩者的研究結(jié)果與本組不符，考慮可能與本組樣本數(shù)少有關(guān)，應(yīng)加大樣本量進一步印證。本研究結(jié)果顯示，p-mTOR和p70s6k在非小細胞肺癌組織中的表達呈正相關(guān)，提示兩者處于同一信號通路，在非小細胞肺癌發(fā)生過程中發(fā)揮協(xié)同促癌作用。聯(lián)合檢測兩者對于早期預(yù)警肺癌的發(fā)生具有重要的臨床價值。研究[17]發(fā)現(xiàn)，食管癌、胰腺癌中mTOR和p70s6k蛋白表達亦呈正相關(guān)，與本組的研究結(jié)果相近。

綜上可見，p-mTOR、p70s6k蛋白在非小細胞肺癌組織中高表達，可作為早期診斷肺癌的預(yù)警指標或抗癌藥物作用的新靶點，通過選擇mTOR抑制劑來調(diào)控p-mTOR/p70s6k信號通路，可能為肺癌的治療提出新途徑。

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Expression of p-mTOR and p70s6k in non-small-cell lung cancer and its clinical significance

XUHaoran1,LYUYanchao,HANShuangshuang,WANGLihong,YUEHongjuan,WANGJia

(1ChengdeCentralHospital,Chengde067000,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the expression changes of phosphorylated mammalian target of rapamycin (p-mTOR) and p70s6k protein in non-small-cell lung cancer (NSCLC) tissues and to discuss its clinical significance. MethodsEighty-two cases of patients with NSCLC were selected. The tumor tissues obtained from surgery (lung cancer group), 46 cases of tissue samples from alveolus healthy tissues (control group 1), and 50 cases of tissue samples from bronchus mucosal tissues (control group 2) were collected. The expression of p-mTOR and p70s6k protein in the three groups was measured by immunohistochemistry and we analyzed the relationships with the clinical and pathological data. ResultsThe positive expression rates of p-mTOR protein in the lung cancer group, control group 1 and control group 2 were 68.29%, 17.39% and 32.0%, respectively. The positive expression rates of p70s6k protein in the lung cancer group, control group 1 and control group 2 were 85.37%, 21.74% and 32.00%, respectively. Significant difference was found between the lung cancer group and the control group 1, control group 2 (all P<0.01). The expression of p-mTOR protein in poorly differentiated cancer tissues was significantly higher than that of medium and high differentiation cancer tissues (P<0.01). In the NSCLC tissues, the p-mTOR and p70s6k expression was positively correlated (r=0.210, P=0.003 2). Conclusionp-mTOR and p70s6k protein is highly expressed in NSCLC tissues, which may be used as the early-warning index in the early diagnosis or as a new target for anti-cancer drug.

Key words:lung neoplasms; non-small-cell lung cancer; phosphorylated mammalian target of rapamycin; p70s6k

(收稿日期：2015-12-04)

中圖分類號：R734.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)11-0011-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.004

通信作者簡介：王嘉(1971-)，女，副主任，副主任醫(yī)師，主要研究方向為慢性阻塞性肺疾病、哮喘的診斷與治療。E-mail: tim32@126.com

第一作者簡介：許浩然(1981-)，男，主治醫(yī)師，主要研究方向為慢性阻塞性肺疾病、哮喘的診斷與治療。E-mail:xuhaoran1981@163.com

基金項目：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃項目(20090333)；河北省科技計劃自籌經(jīng)費項目(152777233)。