楊玉婷，譚曉虹，岑洪 (廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧 530021)

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Akt抑制劑與利妥昔單抗聯(lián)合應(yīng)用對(duì)伯基特淋巴瘤細(xì)胞株Daudi增殖及凋亡的影響

楊玉婷，譚曉虹，岑洪 (廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧 530021)

摘要：目的探討Akt抑制劑(AZD5363)與利妥昔單抗聯(lián)合應(yīng)用對(duì)伯基特淋巴瘤(BL)細(xì)胞株Daudi增殖和凋亡的影響，并探討其相關(guān)機(jī)制。方法培養(yǎng)人BL細(xì)胞株Daudi，將其分為對(duì)照組(只含等量溶媒)、AZD5363組(加入40 μmol/L AZD5363)、利妥昔單抗組(加入50 μg/mL利妥昔單抗)、聯(lián)合用藥組(加入40 μmol/L AZD5363+50 μg/mL利妥昔單抗)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72 h。分別采用CCK8法、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)算AZD5363、利妥昔單抗及兩者聯(lián)合對(duì)Daudi細(xì)胞的增殖抑制和凋亡率，采用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞磷酸化Akt(p-Akt)和總Akt(T-Akt)蛋白。結(jié)果與AZD5363組、利妥昔單抗組相比，聯(lián)合用藥組在24、48、72 h時(shí)Daudi細(xì)胞增殖抑制率高(P均<0.05)。AZD5363組、利妥昔單抗組、聯(lián)合用藥組與對(duì)照組相比，聯(lián)合用藥組與AZD5363組、利妥昔單抗組相比，干預(yù)Daudi細(xì)胞48、72 h后細(xì)胞凋亡率高(P均<0.05)。對(duì)照組、AZD5363組、利妥昔單抗組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞p-Akt相對(duì)表達(dá)量分別為0.59±0.06、0.33±0.03、0.45±0.04、0.18±0.04，AZD5363組、利妥昔單抗組、聯(lián)合用藥組與對(duì)照組相比，聯(lián)合用藥組與AZD5363組、利妥昔單抗組相比，P均<0.05。結(jié)論AZD5363與利妥昔單抗聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)對(duì)BL細(xì)胞株Daudi的增殖抑制作用，促使細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制Akt磷酸化，阻斷PI3k/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：伯基特淋巴瘤；Daudi細(xì)胞；利妥昔單抗；磷酸化Akt

近年來(lái)，靶向治療成為繼手術(shù)、放療、化療后腫瘤治療最有效的手段。分子靶向治療藥物血液學(xué)毒性低、患者耐受性好。已有證據(jù)表明，伯基特淋巴瘤(BL)的病理機(jī)制與PI3K/Akt信號(hào)通路異常密切相關(guān)，該通路持續(xù)活化及MYC基因過(guò)表達(dá)協(xié)同促進(jìn)人BL的發(fā)生、發(fā)展。Akt是P13K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的樞紐基因，通過(guò)Akt抑制劑AZD5363干擾該靶點(diǎn)，阻斷PI3K/Akt通路，能否抑制Daudi細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡目前研究較少。利妥昔單抗聯(lián)合化療的療效優(yōu)于單純化療，目前廣泛應(yīng)用于BL的治療。本研究觀察了Akt抑制劑AZD5363與利妥昔單抗聯(lián)合應(yīng)用對(duì)BL細(xì)胞株Daudi增殖和凋亡的影響，并探討其機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器利妥昔單抗(10 mg/mL)為羅氏公司產(chǎn)品。AZD5363購(gòu)自Selleck中國(guó)分公司。細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒(CCK8)購(gòu)自上海七海復(fù)泰公司。RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。Annexin V-PE凋亡試劑盒購(gòu)自BD Biosciences公司。抗磷酸化抗體[磷酸化Akt(p-Akt)]、總Akt(T-Akt,均為抗兔多克隆抗體)、內(nèi)參照GAPDH及其相對(duì)應(yīng)的二抗均購(gòu)自Abcam公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BIO RAD公司。

1.2細(xì)胞來(lái)源及培養(yǎng)BL細(xì)胞株Daudi購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的RMPI1640培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng),置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3AZD5363聯(lián)合利妥昔單抗對(duì)Daudi細(xì)胞增殖影響的觀察采用CCK8法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Daudi細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL,以每孔100 μL接種于96孔板，細(xì)胞分為空白調(diào)零組(不接種細(xì)胞)、對(duì)照組(只含等量溶媒)、AZD5363組(分別加入5、10、20、40、80 μmol/L AZD5363)、利妥昔單抗組(分別加入25、50、75、100 μg/mL利妥昔單抗)，置于含有5% CO2的37 ℃孵箱內(nèi)進(jìn)行孵育24 h。25、50、75、100 μg/mL的利妥昔單抗作用24 h對(duì)Daudi細(xì)胞的抑制率分別為16.35%、18.15%、21.89%、24.36%，可見(jiàn)利妥昔單抗在體外對(duì)Daudi細(xì)胞表現(xiàn)出較弱的增殖抑制作用，50 μg/mL的利妥昔單抗對(duì)Daudi細(xì)胞的抑制率已基本達(dá)效應(yīng)平臺(tái)，因此本研究選用50 μg/mL作為聯(lián)合用藥的利妥昔單抗最終藥物濃度。濃度為5、10、20、40、80 μmol/L的AZD5363作用24 h對(duì)Daudi細(xì)胞對(duì)應(yīng)的抑制率分別為5.61%、13.42%、18.02%、21.32%、45.23%，隨著AZD5363濃度的增加，其抑制率增加，選用中間抑制濃度40 μmol/L作為與利妥昔單抗(50 μg/mL)聯(lián)合的干預(yù)濃度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Daudi細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL,以每孔100 μL接種于96孔板，設(shè)置對(duì)照組(只含等量溶媒)、AZD5363組(加入40 μmol/L AZD5363)、利妥昔單抗組(加入50 μg/mL利妥昔單抗)、聯(lián)合用藥組(加入40 μmol/L AZD5363+50 μg/mL利妥昔單抗)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，孵育24～72 h。孵育結(jié)束加入10 μL CCK8試劑,孵育2 h，測(cè)定樣品在450 nm的吸光度值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)完成3次，計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率。

1.4 AZD5363聯(lián)合利妥昔單抗對(duì)Daudi細(xì)胞凋亡影響的觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Daudi細(xì)胞懸液接種于25 mL培養(yǎng)瓶，按1.3設(shè)置對(duì)照組、AZD5363組、利妥昔單抗組、聯(lián)合用藥組，培養(yǎng)48～72 h后收集細(xì)胞，按照Becton Dieainson公司AnnexinV-PE雙染試劑盒說(shuō)明書(shū)處理后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組Daudi細(xì)胞的凋亡情況。

1.5細(xì)胞p-Akt、Akt蛋白檢測(cè)采用Western blotting法。取Daudi細(xì)胞懸液，按1.3設(shè)置對(duì)照組、AZD5363組、利妥昔單抗組、聯(lián)合用藥組，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，提取各組細(xì)胞的總蛋白，取40～60 μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳50 min,4 ℃ 150 V轉(zhuǎn)膜約1.5 h，封閉，洗膜，分別加入p-Akt、T-Akt、GAPDH的一抗,4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜，加入二抗室溫孵育,用顯色劑顯色成像，分析各條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參校正相對(duì)蛋白表達(dá)量。

2結(jié)果

AZD5363組、利妥昔單抗組、聯(lián)合用藥組在24 h時(shí)Daudi細(xì)胞增殖抑制率分別為21.32%、18.15%、35.13%，48 h時(shí)分別為35.64%、20.44%、44.73%，72 h時(shí)分別為47.31%、22.19%、71.33%，聯(lián)合用藥組與AZD5363組、利妥昔單抗組相比，P均<0.05。對(duì)照組、AZD5363組、利妥昔單抗組、聯(lián)合用藥組干預(yù)Daudi細(xì)胞48 h后細(xì)胞凋亡率分別為12.53%、29.17%、19.96%、47.21%，72 h時(shí)分別為14.01%、40.70%、22.61%、65.23%，AZD5363組、利妥昔單抗組、聯(lián)合用藥組與對(duì)照組相比，聯(lián)合用藥組與AZD5363組、利妥昔單抗組相比，P均<0.05。各組p-Akt、T-Akt蛋白表達(dá)情況見(jiàn)表1。

表1　各組p-Akt、T-Akt蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與AZD5363組、利妥昔單抗組相比，△P<0.05。

3討論

BL是一種高侵襲性的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，占全部NHL的3%～5%，占兒童全部淋巴瘤的30%～50%。通過(guò)高劑量強(qiáng)度的多藥化療、中樞神經(jīng)系統(tǒng)侵犯的預(yù)防治療、不斷改善的支持治療，BL患者的預(yù)后顯著改善[1]。老年患者常常難以完成大劑量的多藥化療，這有可能是導(dǎo)致療效不佳的重要原因。利妥昔單抗是針對(duì)CD20的單克隆抗體，在一些惰性淋巴瘤和侵襲性淋巴瘤的治療中取得了非常好的效果，利妥昔單抗聯(lián)合化療已成為這些淋巴瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方案[2,3]。

對(duì)于難以完成大劑量多藥化療的BL患者，能否通過(guò)分子靶向治療來(lái)改善預(yù)后目前研究較少。小分子靶向治療在一些血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體瘤中取得了非常好的療效，而MYC基因異常是導(dǎo)致BL發(fā)生的病理生理學(xué)基礎(chǔ)[4]，PI3K信號(hào)能夠阻止MYC降解，維持其活性[5]。最近在BL中發(fā)現(xiàn)一些突變能夠激活PI3K信號(hào)通路[6]，PI3K激活能在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3,導(dǎo)致Akt活化?；罨腁kt通過(guò)磷酸化多種酶、激酶和轉(zhuǎn)錄因子等下游因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能(包括凋亡、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期的停滯及葡萄糖代謝等)。研究證實(shí)PI3K/Akt通路在多種實(shí)體瘤、血液惡性腫瘤細(xì)胞系及體內(nèi)的腫瘤持續(xù)活化[7,8]。應(yīng)用PI3K/Akt通路抑制劑可以下調(diào)Akt的磷酸化，因而PI3K/Akt通路可作為治療BL的靶點(diǎn)。PI3K抑制劑或Akt抑制劑對(duì)BL都具有抗腫瘤療效，PI3K抑制劑如idelalisib、duvelisib等治療BL的研究已較多，而Akt抑制劑治療BL的研究則較少[9]。此外，亦有研究證實(shí)，Akt抑制劑AZD5363可以抑制41～182種實(shí)體及血液腫瘤細(xì)胞，單藥或聯(lián)合用藥治療多種惡性腫瘤具有潛在療效[10]。因而，本實(shí)驗(yàn)對(duì)Akt抑制劑AZD5363、利妥昔單抗及兩者聯(lián)合作用于BL細(xì)胞株Daudi的化療效果進(jìn)行探討。研究結(jié)果顯示，AZD5363能夠抑制Daudi細(xì)胞的增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而聯(lián)合利妥昔單抗對(duì)Daudi細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制及促凋亡作用明顯增強(qiáng)，單藥利妥昔單抗對(duì)Daudi細(xì)胞作用不明顯，僅有輕微的生長(zhǎng)抑制及促凋亡作用。本研究結(jié)果顯示，AZD5363組、利妥昔單抗組、聯(lián)合用藥組較對(duì)照組細(xì)胞p-Akt表達(dá)量低，聯(lián)合用藥組較AZD5363組、利妥昔單抗組細(xì)胞p-Akt表達(dá)量低，提示AZD5363、利妥昔單抗可能是通過(guò)抑制Akt蛋白磷酸化來(lái)抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

可見(jiàn)，AZD5363與利妥昔單抗聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)對(duì)BL細(xì)胞株Daudi的增殖抑制作用并促使細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制Akt磷酸化，阻斷PI3k/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

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Effects of Akt inhibitor combined with rituximab on proliferation and apoptosis of Burkitt′s lymphoma cell line Daudi

YANGYuting,TANXiaohong,CENHong

(TumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of Akt inhibitor (AZD5363) combined with rituximab on cell proliferation and apoptosis of Burkitt′s lymphoma (BL) Daudi cells in vitro, and to explore its mechanism. MethodsHuman BL Daudi cells were cultured and then were divided into four groups: the control group (treated by 1640 culture medium with fetal bovine serum), AZD5363 group (treated by 40 μmol/L AZD5363), rituximab group (treated by 50 μg/mL rituximab) and the combination group (treated by 40 μmol/L AZD5363 + 50 μg/mL rituximab). They were all put into the incubator for 24-72 h. The growth inhibition and apoptosis rate of Daudi cells were detected by CCK-8 colorimetry and flow cytometer respectively. In addition, the expression of phosphorylated Akt (p-Akt) and total Akt (T-Akt) was detected by Western blotting.ResultsThe growth inhibition rate of the combination group after 24, 48 and 72 h was significantly increased as compared with that of the AZD5363 and rituximab groups (all P<0.05). The difference of apoptosis rate among the control group and AZD5363 group, rituximab group and the combination group was statistically significant after 48 and 72 h, and the apoptosis rate in the combination group was higher than those of the AZD5363 and rituximab group after 48 and 72 h (all P<0.05). The expression of p-Akt in the control group, AZD5363 group, rituximab group and the combination group were respectively 0.59±0.06, 0.33±0.03, 0.45±0.04 and 0.18±0.04 after 24 h, and the difference of expression of p-Akt was statistically significant among the control group and experimental groups, between AZD5363 group and the combination group, between the combination group and AZD5363 group, rituximab group (all P<0.05). ConclusionsAZD5363 in combination with rituximab can significantly inhibit cell proliferation and promote the apoptosis of BL Daudi cells. Inhibition of Akt phosphorylation and blocking of PI3k/Akt signal transduction pathway may be the mechanism of its antitumor effect.

Key words:Burkitt′s lymphoma; Daudi cells; rituximab; phosphorylated Akt

(收稿日期：2015-12-07)

中圖分類號(hào)：R733

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)11-0008-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.003

通信作者簡(jiǎn)介：岑洪(1971-)，男，碩士研究生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)檠耗[瘤的基礎(chǔ)與靶向治療。E-mail： cenhong02@163.com

第一作者簡(jiǎn)介：楊玉婷(1990-)，女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)檠耗[瘤的基礎(chǔ)與靶向治療。E-mail： 2403124794@qq.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160298)；廣西醫(yī)療衛(wèi)生適宜技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)課題(S201301-02) 。