祁承林，梁娟，李恒，楊學(xué)敏，唐安洲(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

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芒柄花黃素對人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1凋亡的誘導(dǎo)作用及其機制探討

祁承林，梁娟，李恒，楊學(xué)敏，唐安洲(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

摘要：目的觀察芒柄花黃素對人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，并探討其相關(guān)機制。方法用含不同濃度(0、5、10、20、40、80、160 μmol/L)芒柄花黃素的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1 24、48、72 h，采用MTT法觀察芒柄花黃素對HONE1細(xì)胞活性的影響。采用Hoechst33258熒光染色從形態(tài)學(xué)上觀察芒柄花黃素處理的HONE1細(xì)胞凋亡情況。用Western blotting檢測不同濃度(0、5、10、20、40 μmol/L)芒柄花黃素處理的HONE1細(xì)胞的p-Akt、Akt、BAX和Bcl-2蛋白。結(jié)果Hoechst33258熒光染色結(jié)果顯示，芒柄花黃素處理較未處理的人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加。0、5、10、20、40 μmol/L芒柄花黃素處理48 h后HONE1細(xì)胞p-Akt/Akt值分別為0.311±0.035、0.169±0.029、0.116±0.038、0.143±0.012、0.082±0.015，5、10、20、40 μmol/L與0 μmol/L比較，P均<0.05。0、5、10、20、40 μmol/L芒柄花黃素處理48 h后HONE1細(xì)胞BAX/Bcl-2值分別為1.445±0.167、1.678±0.257、2.637±0.619、3.292±0.339、4.285±0.899，10、20、40 μmol/L與0 μmol/L比較，P均<0.05。結(jié)論芒柄花黃素可誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1細(xì)胞凋亡，這可能是通過下調(diào)p-Akt/Akt、上調(diào)BAX/Bcl-2實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：芒柄花黃素；鼻咽癌；細(xì)胞凋亡；B淋巴細(xì)胞瘤2

當(dāng)前，對于鼻咽癌[1]的治療是以放療為主結(jié)合化療的綜合治療。但傳統(tǒng)放化療會引起患者局部及全身一系列不良反應(yīng)。因此尋找一種具有低毒、高效的新型化療替代藥是當(dāng)前抗鼻咽癌研究的熱點。從中草藥提取出的成分如馬鈴薯提取物、苦參堿等因具有抗腫瘤活性[2,3]而越來越引起研究者重視。中草藥作為抗鼻咽癌輔助治療比單純應(yīng)用放療或者化療能更顯著提高患者生存質(zhì)量，減輕不良反應(yīng)，改善免疫功能[4]。芒柄花黃素是黃芪的主要活性成分，對乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌等具有一定的抗腫瘤活性[5～7]，但對于鼻咽癌的作用卻鮮有報道。且鼻咽癌多為未分化癌。本研究觀察了芒柄花黃素對低分化人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用并探討其相關(guān)機制。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器MTT、PBS、二甲基亞砜(DMSO)、Hoechst33258染料購自Sigma公司；RIPA細(xì)胞裂解液、BCA試劑盒購自碧云天公司；一抗兔抗BAX、Bcl-2、Akt、p-Akt，二抗HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(CST)及內(nèi)參GAPDH購自康成生物有限公司。CKX41倒置顯微鏡(Olympus公司)。

1.2細(xì)胞來源及培養(yǎng)方法人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1購于中南大學(xué)湘雅中心實驗室，于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗中心鼻咽癌實驗室液氮保存，傳代培養(yǎng)。細(xì)胞用含有10%胎牛血清(Gibco)和1%青鏈霉素溶液(索萊寶)的RPMI1640培養(yǎng)液于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。在細(xì)胞生長對數(shù)期時用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液(索萊寶)消化傳代。取對數(shù)生長期HONE1細(xì)胞株進行后續(xù)實驗。

1.3芒柄花黃素對細(xì)胞活性的影響觀察采用MTT法。將人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1按照5 000個/孔均勻接種于96孔板內(nèi)，恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁后換液。用含不同濃度(0、5、10、20、40、80、160 μmol/L)芒柄花黃素(購于天津士蘭科技有限公司，生產(chǎn)批號:20140516)的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1 24、48、72 h(每組設(shè)置2個復(fù)孔，重復(fù)實驗3次)。再按20 μL/孔將預(yù)先配置好濃度為5 mg/mL的MTT溶液加入培養(yǎng)孔后將培養(yǎng)板置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，室溫避光震蕩10 min。最后在酶標(biāo)儀上以490 nm波長檢測每孔的吸光度(A值)，計算細(xì)胞活性。細(xì)胞活性=實驗組A值/對照組A值。0、5、10、20、40、80、160 μmol/L芒柄花黃素處理人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1 24 h的細(xì)胞活性分別為100%、89.5%、72.9%、47.4%、41.8%、35.8%、28.5%，48 h的細(xì)胞活性分別為100.0%、89.5%、64.4%、45.3%、38.6%、31.1%、27.7%，72 h的細(xì)胞活性分別為100.0%、81.1%、61.7%、38.0%、27.4%、21.8%、18.2%。芒柄花黃素對HONE1細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用且具有濃度依賴性(P均<0.05)，但沒有明顯的時間依賴性(P均>0.05)。根據(jù)各組A值，參考趙斌等[8]提出的方法，計算出芒柄花黃素處理HONE1細(xì)胞不同時間段的半數(shù)抑制濃度(IC50)，24 h IC50為17.54 μmol/L，48 h IC50為28.09 μmol/L，72 h IC50為33.94 μmol/L?？紤]到24 h內(nèi)細(xì)胞處于適應(yīng)階段，而72 h藥物作用時間較長，影響細(xì)胞生存狀態(tài)，因此本研究后續(xù)實驗均采用48 h為藥物作用時間。

1.4芒柄花黃素對細(xì)胞凋亡的影響觀察采用Hoechst33258法。將人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1均勻接種于底面鋪有無菌處理后的蓋玻片的6孔板內(nèi)，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后分別用不含芒柄花黃素的培養(yǎng)基(空白對照組)、40 μmol/L芒柄花黃素的培養(yǎng)基(實驗組)換液。在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS潤洗后加入4%多聚甲醛常溫固定10 min。再用配置好的Hoechst33258工作液避光孵育10 min，PBS潤洗后，取出蓋玻片，用抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.5細(xì)胞BAX、Bcl-2、Akt、p-Akt蛋白檢測采用Western blotting法。將用含不同濃度(0、5、10、20、40 μmol/L)芒柄花黃素的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)48 h后的HONE1細(xì)胞，用PBS潤洗后加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，4 ℃裂解30 min，高速離心后取上清液。再按照BCA試劑盒說明書測定總蛋白濃度后加入適量蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱5 min使蛋白變性后分裝，-20 ℃保存。取30 μg總蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1.5 h，TBST潤洗后4 ℃孵育一抗過夜，次日在常溫?fù)u床下孵育二抗(1∶10 000)。分別檢測Akt(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、BAX(1∶2 000)、Bcl-2(1∶1 000)的蛋白，以GAPDH(1∶8 000)作為內(nèi)參。ECL壓片顯影，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，觀察蛋白相對定量。計算p-Akt/Akt值、BAX/Bcl-2值。

2結(jié)果

Hoechst33258熒光染色結(jié)果顯示，人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1細(xì)胞核呈現(xiàn)藍色熒光，凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)固縮，呈顆粒狀或聚集，斷裂成片段。空白對照組(圖1A)藍色熒光分布較均勻，而實驗組(圖1B)呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)的HONE1細(xì)胞數(shù)明顯增加。0、5、10、20、40 μmol/L芒柄花黃素處理48 h后HONE1細(xì)胞p-Akt/Akt值分別為0.311±0.035、0.169±0.029、0.116±0.038、0.143±0.012、0.082±0.015，5、10、20、40 μmol/L與0 μmol/L比較，P均<0.05。0、5、10、20、40 μmol/L芒柄花黃素處理48 h后HONE1細(xì)胞BAX/Bcl-2值分別為1.445±0.167、1.678±0.257、2.637±0.619、3.292±0.339、4.285±0.899，10、20、40 μmol/L與0 μmol/L比較，P均<0.05。

注：圖中箭頭所示為調(diào)亡細(xì)胞核。

圖1兩組凋亡細(xì)胞檢測(×200)

3討論

芒柄花黃素是富含于傳統(tǒng)中藥材黃芪側(cè)根的一種異黃酮類植物雌激素[9]。它對多種惡性腫瘤具有抗腫瘤效應(yīng)。但不同腫瘤的發(fā)病機理不盡相同，研究芒柄花黃素對鼻咽癌的作用及其機制對于開發(fā)抗腫瘤新藥以及探尋藥物作用鼻咽癌效應(yīng)靶點都具有深遠意義。本研究通過MTT實驗證實芒柄花黃素對鼻咽癌細(xì)胞株HONE1具有顯著的增殖抑制效應(yīng)。

細(xì)胞凋亡在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中占有重要地位，凋亡信號通路是當(dāng)前抗腫瘤研究的熱點[10]。本研究Hoechst33258染色結(jié)果顯示，芒柄花黃素能誘導(dǎo)HONE1細(xì)胞凋亡，與MTT結(jié)果相吻合，芒柄花黃素是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制HONE1細(xì)胞增殖。經(jīng)典的細(xì)胞凋亡途徑包括含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族主導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑；腫瘤壞死因子受體家族主導(dǎo)的死亡受體凋亡途徑以及Bcl-2家族主導(dǎo)的線粒體凋亡途徑。其中，線粒體凋亡途徑與化療藥物抗腫瘤作用關(guān)系密切[11]。在線粒體凋亡途徑中，Bcl-2基因發(fā)揮抗凋亡作用，而BAX作用則相反，同時該凋亡途徑受上游信號通路調(diào)控[10]。磷脂酰肌醇激酶3/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路與細(xì)胞的增殖、分化、代謝等關(guān)系密切，其中Akt的活化在鼻咽癌的進展和侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[12]。PI3K/Akt信號通路能夠通過多種途徑發(fā)揮抗凋亡作用，在鼻咽癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等多種惡性腫瘤中失調(diào)?？鼓[瘤藥物可通過靶向抑制PI3K/Akt信號通路而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，芒柄花黃素呈濃度依賴性下調(diào)Akt磷酸化水平并增大BAX/Bcl-2。因此，我們推測芒柄花黃素可能通過作用PI3K/Akt信號通路激活線粒體凋亡途徑而誘導(dǎo)HONE1細(xì)胞凋亡。

綜上所述，芒柄花黃素可誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1細(xì)胞凋亡，這可能是通過下調(diào)p-Akt/Akt、上調(diào)BAX/Bcl-2實現(xiàn)的。

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Induction of formononetin on apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cell line HONE1 and its mechanism

QIChenglin,LIANGJuan,LIHeng,YANGXuemin,TANGAnzhou

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the induction of formononetin on apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cell line HONE1 and to investigate its mechanism.MethodsHONE1 cells were cultured with different concentrations of formononetin (0, 5, 10, 20, 40, 80 and 160 μmol/L) for separated time (24, 48 and 72 h). Cell viability of HONE1 was examined using an MTT assay. The apoptosis of HONE1 cells from morphological changes after being treated with formononetin was examined by Hoechst33258 assay. The proteins (p-Akt, Akt, BAX and Bcl-2) of HONE1 cells were tested by Western blotting after being treated with different concentrations of formononetin (0, 5, 10, 20 and 40 μmol/L) for 48 h. ResultsHoechst33258 fluorescence staining showed that the number of apoptosis of HONE1 cells was increased after being treated with formononetin as compared with the cells without treatment. The p-Akt/Akt values of HONE1 cells which were treated with different concentrations of formononetin (0, 5, 10, 20 and 40 μmol/L) for 48 h were 0.311±0.035, 0.169±0.029, 0.116±0.038, 0.143±0.012 and 0.082±0.015, respectively. Significant difference was found between 0 μmol/L and 5, 10, 20 and 40 μmol/L (all P<0.05). The BAX/Bcl-2 values of HONE1 cells which were treated with different concentrations of formononetin (0, 5, 10, 20 and 40 μmol/L) for 48 h were 1.445±0.167, 1.678±0.257, 2.637±0.619, 3.292±0.339 and 4.285±0.899, respectively. Significant difference was found between 0 μmol/L and 10, 20 and 40 μmol/L (all P<0.05).ConclusionFormononetin can induce the apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cell line HONE1, which may be mediated by down-regulating p-Akt/Akt and up-regulating BAX/Bcl-2.

Key words:formononetin; nasopharyngeal carcinoma; apoptosis; Bcl-2

(收稿日期：2015-12-05)

中圖分類號：R979.1

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)11-0005-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.002