付洪義 章志華 劉寧 池躍鵬 劉會(huì) 張勤鳳 宋韜

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·論著·

胸腔積液γ-干擾素釋放試驗(yàn)對(duì)老年結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值

付洪義 章志華 劉寧 池躍鵬 劉會(huì) 張勤鳳 宋韜

目的 評(píng)價(jià)胸腔積液γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assay，IGRA)對(duì)老年結(jié)核性胸膜炎(pleural effusion，PE)的診斷價(jià)值。方法 選取2013年1月至2015年7月在河北省胸科醫(yī)院結(jié)核內(nèi)科疑似為結(jié)核性胸膜炎的133例老年住院患者，同時(shí)進(jìn)行胸腔積液和外周血的IGRA，依據(jù)最終結(jié)果將患者分為確診結(jié)核性胸膜炎組(簡(jiǎn)稱“確診組”)、臨床診斷結(jié)核性胸膜炎組(簡(jiǎn)稱“臨床診斷組”)、非結(jié)核性胸膜炎組，比較各組胸腔積液和外周血IGRA的敏感度與特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值與陰性預(yù)測(cè)值。結(jié)果 13例(9.77%)確診為結(jié)核性胸膜炎，63例(47.37%)臨床診斷為結(jié)核性胸膜炎，57例(42.86%)為非結(jié)核性胸膜炎。胸腔積液IGRA的敏感度為90.79%(69/76)，明顯高于外周血的67.11%(51/76)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.826，P<0.001)；胸腔積液IGRA的特異度為98.25%(56/57)，明顯高于外周血的84.21%(48/57)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.015，P=0.016)；胸腔積液IGRA的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為98.57%(69/70)，高于外周血的85.00%(51/60)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.380，P<0.001)；胸腔積液IGRA的陰性預(yù)測(cè)值為88.89%(56/63)，明顯高于外周血的65.75%(48/73)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.059，P=0.002)。結(jié)論 與外周血IGRA相比，胸腔積液IGRA可大幅提高對(duì)老年結(jié)核性胸膜炎的敏感度和特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值，明顯提高對(duì)老年結(jié)核性胸膜炎的診斷水平。

干擾素γ； 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)； 結(jié)核，胸膜； 老年人； 胸腔積液； 敏感性與特異性

結(jié)核性胸膜炎(pleural effusion,PE)是最為常見(jiàn)的一種胸膜炎癥性疾病，是胸膜對(duì)結(jié)核分枝桿菌的高強(qiáng)度變態(tài)反應(yīng)的結(jié)果，可在不同年齡段發(fā)病[1]。隨著我國(guó)人口的老齡化，老年結(jié)核性胸膜炎患者也呈逐漸增高的趨勢(shì)。老年患者代償能力差，一旦誤診或漏診，往往致病情危重，造成較高的死亡率[2]。這就需要一種微創(chuàng)甚至是無(wú)創(chuàng)、快速而又準(zhǔn)確的診斷老年結(jié)核性胸膜炎的方法。γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assay，IGRA)以其對(duì)檢查結(jié)核分枝桿菌感染獨(dú)有的敏感度和特異度被廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)中[2]，目前主要用于外周血的檢測(cè)。由于結(jié)核分枝桿菌感染所引起的機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)使大量釋放γ-干擾素的淋巴細(xì)胞趨化、聚集至感染部位，因此胸腔積液的γ-干擾素釋放試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果可能比外周血的更準(zhǔn)確[3]。本研究對(duì)河北省胸科醫(yī)院結(jié)核內(nèi)科收住入院的疑似結(jié)核性胸膜炎的老年患者同時(shí)進(jìn)行胸腔積液和外周血的IGRA，比較胸腔積液和外周血的IGRA對(duì)老年結(jié)核性胸膜炎的診斷效能。

資料與方法

一、一般資料

選取河北省胸科醫(yī)院結(jié)核內(nèi)科2013年1月至2015年7月疑似為結(jié)核性胸膜炎的133例老年住院患者作為研究對(duì)象。對(duì)所有患者同時(shí)進(jìn)行胸腔積液和外周血的IGRA，根據(jù)患者結(jié)核分枝桿菌的抗酸染色、培養(yǎng)、組織病理學(xué)檢查，以及結(jié)合臨床癥狀與體征、影像學(xué)檢查、彩色超聲檢查、臨床藥物治療效果，將患者分為：確診結(jié)核性胸膜炎組(簡(jiǎn)稱“確診組”)，共計(jì)13例(9.77%)，年齡65～76歲，平均年齡(68.6±2.4)歲，其中男10例(76.92%)，女3例(23.08%)；臨床診斷結(jié)核性胸膜炎組(簡(jiǎn)稱“臨床診斷組”)，共計(jì)63例(47.37%)，年齡66～78歲，平均年齡(69.3±3.6)歲，其中男53例(84.13%)，女10例(15.87%)；非結(jié)核性胸膜炎組，共計(jì)57例(42.86%)，包括炎性胸膜炎8例(14.03%)，惡性胸膜炎37例(64.91%)，風(fēng)濕免疫性胸膜炎6例(10.53%)，原因不明6例(10.53%)，年齡65～83歲，平均年齡(69.4±4.2)歲，其中男46例(80.70%)，女11例(19.30%)。

1.研究對(duì)象入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥65歲；(2)既往無(wú)結(jié)核病病史，無(wú)糖尿病及風(fēng)濕免疫病病史，無(wú)其他肺部疾病史，無(wú)HIV感染，無(wú)妊娠，無(wú)嚴(yán)重肝腎功能衰竭病史，近期(3個(gè)月內(nèi))未應(yīng)用免疫抑制劑及增強(qiáng)劑；(3)胸腔彩色超聲檢查顯示胸腔積液；(4)抗結(jié)核藥物治療4周之內(nèi)；(5)簽署患者知情同意書(shū)。

2.分組標(biāo)準(zhǔn)：(1)確診組：胸腔積液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性，或抗酸染色陽(yáng)性，或胸膜活檢病理顯示干酪樣壞死的肉芽腫性改變；(2)臨床診斷組：有發(fā)熱、乏力、納差、盜汗、消瘦等典型的結(jié)核全身中毒癥狀，結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性(硬結(jié)平均直徑≥15 mm或出現(xiàn)水皰、壞死及淋巴管炎)和(或)血清結(jié)核抗體陽(yáng)性，實(shí)驗(yàn)室檢查(常規(guī)、生化)符合結(jié)核性滲出液特點(diǎn)[白細(xì)胞數(shù)增高，以淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞為主；胸腔積液腺苷脫氨酶(ADA)>45 U/L，胸腔積液ADA/血清ADA>1]，抗結(jié)核藥物治療(1個(gè)月)有效；(3)非結(jié)核性胸膜炎組：實(shí)驗(yàn)室及病理檢查結(jié)果均不支持結(jié)核性胸膜炎的診斷，可明確診斷為其他疾病，且治療原發(fā)病有效。

二、方法

1.主要試劑和儀器：(1)無(wú)血清培養(yǎng)基：RPMI(PPA laboratory Gmbh,Roswell Park Memorial Institute)-1640，GIBCO AIM-VTM(Invitrogen公司)；單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuckear cells，PBMCs)分離液：LymphoprepTM(Ads-Shield PocAS.Oslo.Norway)；無(wú)水乙醇(分析純)；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)：1× DPBS PH 7.4(美國(guó)GIBCOTM公司,catalogue number 14040-091)；T-SPOT.TB(結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn))試劑盒(Oxford Immunotec，Abingdon，UK)；結(jié)核菌素純蛋白衍生物(北京祥瑞制藥有限公司,purified protein derivative of tuberculin，TB-PPD)。(2)二級(jí)生物安全柜(美國(guó)Thermo Scientific公司),ELISPOT分析儀(德國(guó)ADI公司)：37 ℃，90%濕度，5%CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公司)；4 ℃冰箱BCD-257SL(青島海爾公司)；超大容量低溫離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific公司)；臺(tái)式振蕩器Vortex-Geniez(上海易擴(kuò)儀器有限公司)；電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；新型全自動(dòng)恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；移液器(美國(guó)Thermo Scientific公司)；肝素鋰真空采血管(美國(guó)BD公司,CPT，4 ml)；流式標(biāo)本檢測(cè)管(美國(guó)BD公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)板(美國(guó)HYCOR 生物醫(yī)學(xué)公司)。

2．T-SPOT.TB檢測(cè)：采用單盲的方法，用一次性胸穿包為患者行胸腔穿刺術(shù)，采集患者胸腔積液50 ml(肝素抗凝)，同時(shí)用肝素真空采血管收集外周血5 ml，并由研究人員在6 h內(nèi)分別完成二者的T-SPOT.TB檢測(cè)。T-SPOT.TB檢測(cè)以GIBCO AIM-VTM細(xì)胞培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，植物血凝素(PHA)作為陽(yáng)性對(duì)照，分別以結(jié)核分枝桿菌特異性抗原[早期分泌抗原靶6(ESAT-6)、培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)]作為刺激原。密度梯度離心(density gradient centrifugation)分離胸腔積液 (第1次為18 ℃，1800×g，離心30 min；處理后第2次為600×g，離心7 min，棄去上清液；處理后第3次為350×g，離心7 min，棄去上清液，將沉淀懸浮于0.7 ml AIM-V培養(yǎng)液之中),在預(yù)先包被抗IFN-γ單抗的微孔板上，分別加入抗原和胸腔積液或外周血中單個(gè)核細(xì)胞(2.5 ×109/L)， 將微孔板置于37 ℃，90%濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 18～20 h，加入二抗和顯色底物，顯色6～8 min。將微孔板置于通風(fēng)、避光、干燥處過(guò)夜，應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)分析儀計(jì)數(shù)斑點(diǎn)，每一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)分泌IFN-γ特異性T細(xì)胞。目視法判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)≥20個(gè)視為試驗(yàn)有效；陰性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)≤5個(gè)，A孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)或B孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)-陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，認(rèn)定結(jié)果為陽(yáng)性；若陰性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，A孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)或B孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)≥陰性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)×2，認(rèn)定結(jié)果為陽(yáng)性；若A孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)或B孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)的數(shù)量<20，且陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)≥20個(gè)，認(rèn)定結(jié)果為陰性。

3. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)資料的整理錄入與分析均用SPSS 18.0軟件進(jìn)行。兩組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

胸腔積液IGRA的敏感度、特異度均明顯高于外周血，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.826，P<0.001；χ2=7.015，P=0.016)；胸腔積液IGRA的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值均明顯高于外周血，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.380，P<0.001；χ2=10.059，P=0.002)(表1)。

討 論

伴隨我國(guó)進(jìn)入老齡化社會(huì)，老年肺結(jié)核發(fā)病患者逐年增加，導(dǎo)致老年結(jié)核性胸膜炎患者不斷增多。目前，確診結(jié)核性胸膜炎需要胸腔積液涂片發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌或者結(jié)核分枝桿菌液體培養(yǎng)陽(yáng)性，亦或胸膜活檢病理結(jié)果有干酪樣壞死的肉芽腫性組織；但前者陽(yáng)性檢出率極低，僅有1.7%～24.5%[4]，后者在采集樣本時(shí)又存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，故實(shí)際臨床診斷結(jié)核性胸膜炎主要依靠疾病史、典型的臨床癥狀與體征、胸部X線攝影、胸腔積液的實(shí)驗(yàn)室檢查，以及經(jīng)驗(yàn)性藥物治療后的效果評(píng)估等進(jìn)行綜合診斷。與其他人群相比，老年人器官功能衰退、多并發(fā)各種慢性疾病、免疫機(jī)能低下，故老年人罹患結(jié)核病時(shí)癥狀多不典型，且發(fā)病后病程長(zhǎng)，血性胸腔積液較多見(jiàn)，導(dǎo)致結(jié)核病的診斷和鑒別診斷較困難，往往造成病情診治的延誤，出現(xiàn)高死亡率[5-6]。因此，臨床工作中迫切需要一種新型的、微創(chuàng)甚至是無(wú)創(chuàng)的、快速而又準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)，以提高老年結(jié)核性胸膜炎的診斷準(zhǔn)確性。

IGRA是近年來(lái)結(jié)核病診斷技術(shù)的重大突破。大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，外周血IGRA對(duì)結(jié)核感染的診斷有較高的敏感度和特異度，但其在不同部位結(jié)核病的診斷敏感度不一致，且在結(jié)核病高流行地區(qū)其特異度也表現(xiàn)不佳，不能區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核感染，使其臨床應(yīng)用受限[7]。由于結(jié)核性胸膜炎的發(fā)生是結(jié)核分枝桿菌及其特異性抗原與CD4+T細(xì)胞為主的特異性T細(xì)胞相互作用的過(guò)程，胸腔積液中的各種細(xì)胞因子，如IFN-γ、白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-6等濃度水平均明顯高于外周血，局部病變呈現(xiàn)隔室化特點(diǎn)[8]，所以相對(duì)于外周血而言，其內(nèi)的抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量可能受結(jié)核潛伏感染影響較小。文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液中效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量與外周血比較可增高10～15倍[9]，提示在結(jié)核性胸腔積液中有足夠的效應(yīng)T細(xì)胞，這就使IGRA用于在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家中的結(jié)核性胸膜炎的診斷變成可能。目前，胸腔積液行T-SPOT.TB結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)還沒(méi)有明確的臨界值(cut-off值)，還是按照外周血的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷，希望本研究能對(duì)T-SPOT.TB在外周血以外的應(yīng)用提供依據(jù)。

表1 胸腔積液和外周血的IGRA診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值比較

注 敏感度=陽(yáng)性病例數(shù)/總數(shù)×100%；特異度=陰性病例數(shù)/總數(shù)×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性/(真陽(yáng)性+假陽(yáng)性)×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性/(真陰性+假陰性)×100%。表中括號(hào)內(nèi)數(shù)值分子為上述公式中的分子例數(shù)，分母為上述公式中的分母例數(shù)

本研究顯示在老年結(jié)核性胸膜炎患者中，胸腔積液IGRA的敏感度為90.79%(69/76)、特異度為98.25%(56/57)，明顯高于外周血的67.11%(51/76)和84.21%(48/57)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.826，P<0.001；χ2=7.015，P=0.016)。其原因可能是抗原特異性T細(xì)胞向胸膜病變部位聚集，從而使外周血的抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量減少。提示胸腔積液進(jìn)行IGRA檢測(cè)結(jié)果可以在一定程度上用于診斷老年結(jié)核性胸膜炎。

再者，本研究顯示，胸腔積液進(jìn)行IGRA檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為98.57%(69/70)、陰性預(yù)測(cè)值為88.89%(56/63)，高于外周血的85.00%(51/60)和65.75%(48/73)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.380，P<0.001；χ2=10.059，P=0.002)，可見(jiàn)胸腔積液進(jìn)行IGRA檢測(cè)結(jié)果能很好地幫助診斷老年結(jié)核性胸膜炎，并能為臨床醫(yī)生排除老年結(jié)核性胸膜炎提供有力依據(jù)。

本研究局限之處為僅有133例患者，確診組患者僅13例，導(dǎo)致敏感度、特異度等數(shù)據(jù)科學(xué)參考意義有限，需日后開(kāi)展大樣本研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，與外周血IGRA相比，胸腔積液IGRA可大幅提高對(duì)老年結(jié)核性胸膜炎診斷的敏感度和特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值，可明顯提高老年結(jié)核性胸膜炎的診斷水平。

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(本文編輯：孟莉 范永德)

Diagnostic value of pleural effusion detected with IGRA in the elderly with tuberculous pleurisy

FUHong-yi,ZHANGZhi-hua,LIUNing,CHIYue-peng,LIUHui,ZHANGQin-feng,SONGTao.

DepartmentofTuberculosisMedicine，HebeiChestHospital，Shijiazhuang050041，China

SONGTao,Email：115305048@qq.com

Objective To evaluate the value of pleural effusion detected with interferon-gamma release assay (IGRA) on diagnosis in the elderly with tuberculous pleurisy. Methods One hundred and thirty-three cases with suspected tuberculous pleurisy admitted in Hei Bei Chest Hospital were enrolled during Jan. 2013 to Jul. 2015. IGRA was tested for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) and pleural effusion (PE).All patients were divided into definite tuberculous pleurisy (confirmed group), probable tuberculous pleurisy (clinical diagnostic group) and non-tuberculous pleurisy group according to the composite reference standard (CRS). The sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) of IGRA detected for PBMC and PE were compared, respectively. Results There were 13 (9.77%) cases with tuberculous pleurisy, 63 (47.37%) cases with probable tuberculous pleurisy and 57 (42.86%) cases with non-tuberculous pleurisy. The sensitivity (90.79%, 69/76) of IGRA for PE was higher than that (67.11%, 51/76) for PBMC with significant difference statistically (χ2=12.826，P<0.001). The specificity (98.25%, 56/57) of IGRA for PE was higher than that (84.21%, 48/57) for PBMC with significant difference statistically (χ2=7.015，P=0.016). The PPV (98.57%,69/70) and NPV (88.89%,56/63) for PE were higher than those (85.00%,51/60 and 65.75%,48/73) for PBMC with significant difference statistically (χ2=8.380，P<0.001 andχ2=10.059，P=0.002). Conclusion Compared with the result of IGRA for PBMC, IGRA for PE can improve significantly the sensitivity, specificity, PPV and NPV and then improve significantly diagnostic level in the elderly with tuberculous pleurisy.

Interferon-gamma； Enzyme-linked immunospot assay； Tuberculous，pleura； Aged； Pleural effusion； Sensitivity and specificity

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.08.006

河北省2013年醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(20130440)

050041石家莊，河北省胸科醫(yī)院結(jié)核內(nèi)科(付洪義、劉寧、池躍鵬、劉會(huì)、張勤鳳、宋韜)，醫(yī)務(wù)處(章志華)

宋韜，Email：115305048@qq.com

2016-02-14)