于偉勇，何敬東，陳小飛，喻曉娟

(淮安市第一人民醫(yī)院，江蘇淮安223300)

胃癌組織Klf4表達變化及其臨床意義

于偉勇，何敬東，陳小飛，喻曉娟

(淮安市第一人民醫(yī)院，江蘇淮安223300)

目的 探討Krüppel樣因子4(Klf4)在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。方法 取54例胃癌患者的癌組織及其配對癌旁正常組織標本，采用RT-PCR技術(shù)檢測Klf4 mRNA的相對表達量，采用免疫組化法檢測Klf4蛋白的陽性表達率；分析Klf4蛋白的陽性表達與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 胃癌組織及癌旁正常組織Klf4 mRNA的相對表達量分別為0.12±0.04、0.25±0.06； Klf4蛋白的陽性表達率分別為46.3%(25/54)、77.8%(42/54)；兩組比較P均<0.05。Klf4蛋白的陽性表達與胃癌患者腫瘤臨床分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與患者性別、年齡無關(guān)(P均>0.05)。結(jié)論 Klf4低表達可能促進胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

胃癌；Krüppel樣因子4；臨床病理參數(shù)

據(jù)統(tǒng)計，胃癌的發(fā)病率在各類惡性腫瘤中居首位[1]。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的發(fā)生、發(fā)展及生物學行為受多個分子信號通路的影響，其中轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控這些分子信號通路的重要因素[2]。Krüppel樣因子4(Klf4)是一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，又稱胃腸富集KLF，在人體多種組織中廣泛存在；可參與調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等多種細胞的生物學行為，在不同組織中可與不同的靶基因相互作用，發(fā)揮抑癌或促癌作用[3,4]。本研究探討Klf4在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2008年3月～2011年1月在我院行手術(shù)治療的54例胃癌患者[男34例、女20例，年齡25～85(53.2±10.4)歲，其中年齡<60歲24例、≥60歲30例]癌組織及其配對癌旁正常組織(距癌組織邊緣>5 cm)標本，均經(jīng)組織病理檢查明確診斷。組織分化程度：高分化13例，中分化20例，低分化21例；TNM分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期13例，Ⅲ期15例，Ⅳ期7例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者23例。

1.2 胃癌組織及癌旁正常組織Klf4表達檢測 Klf4 mRNA檢測：采用RT-PCR法。取胃癌組織及其癌旁正常組織，采用RNA微量提取試劑盒提取總RNA?？俁NA經(jīng)DNAse Ⅰ處理，使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；采用ABI prismTM7700型熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR反應(yīng)。Klf4引物設(shè)計：上游引物5′-GCCACGTCTCCACACATCAG-3′，下游引物5′-TCTTGGCAGCAGGATAGTCCTT-3′。PCR反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火20 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算Klf4 mRNA的相對表達量，以GAPDH基因作為內(nèi)參。Klf4蛋白檢測： 采用免疫組化S-ABC法[5]。取胃癌組織及其癌旁正常組織，4%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液抗原修復，3%過氧化氫阻斷，加入Klf4兔抗人多克隆抗體(1∶1 000)4 ℃過夜，加入二抗室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，封片，倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。以細胞核或細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。陽性結(jié)果根據(jù)染色強度及陽性細胞比例綜合判定。染色強度：無色記0分，淡黃色記1分，黃色記2分，棕褐色記3分；陽性細胞比例：<10%記0分，≥10%～<25%記1分，≥25%～<50%記2分，≥50%～<75%記3分，≥75%記4分。兩項之和≤1分為陰性，≥2分為陽性。分析Klf4蛋白的陽性表達與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

2 結(jié)果

胃癌組織及其癌旁正常組織Klf4 mRNA的相對表達量分別為0.12±0.04、0.25±0.06； Klf4蛋白的陽性表達率分別為46.3%(25/54)、77.8%(42/54)；兩組比較P均<0.05。Klf4蛋白的陽性表達與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。

3 討論

Klf4屬于Klf蛋白家族成員之一，主要在消化道黏膜及上皮細胞中表達[6,7]。研究發(fā)現(xiàn)，Klf4可參與細胞增殖、分化及胚胎發(fā)育等生命過程的調(diào)控。因細胞過度增殖和異常分化是腫瘤的主要生物學特征，故推測Klf4可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。孫雪萍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Klf4在腫瘤中的作用是雙重的，既可作為抑癌基因又可作為致癌基因。在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，Klf4是一個潛在的抑制基因，人結(jié)腸癌細胞中Klf4轉(zhuǎn)錄水平的甲基化修飾或某些位點的缺失，可導致癌細胞的侵襲性增強[9]；在子宮內(nèi)膜癌組織中Klf4表達上調(diào)，其作為致癌基因發(fā)揮促進腫瘤發(fā)生的作用[10,11]。

表1 Klf4蛋白的陽性表達與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是多種癌基因、抑癌基因共同作用的結(jié)果，但其發(fā)生機制尚不明確。Hu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，胃潰瘍組織與正常胃組織Klf4表達比較無統(tǒng)計學差異，而胃癌組織中Klf4表達明顯低于癌旁正常組織。Fang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Klf4基因在胃癌組織中的表達低于正常胃組織，且Klf4基因的表達水平與腫瘤組織分級相關(guān)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中其表達低于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織。胃癌組織中Klf4表達下調(diào)可引起APC表達缺失或下調(diào)，通過Wnt/APC/β-catenin信號通路介導胃癌的發(fā)生、發(fā)展[13]。

本研究結(jié)果顯示，胃癌組織Klf4 mRNA的相對表達量及Klf4蛋白的陽性表達率均明顯低于癌旁正常組織，與以往文獻[14，15]報道基本一致。提示Klf4低表達可能參與了胃癌的發(fā)生。本研究還發(fā)現(xiàn)，胃癌組織Klf4蛋白的陽性表達與腫瘤的臨床分期、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示Klf4表達缺失可能導致胃黏膜屏障破壞，促進癌細胞轉(zhuǎn)移，其低表達可能提示胃癌患者預后不良。有報道稱，Klf4是控制胃癌細胞周期G1期向S期進展的關(guān)鍵介導因子；當Klf4表達缺失或下調(diào)時，細胞增殖失去控制，進而促進胃癌的發(fā)生、發(fā)展[6,7]。但關(guān)于Klf4低表達促進胃癌發(fā)生、發(fā)展的確切機制尚需進一步研究。

綜上所述，胃癌組織中Klf4表達降低，其低表達可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

[1] 孫秀娣，牧人，周有尚，等.中國胃癌死亡率20年變化情況分析及其發(fā)展趨勢預測[J].中華腫瘤雜志，2004，26(1)：4-9.

[2] 郭花，朱金水，朱勵，等.腫瘤標志物對胃癌診斷應(yīng)用價值的比較[J].中國臨床醫(yī)學，2009，16(3)：369-371.

[3] Ben-Porath I, Thomson MW, Carey VJ, et al. An embryonic stem cell-like gene expression signature in poorly differentiated aggressive human tumors[J]. Nat Genet, 2008,40(5):499-507.

[4] 張洪典，陳傳貴，唐鵬，等.Kruppel樣因子4蛋白在食管鱗狀細胞癌中的表達和意義[J].中華消化雜志，2013，33(8)：513-517.

[5] Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors[J]. Cell, 2007,131(5):861-872.

[6] 李明學，王權(quán)，王賓，等.胃腸道富集Kruppel樣因子表達與胃癌患者預后的關(guān)系[J].中華胃腸外科雜志，2012，15(7)：732-735.

[7] 龔邵新，莊英幟，趙強，等.KLF4和KLF5蛋白在不同臨床分期胃癌組織中的表達及意義[J].中國癌癥雜志，2010，20(10)：756-759.

[8] 孫雪萍，曹鴻國，張運海，等.Klf4的功能研究進展[J].生命科學，2009，21(3)：383-387.

[9] Ohnishi S, Ohnami S, Laub F, et al. Downregulation and growth inhibitory effect of pithelial-type Kruppel-like transcription factor KLF4, but not KLF5, in bladder cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2003,308(2):251-256.

[10] Natesampillai S, Kerkvliet J, Leung PC, et al. Regulation of Kruppel-like factor 4, 9, and 13 genes and the steroidogenic genes LDLR, StAR, and CYP11A in ovarian granulosa cells[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2008,294(2):E385-E391.

[11] Patel S, Xi ZF, Seo EY, et al. Klf4 and corticosteroids activate an overlapping set of transcriptional targets to accelerate in utero epidermal barrier acquisition[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006,103(49):18668-18673.

[12] Hu W, Hofstetter WL, Li H, et al. Putative tumor-suppressive function of kruppel-like factor 4 in primary lung carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2009,15(18):5688-5695.

[13] Fang DC, Luo YH, Yang SM, et al. Mutation analysis of APC gene in gastric cancer with microsatellite instability[J]. World J Gastroenterol, 2002,8(5):787-791.

[14] Wei DY, Kanai M, Huang S, et al. Emerging role of KLF4 in human gastrointestinal cancer[J]. Carcinogenesis, 2006,27(1):23-31.

[15] Choi BJ, Cho YG, Song JW, et al. Altered expression of the KLF4 in colorectal cancer[J]. Pathol Res Pract, 2006,202(8):585-589.

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.24.017

R735.2

B

1002-266X(2016)24-0049-02

2015-09-08)