米克熱木·沙衣布扎提，孟坤杰，王　劍

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723001)

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多西環(huán)素人工抗原的合成與鑒定

米克熱木·沙衣布扎提1，孟坤杰1，王劍2

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723001)

摘要：建立多西環(huán)素人工抗原(Doxycycline，DOX)的合成及鑒定方法。采用戊二醛偶聯(lián)法將DOX分別與載體牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)制備免疫抗原(DOX-BSA)和包被抗原(DOX-OVA)。經(jīng)SDS-PAGE電泳法、紫外可見吸收光譜鑒定，證實(shí)人工抗原成功合成，偶聯(lián)比分別為8.6∶1和 3.8∶1。結(jié)果表明建立了一種新的DOX抗原合成方法，為進(jìn)一步制備特異性DOX抗體和建立檢測食品中DOX的酶聯(lián)免疫方法奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：多西環(huán)素；人工抗原；偶聯(lián)比

多西環(huán)素(doxycycline，DOX)屬于常見的四環(huán)素類抗菌藥，具有高效、長效、廣譜等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛直接用作治療或預(yù)防性獸藥或飼料添加劑，如針對預(yù)防治療沙門菌，大腸埃希菌感染以及豬支原體肺炎等多種感染性疾病[1-3]。在動(dòng)物養(yǎng)殖生產(chǎn)中，往往存在抗菌藥物濫用的現(xiàn)象，如頻繁或隨意加大抗菌藥物的使用劑量，造成抗菌藥物在動(dòng)物性食品中嚴(yán)重殘留。四環(huán)素類藥物長期殘留在動(dòng)物組織中，長期食用殘留有這類藥物的動(dòng)物產(chǎn)品，會(huì)嚴(yán)重?fù)p害人體健康。其毒性主要表現(xiàn)為對人體多器官的損害，并伴有生殖毒性，甚至能夠誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生[4]。中國“動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量”規(guī)定，肌肉、肝臟以及腎臟組織中DOX的最高殘留限量分別為0.1、0.3、0.6 μg/mL[5]。因此，通過建立一種快速、簡便、準(zhǔn)確檢測動(dòng)物性食品中多西環(huán)素殘留的方法，對加強(qiáng)和管理動(dòng)物性食品中多西環(huán)素的殘留檢測具有重要意義。

近年來，DOX殘留檢測越來越受到人們的關(guān)注，目前常見的DOX殘留檢測方法有紫外分光光度法、薄層色譜、熒光分析法、高效液相色譜以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等方法[6-8]。雖然這些方法具有檢測準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，并且在定性、定量分析上具有良好的特性，然而諸如此類的傳統(tǒng)方法一般在操作條件上要求較高，如需要繁瑣的操作、昂貴的儀器以及經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的操作人員，很難以滿足同時(shí)對大批量樣品進(jìn)行高通量的快速殘留檢測?；诳贵w工程的免疫分析技術(shù)因其具有靈敏性高、特異性高、快速性、簡便性以及樣品使用量少等優(yōu)點(diǎn)在藥物殘留檢測方面被廣泛開發(fā)利用[9]。目前，針對此類抗菌藥物的檢測有針對四環(huán)素類免疫學(xué)檢測技術(shù)，而單獨(dú)針對DOX免疫學(xué)檢測方法很不完善。雖然已有DOX的ELISA檢測試劑盒，如德國Bio-pharm公司的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒和中國的“多西環(huán)素殘留的ELISA檢測方法及試劑盒與應(yīng)用”。但出于成本與靈敏性等因素的局限性，以及為了能夠保證食品安全這一民生問題，研發(fā)一種能夠針對DOX殘留進(jìn)行高通量快速免疫學(xué)方法，具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值和極大的推廣空間。在本研究中，針對DOX小分子不能夠激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答這一特性，建立DOX完全人工抗原的合成方法，并對合成產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，為針對DOX制備高特異性的抗體并進(jìn)一步應(yīng)用在免疫學(xué)試驗(yàn)方法中奠定了理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

多西環(huán)素，西鄉(xiāng)藥業(yè)公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA，99%)，科邦生物公司產(chǎn)品；雞卵白蛋白(OVA，98%)，Sigma公司產(chǎn)品；戊二醛、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鉀、氫氧化鈉、鹽酸，成都市科隆化工試劑廠公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1DOX人工抗原合成

1.2.1.1免疫抗原DOX-BSA制備稱取10.94 mg DOX溶于1 mL DMF，磁力攪拌下加入BSA(13.6 mg BSA溶于4 mLPBS)，并攪拌逐滴加入50 μL 250 g/L戊二醛溶液，pH調(diào)到8～9。4℃攪拌約16 h，3 000 r/min離心10 min，收集上清。

1.2.1.2包被抗原DOX-OVA制備稱取15 mg DOX溶于1 mL DMF，磁力攪拌下加入OVA(12 mg OVA溶于4 mL PBS)，并攪拌逐滴加入50 μL 250 g/L戊二醛溶液，pH調(diào)到8～9。4℃攪拌約16 h，3 000 r/min離心10 min，收集上清。

將收集的免疫抗原和包被抗原上清液在PBS緩沖液中透析3 d，每12 h換一次液，透析后收集，置-20℃保存?zhèn)溆茫铣陕肪€見圖1。

圖1　DOX人工抗原合成路線圖

1.2.2DOX人工抗原的鑒定SDS-PAGE鑒定人工抗原，采用普通電泳方法，SDS-PAGE法制備50 g/L濃縮膠和120 g/L分離膠?？捡R斯亮藍(lán)染色2 h，置脫色液中脫色至條帶清晰。

使用紫外光譜法對合成的DOX完全人工抗原進(jìn)行鑒定，并通過公式計(jì)算抗原偶聯(lián)比。通過用磷酸鹽緩沖液將所選搭載小分子的蛋白載體(BSA和OVA)、DOX和DOX人工抗原(根據(jù)載體蛋白的不同分為包被原與免疫原)分別稀釋濃度為0.2、0.02、0.2 mg/mL，在200 nm～400 nm波長下進(jìn)行全波長掃描。根據(jù)人工抗原特征吸收波長281 nm處的吸光度計(jì)算半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)比，公式如下[10]：

偶聯(lián)比=[(A偶聯(lián)物-A載體蛋白)×ρ半抗原×M蛋白質(zhì)]/[A半抗原×M半抗原×ρ載體蛋白]

式中：A為吸光度；M為相對分子質(zhì)量； ρ為質(zhì)量濃度(mg/mL)。

2結(jié)果

2.1DOX人工抗原蛋白電泳鑒定結(jié)果

SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果顯示,DOX人工抗原(DOX-BSA和DOX-OVA)條帶分別相比BSA/OVA條帶有明顯的彌散現(xiàn)象，說明BSA/OVA不同程度成功偶聯(lián)一定量的DOX，致使合成的免疫原和包被抗原的分子質(zhì)量較BSA/OVA大，導(dǎo)致合成的免疫抗原和包被抗原的SDS-PAGE 電泳譜帶遷移速率不一(圖2)。

2.2DOX人工抗原蛋白紫外鑒定結(jié)果

DOX人工抗原(DOX-BSA，DOX-OVA)及其載體與DOX的紫外掃描曲線圖(圖3)。通過分析可知，在281 nm處的完全人工抗原與載體蛋白(BSA和OVA)的紫外吸收光譜相比，DOX的吸收曲線向左發(fā)生一定的位移，同時(shí)DOX-BSA/OVA右側(cè)吸收峰都發(fā)生了改變，說明載體蛋白上已成功連接了一定數(shù)量的DOX。根據(jù)人工抗原、載體蛋白及DOX 的紫外吸收曲線在281 nm 處的紫外吸光值，計(jì)算出戊二醛法合成的DOX人工抗原中，DOX與載體蛋白BSA和OVA的結(jié)合比分別為8.6和3.8。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.BSA;2.DOX-BSA;3.OVA;4.DOX-OVA

M.Protein molecular weight Marker;1.BSA;2.DOX-BSA;3.OVA;4.DOX-OVA

圖2DOX人工抗原及其載體的SDS-PAGE結(jié)果

Fig.2SDS-PAGE results of

DOX artificial antigens and their vectors

3討論

DOX作為一種分子質(zhì)量較小的小分子化合物，只具備抗原的反應(yīng)原性，而沒有抗原的免疫原性，這些小分子抗原只有與一定大小的載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)(必須保證不破壞小分子抗原中的結(jié)構(gòu)特異性)，形成新的大分子物質(zhì)后，才能刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)進(jìn)而產(chǎn)生抗體。在偶聯(lián)過程中，偶聯(lián)的小分子自身應(yīng)該具有或通過反應(yīng)可衍生出能與載體蛋白上基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)的必須基團(tuán)(氨基、羧基、重氮鹽、羥基等)，只有具備這種條件才能實(shí)現(xiàn)小分子與載體蛋白的連接[11]。DOX分子結(jié)構(gòu)的外部基團(tuán)有一個(gè)氨基。因而本試驗(yàn)采用戊二醛偶聯(lián)法將DOX與載體蛋白進(jìn)行偶連，合成DOX的人工抗原。

A.BSA;B.OVA

圖3DOX人工抗原紫外掃描圖

Fig.3UV spectrum of BSA, OVA, DOX and DOX artificial antigens

人工抗原的鑒定有多種方法，如蛋白電泳、紫外分光光度法、紅外光譜法以及質(zhì)譜法等[12-13]。其中，蛋白電泳和紫外分光光度法最為簡便易行，且消耗的樣品量少，因而常被采用。本試驗(yàn)采用蛋白電泳和紫外分光光度法，兩種方法對人工抗原進(jìn)行了鑒定，二者結(jié)果統(tǒng)一，均表明DOX人工抗原成功合成。紫外光譜法判斷一種人工抗原是否完成偶聯(lián)成功，其依據(jù)是紫外吸收峰圖中是否出現(xiàn)兼有半抗原與載體蛋白紫外光譜的疊加性來判斷人工抗原是否成功完成了偶聯(lián)。對于SDS-PAGE電泳法，則根據(jù)最后電泳結(jié)果中分子質(zhì)量的不同，造成合成的人工抗原分子質(zhì)量較載體蛋白大，致使其遷移率較載體蛋白的速率慢，進(jìn)行判斷人工抗原是否偶聯(lián)成功。

研究表明，針對小分子半抗原產(chǎn)生的抗體的特異性不僅有整個(gè)半抗原分子或部分結(jié)構(gòu)的性質(zhì)相關(guān)，而且往往還與偶聯(lián)的人工抗原中載體上連接小分子的數(shù)量有關(guān)[14]。因而，為了最大限度地保證免疫效果，是非常必要的檢測合成的人工抗原載體上連接的半抗原數(shù)目。較為理想的半抗原偶聯(lián)比一般從3∶1到45∶1之間，在這個(gè)范圍內(nèi)的偶聯(lián)比可以達(dá)到刺激免疫動(dòng)物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體，試驗(yàn)中獲得的免疫抗原與包被抗原的偶聯(lián)比分別為8.6∶1和3.8∶1，這一結(jié)果處于理想范圍[15]。因此，通過戊二醛法成功合成了DOX人工抗原，并通過紫外光譜法和蛋白電泳的手段鑒定DOX人工抗原是否成功合成，為下游抗體產(chǎn)品的研發(fā)及食品中DOX的酶聯(lián)免疫檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

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Synthesis and Identification of Doxycycline Artificial Antigens

MIKEREMU Shayi-buzhati1, MENG Kun-jie1, WANG Jian2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgricultureUniversity,Urumqi,Xinjiang,830052,China;2.CollegeofBiologicalScienceandEngineering,ShaanxiUniversityofTechnology,Hanzhong,Shaanxi,723001,China)

Abstract:To explore a method for the synthesis and identification of doxycycline (DOX) artificial antigens,DOX artificial antigens were synthesized by glutaraldehyde coupling method between DOX and bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin (OVA) for preparing immune antigen (DOX- BSA) and envelope antigen (DOX- OVA).DOX artificial antigens were identified by UV spectrophotometry and SDS-PAGE.The results confirmed that the DOX artificial antigens were successfully synthesized.The coupling ratios of DOX hapten and BSA or OVA were 8.6∶1 and 3.8∶1,respectively.In conclusion,this method can be applied for DOX artificial antigen synthesis and provide the basis for the preparation of DOX antibodies and development of DOX immune detection.

Key words:doxycycline;artificial antigen;coupling ratio

文章編號(hào):1007-5038(2016)04-0067-04

中圖分類號(hào):S859.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡介：米克熱木·沙衣布扎提(1960-)，女，新疆伊犁人，副教授，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460677)

收稿日期：2015-09-30