何良軍, 王時偉, 鄧海峰, 董　紅，4, 田　方, 陳靜波

(1.石河子大學動物科學院，新疆石河子 832000; 2.塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾 843300;3.新疆伊犁州昭蘇馬場，新疆昭蘇 835602;4.新疆畜牧科學院，新疆烏魯木齊 830000)

?

不同年齡馬睪丸組織中miRNA-34家族含量的變化

何良軍1, 王時偉2, 鄧海峰3, 董紅1，4, 田方1, 陳靜波4*

(1.石河子大學動物科學院，新疆石河子 832000; 2.塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾 843300;3.新疆伊犁州昭蘇馬場，新疆昭蘇 835602;4.新疆畜牧科學院，新疆烏魯木齊 830000)

摘要：為研究microRNA(miRNA)-34家族在馬不同發(fā)育階段睪丸組織內(nèi)的表達規(guī)律，應用實時熒光定量PCR方法，以GAPDH 作為內(nèi)參基因，分別對miRNA-34家族(miRNA-34a、miRNA-34b 和miRNA-34c) 在3個發(fā)育階段哈薩克馬睪丸組織表達情況進行檢測。結(jié)果表明miRNA-34a 在馬睪丸發(fā)育過程中表達量較為穩(wěn)定，在不同發(fā)育階段睪丸組織內(nèi)無顯著差異(P>0.05)。miRNA-34b和miRNA-34c在馬駒和周歲馬睪丸組織中的表達量較低，在這兩個年齡段表達量無顯著差異(P>0.05)。而在成年馬階段出現(xiàn)明顯上升，成年馬miRNA-34b和miRNA-34c表達量與馬駒和周歲馬表達量有極顯著的差異(P<0.01)。位于同一基因簇上的miRNA-34b 和miRNA-34c具有極為類似的表達模式和結(jié)構(gòu)，分析認為馬的miRNA-34b和miRNA-34c 也具有冗余功能。

關(guān)鍵詞：哈薩克馬；miRNA-34家族；實時熒光定量PCR

MicroRNA(miRNA)是一種長度為19 nt～25 nt的RNA。它們通過與靶基因3′UTR堿基互補方式進行結(jié)合，能夠抑制mRNA翻譯或者降低mRNA的穩(wěn)定性[1]。成熟miRNA是由長鏈的初級miRNA轉(zhuǎn)錄體和miRNA前體切割形成的。miRNA種子序列是成熟miRNA 5′端第2～8個堿基，這個片段與靶基因的3′-UTR區(qū)通過堿基配對的方式進行結(jié)合。根據(jù)成熟miRNA和pre-miRNA的結(jié)構(gòu)和序列，miRNA可以被劃分為不同的miRNA家族[2]。同一家族內(nèi)的成員具有相同的種子序列，這意味著它們有冗余的功能。

已知很多miRNA有特異性表達模式，這種特異性表達模式表現(xiàn)在這些miRNA在特定組織內(nèi)或特定發(fā)育階段內(nèi)表達。從斑馬魚到人的進化過程中，miRNA-122序列是保守的，并且在這2種物種中，miRNA-122均表現(xiàn)為肝臟特異性表達[3]。已證實miRNA-122是調(diào)控肝炎病毒C感染、類固醇代謝和肝癌發(fā)揮重要作用[4]。 再如，miRNA-1在心臟和肌肉組織中呈特異性表達的，敲除小鼠miRNA-1-2基因會導致50%的小鼠由于心臟缺陷在出生前后死亡，剩余的小鼠也表現(xiàn)出心臟缺陷[5]。上述研究表明，miRNA的分布可能決定了組織和細胞的功能特異性，在細胞生長和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

2001年10月26日，《Science》雜志發(fā)表了美國麻省理工學院Whitehead生物研究所Nelson等利用Northern 雜交技術(shù)在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis.elegans)中發(fā)現(xiàn)一組類似于lin-4和let-7(最先發(fā)現(xiàn)的2個miRNA)具有21 nt～24 nt的非編碼RNA，這組RNA可能具有調(diào)控作用，其中包括miRNA-34[6]。

自發(fā)現(xiàn)miRNA-34后，對其研究也隨即展開。目前已知在無脊椎動物中miRNA-34只有1個成員，而在哺乳動物miRNA-34有3個分別是miRNA-34a、miRNA-34b 和 miRNA-34c，因此，人們也稱之為miRNA-34家族。p53是一個轉(zhuǎn)錄因子，當DNA損傷或細胞受脅迫時都可以激活p53[7]。為研究p53腫瘤抑制通路中miRNA的作用，通過放射處理小鼠野生型胚胎成纖維細胞與小鼠p53-/-胚胎成纖維細胞，結(jié)果只能增加野生型細胞中p53的表達，同時miRNA-34家族的3個成員的表達量與p53表達量呈正相關(guān)，并證實miRNA-34基因家族啟動子有p53的結(jié)合位點。利用強力霉素(doxycycline)處理可重新激活內(nèi)源性p53的表達，從而增加miRNA-34家族的表達。這些證據(jù)表明miRNA-34家族是p53通路下游的重要成員[8]。此后miRNA-34家族就成為人們研究的熱點。

研究表明，miRNA-34家族參與多種生物功能，很多重要生物過程中發(fā)揮重要作用，例如細胞增生[9]、細胞凋亡[10]和細胞分化[11]。 因此，研究miRNA-34家族在不同組織中的表達量有重要意義。在人和小鼠的相關(guān)報道中，miRNA-34具有調(diào)節(jié)原始生殖發(fā)育和精子生成的作用[12]。在家畜中已研究了豬睪丸發(fā)育過程中miRNA-34家族成員的序列和功能及表達規(guī)律[13-14]。

截止2015年8月，在mirBase( http://www.mirbase.org ) 數(shù)據(jù)庫中已收錄馬的690個成熟的miRNA，715個前體miRNA，已有miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c的序列描述，miRNA-34a位于第2號染色體上，屬于起源于內(nèi)含子的miRNA， miRNA-34b和 miRNA-34c 位于第7號染色體上，形成一個miRNA 基因簇，但還沒有它們功能的報道。馬作為經(jīng)濟價值極高的家畜，其繁殖能力是發(fā)展馬產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵因素。本試驗參照馬的GAPDH為內(nèi)參基因，為分析miRNA在不同發(fā)育階段哈薩克馬睪丸組織的表達規(guī)律和特異性，運用熒光定量PCR的方法對馬睪丸組織中miRNA-34家族的表達量進行了檢測和分析，研究這3個miRNA在馬睪丸不同發(fā)育階段的表達規(guī)律。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗用動物及樣品的采集試驗用馬匹均來自新疆伊犁地區(qū)的哈薩克馬，分別采集馬駒(5月齡)、周歲馬(1.5歲)和成年公馬(4歲～8歲)各3匹，每匹采集睪丸組織 ，共計9個組織樣品。在采集組織前，先通過牙齒，判斷馬的年齡。馬屠宰后，采集所有樣品迅速在液氮中冷凍，然后在-80℃保存。

1.1.2主要試劑DEPC，Sigma公司產(chǎn)品；氯仿，國藥分析純；瓊脂糖，Biowest公司產(chǎn)品；胰蛋白胨，Oxoid公司產(chǎn)品；瓊脂粉,Chembase公司產(chǎn)品；酵母提取物，Oxoid公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000,TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.3主要儀器 電泳儀(DYY-5型),北京市六一儀器廠;紫外分光光度計(UV2101 PC型)、凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司產(chǎn)品;常規(guī)PCR儀，Thermo Forma公司產(chǎn)品;Mx3005P型實時熒光定量PCR儀，低溫高速離心機等。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取 利用Trizol 試劑(Invitrogen,USA)提取樣品中的總RNA，用Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer測定RNA的純度。試驗運用以往試驗中介紹的方法[15]，測定馬睪丸組織中miRNA-34a ，miRNA-34b 和miRNA-34c 的表達量。參照Chen C F等[16]介紹的方法設(shè)計qRT-PCR的引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。試驗應用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RevertAidTM和特異性引物(表1)，將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應條件是37℃15 min ，85℃ 5 min，然后是4℃ 5 min。

1.2.2實時熒光定量PCR分析為了進一步分析miRNA在不同發(fā)育階段哈薩克馬不同組織的表達規(guī)律，利用熒光定量PCR方法，以GAPDH作為內(nèi)參，分別對miRNA-34a、miRNA-34b 和miRNA-34c 在哈薩克馬3個不同發(fā)育階段(馬駒、周歲馬、成年馬)睪丸組織的表達情況進行檢測,每個樣品設(shè)3個重復。

運用Applied Biosystems 9700 Thermocycler 進行SYBR Green PCR。試驗條件為20 μL的反應體積，包含1 μL cDNA (10倍稀釋)，95℃預變性3 min；95℃ 15 s，60℃ 40 s，40個循環(huán)。本研究以馬GAPDH作為內(nèi)參基因[17-18]，采用2-△△Ct法進行相對定量比較。用SPSS12.0進行顯著性檢驗。

表1　實時熒光定量PCR引物序列

2結(jié)果

2.1miRNA-34家族在不同發(fā)育階段睪丸組織中的變化趨勢結(jié)果見圖1。

如圖1所示， miRNA-34a 在馬睪丸內(nèi)相對表達量較為穩(wěn)定，在成年馬階段略微有些下降?？傮w上看，在不同發(fā)育階段睪丸組織內(nèi)無顯著差異(P>0.05)。miRNA-34b和miRNA-34c在馬駒和周歲馬睪丸組織中的表達量較低，在這兩個年齡段表達量相似，均無顯著差異(P>0.05)。而在成年馬階段出現(xiàn)明顯上升，成年馬miRNA-34b和miRNA-34c表達量與馬駒和周歲馬表達量有極顯著的差異(P<0.01)。

圖1　miRNA-34家族在不同發(fā)育階段馬睪丸組織的

2.2miRNA-34家族的冗余功能

馬的miRNA-34家族在5′端有相同的“種子序列”(GGCAGUG)。miRNA-34a有22個堿基，與miRNA-34b 和miRNA-34c有19個堿基相同，具有86%(19/22 nt)和82%(18/22 nt)的同源性。miRNA-34b 與miRNA-34c序列長度相同為23 nt，有21個堿基是相同，2個堿基是不同的，同源性是91%(21/23 nt)(圖2)。 表明miRNA-34b和miRNA-34c含有的相同靶基因比miRNA-34a的要多。本試驗數(shù)據(jù)顯示miRNA-34b和miRNA-34c在不同發(fā)育階段睪丸組織表達量的平行關(guān)系可能也是一種預防差錯的機制。

miRNA-34a和miRNA-34b之間相同序列用斜體標識；miRNA-34b和miRNA-34c之間相同序列用下劃線標識Sequences highlighted in italics indicate identical nucleotides shared miRNA-34b and miRNA-34c；Sequences highlighted by underlining indicate identical nucleotides shared miRNA-34b and miRNA-34c

圖2馬成熟miRNA-34a、miRNA-34b和 miRNA-34c

(http://www.mirbase.org)序列

Fig.2Mature sequences of miRNA-34a,miRNA-34b and miRNA-34c

3討論

3.1miRNA-34家族在不同發(fā)育階段睪丸組織的表達

miRNA-34家族參與哺乳動物精子發(fā)生的過程。有研究顯示，miRNA-34a在小鼠不同組織內(nèi)廣泛表達[19-20]，其中miRNA-34b和miRNA-34c主要在大腦、肺臟和睪丸內(nèi)表達[20]。在小鼠睪丸發(fā)育的整個過程中，miRNA-34a表達量較為恒定，并且只在精原細胞內(nèi)表達[21]。通過對小鼠的研究顯示，miRNA-34b和miRNA-34c在成年鼠睪丸組織內(nèi)表達高[22]。比較未成熟和成熟睪丸組織發(fā)現(xiàn)，在小鼠[22]、豬[13]和獼猴[23]的成熟睪丸內(nèi)，miRNA-34b和miRNA-34c有很高程度的特異性表達。本研究顯示哈薩克公馬不同發(fā)育階段睪丸內(nèi)miRNA-34家族時空表達模式與小鼠、豬、獼猴的相類似。

miRNA-34作為一類保守的、非編碼miRNA，通過p53通路調(diào)控細胞的增殖和凋亡，其在生殖領(lǐng)域中的作用引起廣泛關(guān)注。Bouhallier F等[24]發(fā)現(xiàn)，miRNA-34c在小鼠出生后12 d睪丸中表達量很低，此后miRNA-34c表達量迅速升高到成年水平，并且發(fā)現(xiàn)miRNA-34c在小鼠粗線期精母細胞和圓形精子細胞內(nèi)表達量很高，說明miRNA-34c的表達體現(xiàn)出減數(shù)分裂期特異性；miRNA-34b與miRNA-34c有相同的表達模式，但是miRNA-34b表達量要低于miRNA-34c，證明它們在小鼠睪丸內(nèi)的功能主要與精子發(fā)生過程后期有關(guān)。本試驗結(jié)果不僅證實了以上結(jié)論，而且更清楚地表達了馬睪丸組織中miRNA-34家族表達量從馬駒到成年階段的表達規(guī)律。從本研究結(jié)果可以看出，伴隨著馬的生殖發(fā)育過程，馬睪丸組織中miRNA-34b和miRNA-34c表達變化趨勢是先增后減，待睪丸組織發(fā)育到成熟階段相對表達量顯著上升，并高于miRNA-34a，據(jù)此推斷miRNA-34b和miRNA-34c可能與公馬生殖細胞發(fā)育相關(guān)。

崔勝等利用原位雜交技術(shù)也得出類似結(jié)果，地高辛核酸標記探針檢測，證實miRNA-34c可作用于環(huán)磷酸腺苷(轉(zhuǎn)錄激活因子Ⅰ，ATF1)來促進小鼠雄性生殖細胞的凋亡。研究數(shù)據(jù)顯示，在胚胎期第13.5天至出生后12 d，小鼠睪丸內(nèi)均未檢測到miRNA-34c，而在出生后第14天的粗線期精母細胞內(nèi)開始出現(xiàn)miRNA-34c，并于出生后第16天信號開始加強，直至成年后幾乎每個曲精細管內(nèi)都存在miRNA-34c的信號[25]。小鼠睪丸組織學觀察顯示，小鼠生后初期睪丸曲細精管中只有支持細胞和原始生精細胞; 至生后8 d出現(xiàn)精原細胞;15 d出現(xiàn)初級精母細胞；23 d時出現(xiàn)次級精母細胞及少量圓形精子細胞，此后圓形精子細胞逐漸增多；30 d時圓形精子細胞發(fā)生變態(tài)；36 d時大量精子開始穩(wěn)定出現(xiàn)于曲細精管管腔中，并延續(xù)至此后各期[26]。說明小鼠睪丸中miRNA-34c的表達與精母細胞的出現(xiàn)是同步的。

新疆哈薩克公馬睪丸組織的觀察顯示，雄性幼駒的曲精細管尚未發(fā)育完整，為睪丸索，睪丸索之間有大量間質(zhì)細胞。睪丸索管腔內(nèi)含有生殖母細胞(精原細胞)和支持細胞；周歲馬的曲細精管已經(jīng)形成，曲細精管密度明顯增大，管腔直徑變化大，曲細精管內(nèi)細胞多由3層～4層組成，但是生殖細胞發(fā)育還不完全，細胞間出現(xiàn)空腔，與小鼠出生后11日齡睪丸組織學特征相似[26]。成年馬睪丸曲細精管管腔中生殖細胞種類完整，可見精原細胞、精母細胞、圓形精子細胞和長形精子細胞的存在，后2種細胞位于管腔中央，精原細胞位于基底膜上，睪丸已發(fā)育成熟，此階段miRNA-34c的含量是最高的。本研究證明了精母細胞的數(shù)量與miRNA-34c表達量呈正相關(guān)，與小鼠的研究結(jié)果相類似。

由于miRNAs 通過直接抑制靶mRNA的翻譯發(fā)揮著重要的基因調(diào)控作用，接下來的工作是預測和篩選miRNA-34家族可能的靶基因，以進一步了解它們及其靶基因在公馬生殖發(fā)育過程中的作用。

3.2miRNA-34家族的冗余功能

在生物體內(nèi)，一個miRNA有幾十到幾百個靶基因，同時一個靶基因又受到多個miRNA的控制，這種現(xiàn)象造成了miRNA功能的冗余。miRNA-34b 和miRNA-34c作為miRNA-34基因家族中的成員，在結(jié)構(gòu)上具有很高的同源性。miRNA-34b 和miRNA-34c 位于同一基因簇上，具有同源性，同時在整個RNA片段的非種子序列也具有同源性。這種具有高度同源和成簇排列的方式還出現(xiàn)在其他類型的基因中，例如rRNA基因簇。研究者發(fā)現(xiàn)rRNA基因成簇排列，這種排列方式可能有利于RNA基因高效、協(xié)調(diào)地轉(zhuǎn)錄和胚胎發(fā)育以及早期rRNA基因的大量擴增[27]。與單個基因以及基因家族不成簇的其他成員不同，成簇基因表達不僅保持高度的時空協(xié)調(diào)，在表達量上也表現(xiàn)出高度的協(xié)調(diào)性。同一簇內(nèi)基因在各發(fā)育分化階段保持合適的表達比例，確保功能上的平衡[27]。在本研究發(fā)現(xiàn)位于同一基因簇上的miRNA-34b 和miRNA-34c具有極為類似的表達模式和結(jié)構(gòu)，這種現(xiàn)象可能是機體為了實現(xiàn)miRNA時空表達的高度精確控制。

馬的miRNA-34家族在5′端有相同的“種子序列”(GGCAGUG)。對HeLa (LGC Promochem) 細胞用RNA進行轉(zhuǎn)染，分析miRNA-34a和miRNA-34c的通路，證明它們的靶基因不完全相同，但是有部分是重疊的[28]。 哺乳動物miRNA通過5′端和它們靶基因的3′-UTR區(qū)通過堿基互補結(jié)合調(diào)控靶基因。但有時候，miRNA 3′端也會參與堿基配對，有時甚至補償5′端的堿基錯配[29]。馬成熟miRNA-34b 和 miRNA-34c 有21個堿基是相同，2個堿基是不同的。miRNA-34a和miRNA-34b 有19個堿基相同(圖2)。表明miRNA-34b和miRNA-34c含有的相同靶基因比它們與miRNA-34a的要多。已證明miRNA-449家族與miRNA-34家族含有相同的“種子序列”，這兩個家族在小鼠睪丸內(nèi)功能是冗余的[21]。在小鼠睪丸內(nèi)敲除miRNA-449會上調(diào)miRNA-34b和miRNA-34c表達，同時并不影響精子發(fā)生。證明這種冗余現(xiàn)象是一種預防差錯的機制。本試驗數(shù)據(jù)顯示miRNA-34b和miRNA-34c在不同發(fā)育階段睪丸組織表達量的平行關(guān)系可能也是一種預防差錯的機制。

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Content Changs of miRNA-34 Family in Testis Tissues of Different Age Horses

HE Liang-jun1, WANG Shi-wei2, DENG Hai-feng3, DONG Hong1,4,TIAN Fang1,CHEN Jing-bo4

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang,832000,China;2.CollegeofAnimalScience,TarimUniversity,Alar,Xinjiang,843300,China;3.ZhaosuHorseFarm,YiliKazakAutonomousPrefecture,Zhaosu,Xinjiang,835602,China;4.XinjiangAcademyofAnimalHusbandry，Urumqi,Xinjiang,830000,China)

Abstract:In order to study miRNA-34 family expression patterns in horse testes,the present study employed real-time PCR and used GAPDH as a reference gene to determine miRNA-34a，miRNA-34b and miRNA-34c expression patterns in Kazakh horse testes of three development stages.The results showed that miRNA-34a has relative stable expression in horse testicular development and shows no significant difference in expression of three testicular developmental stages(P>0.05);miRNA-34b and miRNA-34c have low expressions in foal and yearling testes and show no significant differences in expression(P>0.05);miRNA-34b and miRNA-34c have significantly higher expression in stallions and significantly higher expressions than that in foals and yearlings(P<0.01).miRNA-34b and miRNA-34c,forming one miRNA gene cluster,have very similar temporal expression patterns and RNA structures,suggesting function redundancy of miRNA-34b and miRNA-34c.

Key words:Kazakh horse；miRNA-34 family；real-time PCR

文章編號:1007-5038(2016)04-0040-05

中圖分類號:S852.165

文獻標識碼:A

作者簡介：何良軍(1974-)，男，湖北鈞縣人，博士研究生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。*通訊作者

基金項目：新疆維吾爾族自治區(qū)重大專項( 201130101-2)；國家科技支撐項目(2012BAD44B02)

收稿日期：2015-04-07