楊慶麗(黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶163319)

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大麻雨露脫膠真菌的分離及脫膠特性研究

楊慶麗
(黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶163319)

摘要:本研究從雨露漚麻后的大麻原莖上分離篩選大麻脫膠真菌。采用GB/T18147.2－2008和DNS法對(duì)6株優(yōu)勢(shì)真菌進(jìn)行殘膠率及脫膠酶活性分析。結(jié)果表明，DMJ6漚麻7 d，大麻原莖木質(zhì)部及韌皮部分離較好且不破壞纖維完整性;殘膠率明顯低于其他;果膠酶、甘露聚糖酶活性高于其他，木聚糖酶活性較高，纖維素酶活性低于其他;此菌產(chǎn)酶快，4 d果膠酶及甘露聚糖酶活性可達(dá)100 U/mL。經(jīng)18S rRNA鑒定，DMJ6與Asperigillus niger相似度為99%。

關(guān)鍵詞:大麻;雨露脫膠;真菌;脫膠酶

大麻又稱漢麻、花麻及線麻等，主要分布在亞洲及歐洲等地區(qū)［1］。我國(guó)有悠久的大麻種植歷史，產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的1/3，居世界首位［2］。大麻是重要的纖維作物，其纖維性能優(yōu)異，具有衛(wèi)生耐用、抗菌防臭、吸汗透氣、防靜電及防紫外線等功能，被廣泛應(yīng)用于服裝、汽車、建筑等行業(yè)中，是一種環(huán)保型的纖維原料，有巨大的應(yīng)用前景［3］。新鮮大麻莖需經(jīng)過脫膠獲得纖維后方可進(jìn)行下一步加工，脫膠包括雨露漚麻和溫水漚麻。其中雨露漚麻是指大麻收割后，平鋪在地上自然環(huán)境下經(jīng)過雨露浸潤(rùn)，一些微生物開始在麻莖上生長(zhǎng)［4］。這些微生物均能產(chǎn)生降解大麻莖膠成分的酶，使韌皮部與木質(zhì)部之間失去粘連而分開，從而釋放大麻纖維。這些菌主要包括麥類黑變病菌、細(xì)交鏈孢菌、稻紫附球菌等［5］。但是，雨露漚麻耗時(shí)較長(zhǎng)且天然接種的菌中有些菌能夠產(chǎn)生大量纖維素酶，降低大麻纖維的質(zhì)量，這在一定程度上影響了麻類產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究從雨露漚制后大麻原莖分離獲得大麻脫膠菌，對(duì)其果膠酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶，纖維素酶活性進(jìn)行研究，以獲得能夠快速降解甘露聚糖及果膠等大麻膠成分并對(duì)大麻纖維破壞較少的脫膠菌，為縮短雨露漚麻的周期提供幫助。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品及試劑

實(shí)驗(yàn)所用材料品種為黑龍江省科學(xué)院大慶分院“火麻一號(hào)”。樣本共15份分別采自黑龍江省科學(xué)院大慶分院肇州和克山大麻種植基地。

羧甲基纖維素鈉( CMC) :天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;

果膠: Beijing kebio biotechnology.co.Ltd;

魔芋粉: Beijing kebio biotechnology.co.Ltd;

木聚糖:南京奧多福尼生物科技有限公司;

D－甘露糖: Sigma;

D－木糖: Sigma;

半乳糖醛酸: Sigma;

DNS試劑:自配;其它試劑均采用國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

分離、純化培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基。

篩選培養(yǎng)基為大麻莖粉無機(jī)培養(yǎng)基( L) :大麻莖粉10 g，KH2PO41 g，( NH4)2SO45 g，KCl 0.5 g，CaCl20.2 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，pH 7.2［6］。

果膠培養(yǎng)基、去糖魔芋粉培養(yǎng)基、木聚糖培養(yǎng)基及CMC培養(yǎng)基為分別以5 g果膠、5 g去糖魔芋粉、5 g木聚糖及5 g CMC代替上述培養(yǎng)基中的大麻莖粉，其他無機(jī)成分相同。其中魔芋粉與75%乙醇按1∶5例混合浸泡15 h，重復(fù)三次后濾去乙醇65℃烘干即得去糖魔芋粉。

固體培養(yǎng)基中加入12 g瓊脂，121℃滅菌30 min。

1.1.3試驗(yàn)儀器

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī):上海天美科學(xué)儀器有限公司;紫外可見分光光度劑:上海精密儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1脫膠菌的分離純化

雨露漚制后的大麻原莖經(jīng)生理鹽水沖洗后，用剪刀剪成1 cm左右小段，選取其中已有菌生長(zhǎng)的加入到100 mL大麻莖粉無機(jī)培養(yǎng)基中，每瓶10段，28℃培養(yǎng)7 d后取培養(yǎng)液1 mL接種到新鮮的大麻莖粉無機(jī)培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)三代。三代后取上清1 mL接種到100 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，7 d為一個(gè)周期，連續(xù)傳三代。之后采用稀釋法涂布馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板，7 d后根據(jù)菌絲形態(tài)及顏色的差異分別接種到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板上繼續(xù)純化培養(yǎng)，經(jīng)多次純化后將所得菌編號(hào)保藏到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基斜面中。

1.2.2脫膠能力分析

取未見菌生長(zhǎng)的大麻莖，用剪刀切成10 cm左右的段，放入500 mL三角瓶中，每瓶20根，覆上封口膜后滅菌。將上述實(shí)驗(yàn)中分離的優(yōu)勢(shì)菌種用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基活化后各取1 mL，分別與30 mL滅菌蒸餾水充分混合，接種到上述裝有大麻原莖段的三角瓶中，搖晃三角瓶使菌接種到大麻莖上。每種菌設(shè)三個(gè)重復(fù)，以僅加入滅菌蒸餾水為空白對(duì)照。28℃漚麻7 d后感觀法及GB/ T18147.2－2008殘膠率測(cè)定法分析5種菌的脫膠性能。

感觀評(píng)分法:取脫膠后的大麻原莖段5根100℃烘干3 h，根據(jù)韌皮與木質(zhì)部的分離程度進(jìn)行評(píng)分，共4個(gè)等級(jí);空白對(duì)照記0分，部分分離記1分，基本分離記2分，分離良好記3分。評(píng)分人員為隨機(jī)選擇。

1.2.3酶活測(cè)定

取以上述優(yōu)勢(shì)菌分別接種到100 mL果膠、去糖魔芋粉、木聚糖及CMC含量為1%的三種培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)7 d，每種設(shè)三個(gè)重復(fù)，重復(fù)三次培養(yǎng)后取培養(yǎng)液10 mL，4℃9000 r/min離心30 min，取上清獲得粗酶液。

DNS法測(cè)果膠酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、纖維素酶活性，分別以半乳糖醛酸、D－甘露糖、D－木糖、葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活力單位定義為:在酶最適條件下，每分鐘水解底物產(chǎn)生1μg半乳糖醛酸( D－甘露糖、D－木糖、葡萄糖)所需的酶量，以U/mL表示［7－8］，即:

其中U－酶活力單位( U/mL)

G－酶解液中還原糖含量(μg)

N－酶液稀釋倍數(shù)

V－加酶液量( mL)

t－酶解時(shí)間( min)

取上述實(shí)驗(yàn)獲得的脫膠能力最好的1株真菌分別接種到100 mL果膠、去糖魔芋粉、木聚糖及CMC含量為1%的三種培養(yǎng)基中，每種設(shè)三個(gè)重復(fù)。28℃培養(yǎng)7 d后重復(fù)一次，之后再分別接種到250 mL上述培養(yǎng)基中。每天取10 mL培養(yǎng)液測(cè)酶活，方法同上。

1.2.4菌種鑒定

由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.5作圖及數(shù)據(jù)分析

Microsoft Excel 2010和GraphPad Prism5軟件作圖和數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1脫膠菌的分離純化

從漚制后的大麻原莖中共分離出15株真菌，其中優(yōu)勢(shì)菌6株。根據(jù)其菌落顏色、形態(tài)、邊緣整齊度等的不同分別命名為DMJ1－6(見圖1)。

圖1　大麻莖中分離的優(yōu)勢(shì)真菌Fig.1 Dominant fungi isolated from hemp stem

2.2優(yōu)勢(shì)菌株脫膠能力分析

由表1、圖2可見，雨露漚麻7 d后空白對(duì)照表皮無真菌生長(zhǎng)，韌皮部與木質(zhì)部幾乎不分離。實(shí)驗(yàn)組6株真菌均可在大麻莖上生長(zhǎng)。DMJ1，DMJ3組大麻纖維完整性較好，但韌皮部與木質(zhì)部分離程度低，大麻原莖殘膠率與空白對(duì)照組無顯著差異( P＞0.05)。DMJ2組麻莖韌皮部與木質(zhì)部極易分離，麻莖殘膠率極顯著低于空白對(duì)照組( P＜0.01)，但纖維完整度幾乎完全被破壞。DMJ4，DMJ5組韌皮部與木質(zhì)部較易分離，大麻莖殘膠率與空白對(duì)照組相比差異顯著( P＜0.05)，DMJ4組纖維完整度較差。DMJ6組麻莖韌皮部與木質(zhì)部極易分離，纖維完整度好，麻莖殘膠率極顯著低于空白對(duì)照組( P＜0.01)。

表1　優(yōu)勢(shì)菌脫膠能力分析Tab.1 Degumming capacity of dominant fungi

圖2　脫膠7 d大麻韌皮分離情況Fig.2 Separation degree of hemp bast after 7 d degumming

2.3脫膠酶活性分析

2.3.1優(yōu)勢(shì)菌株7 d大麻脫膠酶活分析

圖3　優(yōu)勢(shì)菌7 d脫膠酶活性Fig.3 Hemp degumming enzyme activities of dominant fungi after 7 d

2.3.2大麻脫膠菌7 d脫膠酶活變化情況低活性且變化不大( P＞0.05)，木聚糖酶活性0～4 d處于穩(wěn)定狀態(tài)( P＞0.05)，之后極顯著升高( P＜0.01)。表明DMJ6菌株能夠在較短時(shí)間內(nèi)發(fā)揮脫菌功能，且對(duì)大麻纖維損傷較小，具有實(shí)用價(jià)值。

2.3.3菌種鑒定

經(jīng)18S rRNA菌種鑒定，大麻脫膠菌DMJ6與Asperigillus niger.相似率達(dá)到99%。

圖4　DJM 6脫膠酶活變化Fig.4 Change of DMJ6 hemp degumming enzyme activities

3　討論

大麻是一種具有廣闊發(fā)展空間與市場(chǎng)前景的作物。與亞麻和苧麻相比其膠質(zhì)含量較高，有些高達(dá)40%以上，脫膠難度較大［9］。脫膠效果對(duì)于后續(xù)生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量有很大的影響。傳統(tǒng)大麻脫膠多采用堿煮為核心的化學(xué)脫膠法，這種方法的缺點(diǎn)是出麻率低，環(huán)境污染嚴(yán)重［10］。大麻雨露脫膠對(duì)環(huán)境破壞小，在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)、勞動(dòng)成本高、環(huán)保要求嚴(yán)格的國(guó)家被廣泛采用［11］。目前雨露脫膠多為微生物天然接菌，漚麻周期較長(zhǎng)，根據(jù)雨量及氣溫的不同需要3～5周的時(shí)間。因此，人們想到采用人工方法將大麻脫膠菌接種到大麻莖上以縮短漚麻周期。目前分離出的麻類脫膠菌包括Clostridium，Bacillus，Aspergillus，Penicillium，Cladosporium等，應(yīng)用范圍幾乎包括所有麻類［12］。

大麻脫膠就是將原莖中的果膠、半纖維素，木質(zhì)素等成分分解使韌皮部與木質(zhì)部分離，從而釋放大麻纖維。其中半纖維素主要為甘露聚糖和木聚糖。因此高效大麻脫膠菌應(yīng)具有高果膠酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、木質(zhì)素酶活性及低纖維素酶活性。近年來，許多科學(xué)家對(duì)大麻脫膠菌及上述幾種酶的產(chǎn)生菌進(jìn)行了研究。如汪學(xué)軍分離出的大麻脫膠放線菌及彭源德的脫膠細(xì)菌［11－12］，相對(duì)此兩株菌DMJ6與大麻雨露脫膠時(shí)產(chǎn)生黑色霉點(diǎn)之后完成脫膠更為接近，且對(duì)條件要求不高，有利于在田間大面積應(yīng)用。王軍等分離了一株產(chǎn)果膠酶菌株HY11，在苧麻發(fā)酵培養(yǎng)基中，果膠酶活性可達(dá)335 U/mL［13］。李用芳等人從土壤中分離到一株產(chǎn)木聚糖酶黑曲霉，6 d搖瓶培養(yǎng)酶活可達(dá)到656.8 U/g［14］。張曉燕的研究表明，黑曲霉以麩皮為碳源固態(tài)發(fā)酵，72 h甘露聚糖酶活為82.44 U/g［15］。王茂成的研究中真菌泰靈芝木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶，漆酶的活性分別為121.6、108.7，516.2 U/g。比較而言，本研究中獲得的大麻雨露脫膠真菌Asperigillus niger DMJ6培養(yǎng)7 d，果膠酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶活性不高，分別為175.06、146.73、101.73 U/mL。此菌能較好分離大麻木質(zhì)部與韌皮部原因可能與大麻膠成分復(fù)雜需要多種酶協(xié)同作用有關(guān)。另外，木質(zhì)素降解與脫膠效果直接相關(guān)，DMJ6產(chǎn)木質(zhì)素酶研究將作為本課題組下一階段工作的重點(diǎn)。

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Study on Isolation of Hemp Dew－retting Fungi and the Enzyme Activities

YANG Qingli
( Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences，Daqing 163319，Heilongjiang，China)

Abstract:Hemp dew－retting fungi was isolated from the stem of hemp in present study.GB/ T18147.2－2008 and DNS methods were used to research the separation degree of hemp bast and xylem，gum content and degummase activities of hemp by 6 dominant fungi.Results showed DMJ6 separated the hemp fiber and kept its completion.Gum content and cellulase activity of DMJ6 were the lowest，but pectinase and mannanase activities were the highest in 6 dominant fungi after 7 d degumming.Pectinase and cellulase activities of DMJ6 could reach 100 U/mL after 4 d．The relative similarity of DMJ6 and Asperigillus niger was 99% according to 18S rRNA test．

Keywords:hemp;dew－retting;fungi;degumming enzyme

作者簡(jiǎn)介:楊慶麗( 1977－)，女，助理研究員，研究領(lǐng)域?yàn)槲⑸?。E－mail: qingliqingli@126.com。

基金項(xiàng)目:黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計(jì)劃“大麻原莖雨露脫膠新工藝的研究”( GC13B209)

收稿日期:2015－10－08

文章編號(hào):1671－3532( 2016) 01－0024－06

中圖分類號(hào):S563.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A