楊玉瑩，陳華新，徐云峰，姜鵬，趙瑾，陳亮*

1(廈門大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門，361102)　2(中國(guó)科學(xué)院海洋研究所，實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島，266071)　3(青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島，266071)　4(黃島出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 青島，266555)

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基因工程大腸桿菌生產(chǎn)重組別藻藍(lán)蛋白(holo-SA-apcA)發(fā)酵條件優(yōu)化

楊玉瑩1，陳華新2,3*，徐云峰4，姜鵬2,3，趙瑾2,3，陳亮1*

1(廈門大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門，361102)2(中國(guó)科學(xué)院海洋研究所，實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島，266071)3(青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島，266071)4(黃島出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 青島，266555)

摘要利用Design-Expert 8.0軟件，對(duì)大腸桿菌產(chǎn)重組別藻藍(lán)蛋白(holo-SA-apcA)的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。首先運(yùn)用Plackett-Burman兩水平設(shè)計(jì)，對(duì)影響重組蛋白表達(dá)量的8個(gè)因素進(jìn)行評(píng)價(jià)，選擇有顯著影響的3個(gè)因素，即pH值、誘導(dǎo)溫度、接種量。在此基礎(chǔ)上，再用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)快速逼近以上3個(gè)因素的最大響應(yīng)區(qū)域，最后經(jīng)過Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析，通過求解回歸方程得到最優(yōu)條件為：pH 8.0、誘導(dǎo)溫度18 ℃、接種量4%。在此條件下重復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)3次，重組蛋白表達(dá)量達(dá)52.3 mg/L，與預(yù)測(cè)值基本一致。

關(guān)鍵詞別藻藍(lán)蛋白；大腸桿菌；Plackett-Burman設(shè)計(jì)；優(yōu)化

別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin)是藻類中一類重要藻膽蛋白，它與藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白和連接蛋白等一起構(gòu)成藻膽體，吸收太陽(yáng)光能用于光合作用。每分子的別藻藍(lán)蛋白含有2條結(jié)構(gòu)相似的多肽鏈α和β，α亞基和β亞基分別含有約160～180個(gè)氨基酸殘基，二者的比例通常為1∶1，每個(gè)亞基上分別共價(jià)連接有1個(gè)藻膽色素分子。在離體狀態(tài)下，藻膽蛋白在適當(dāng)波長(zhǎng)光的激發(fā)后，會(huì)發(fā)射出強(qiáng)烈的熒光，可將其與各種抗體結(jié)合制成熒光探針，用于癌細(xì)胞及病毒表面抗原等生物大分子的檢測(cè)等工作中[1-2]。

藻膽蛋白作為熒光探針使用時(shí)，需要將其與抗體偶聯(lián)。目前最為普遍使用是生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidin system，BAS)[3-5]，藻膽蛋白與鏈霉親和素通過化學(xué)交聯(lián)劑共價(jià)交聯(lián)，而抗體則是經(jīng)過生物素標(biāo)記，利用鏈霉親和素和生物素之間的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)藻膽蛋白分子和抗體的間接偶聯(lián)。鏈霉親和素分子的4個(gè)亞基均可以結(jié)合1個(gè)生物素分子，具有非常高的Ka值。BAS系統(tǒng)具有高親和力、高特異性、高穩(wěn)定性等特點(diǎn)，具有信號(hào)放大作用。

利用BAS系統(tǒng)需要分別制備藻膽蛋白和鏈霉親和素，成本較高，在交聯(lián)的過程中還可能會(huì)損失抗體活性和藻膽蛋白的熒光特性。本實(shí)驗(yàn)室利用基因工程方法，將別藻藍(lán)蛋白α亞基基因與鏈霉親和素基因連接，形成融合基因，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，將該融合基因與藻膽蛋白裂合酶基因cpcS、藻紅膽素(PEB)生物合成關(guān)鍵基因Ho1，pebS在大腸桿菌中共表達(dá)[6-7]。通過發(fā)酵和蛋白分離純化，獲得了共價(jià)結(jié)合藻紅膽素的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白(holo-SA-apcA)。Holo-SA-apcA不僅具有生物素結(jié)合能力，而且具有比天然的別藻藍(lán)蛋白更高的熒光量子效率，有望替代天然藻膽蛋白應(yīng)用于免疫熒光分析和檢測(cè)中。

本研究采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)，最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)相結(jié)合[8-9]，對(duì)重組大腸桿菌的條件進(jìn)行優(yōu)化。旨在快速高效優(yōu)化重組大腸桿菌的發(fā)酵條件，提高h(yuǎn)olo-SA-apcA的表達(dá)量，為重組藻膽蛋白的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1菌株

基因工程菌E.coliBL21 (DE3)/pCDF-SLA-cpcS/pRSF-Ho1-pebS，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，含有兩種表達(dá)質(zhì)粒。其中，表達(dá)質(zhì)粒pCDF-SLA-cpcS攜帶鏈霉親和素基因和別藻藍(lán)蛋白α亞基基因組成的融合基因SLA，以及裂合酶基因cpcS。而pRSF-Ho1-pebS攜帶藻紅膽素生物合成酶基因Ho1和pebS。

1.2培養(yǎng)基和試劑

種子培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基(5 g/L酵母提取物，10 g/L蛋白胨，10 g/L NaCl，pH 7.0)。

發(fā)酵培養(yǎng)基：TB培養(yǎng)基(12 g/L蛋白胨，24 g/L酵母提取物，0.4 %甘油，10%磷酸緩沖液)，磷酸緩沖液：23.1 g/L KH2PO4，125.4 g/L K2HPO4，pH 7.4。

上述培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的卡那霉素和100 μg/mL壯觀霉素。

1.3培養(yǎng)方法

將活化好的重組大腸桿菌接種于含LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物接種到裝50 mL或100 mL TB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，并放于控溫?fù)u床中培養(yǎng)(200 r/min)。接種量、培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、IPTG濃度等因素依照“1.5 Plackett-Burman設(shè)計(jì)”。發(fā)酵結(jié)束后，離心收集菌體并放置于-20 ℃保存。

1.4重組蛋白的定量

結(jié)合色基的蛋白(holo-SA-apcA-PEB)表達(dá)量分析：菌體懸浮于磷酸緩沖液中，超聲波破碎菌體，離心后取上清液，用熒光分光光度計(jì)測(cè)520nm激發(fā)光下上清液在563nm處的熒光發(fā)射峰值。熒光值0～1000 a.u.范圍內(nèi), 重組蛋白熒光值與蛋白表達(dá)量呈線性關(guān)系, 即重組熒光蛋白的表達(dá)量(mg/L)。

(1)

1.5Plackett-Burman設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以重組大腸桿菌的培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、接種量、裝液量、發(fā)酵培養(yǎng)基pH、誘導(dǎo)劑IPTG量、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)共8個(gè)因素進(jìn)行兩水平設(shè)計(jì)，低水平為-1 ，高水平為 1 ，設(shè)計(jì) 3個(gè)虛擬變量來(lái)估計(jì)誤差，共N= 12 次試驗(yàn)，以蛋白的表達(dá)量為響應(yīng)值Y。表1為Plackett- Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表1　Plackett- Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)參數(shù)和水平

1.6最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取pH、誘導(dǎo)溫度、接種量3個(gè)重要影響因素。根據(jù)PB試驗(yàn)得到多元一次方程的系數(shù)大小和正負(fù)，確定最陡爬坡試驗(yàn)各重要因素的步長(zhǎng)和方向設(shè)計(jì)4組試驗(yàn)，重要因素為正效應(yīng)則提高因素水平，反之則降低因素水平。培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)和IPTG濃度都是正效應(yīng)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中取高水平值，裝液量是負(fù)效應(yīng)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中取相對(duì)低水平值。

表2　最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.7響應(yīng)面分析優(yōu)化設(shè)計(jì)

最陡爬坡試驗(yàn)確定中心點(diǎn)后，通過Box-Behnken Design中心組合實(shí)驗(yàn)對(duì)影響別藻藍(lán)蛋白亞基蛋白產(chǎn)量的因素進(jìn)行分析，以接種量、發(fā)酵培養(yǎng)基pH、誘導(dǎo)溫度作為自變量，重組蛋白的表達(dá)量為響應(yīng)值，建立3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，見?。試驗(yàn)點(diǎn)17個(gè)，析因點(diǎn)12個(gè)，用于估計(jì)誤差的零點(diǎn)5個(gè)。用Design-Expert 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析。

表3　Box-Benhnken Design實(shí)驗(yàn)的因素與水平

1.8驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由BBD分析結(jié)果可知，當(dāng)pH為8.0，誘導(dǎo)溫度為18.1 ℃，接種量為4%時(shí)，響應(yīng)面達(dá)到最優(yōu)值，且最優(yōu)值為49.5 mg/L。故取pH為8.0，誘導(dǎo)溫度為18 ℃，接種量為4%，設(shè)3組重復(fù)，做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1Plackett-Burman設(shè)計(jì)

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4，方差分析顯示，8個(gè)因素中，誘導(dǎo)溫度、接種量、裝液量、pH、培養(yǎng)溫度的P值均小于0.05(表5)，表明這些因素是影響重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)holo-SA-apcA的主要因素。裝液量實(shí)際是通過溶氧供氧水平從而影響重組蛋白表達(dá)的，但由于發(fā)酵工業(yè)上使用的發(fā)酵罐與本研究的搖瓶差別較大，裝液量?jī)?yōu)化研究意義不大。本研究取誘導(dǎo)溫度、接種量、pH 3個(gè)最顯著因素繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。

表4　Plackett-Bumran試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5　Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析

2.2最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6，可以看出第2組實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)pH為7.5，誘導(dǎo)溫度為19 ℃，接種量為6%時(shí)，重組蛋白的表達(dá)量最高。因此，將第2組水平作為中心復(fù)合設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

表6　最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

2.3響應(yīng)面分析優(yōu)化結(jié)果

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表7，數(shù)據(jù)通過Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行多元回歸分析。所得回歸方程為：R=44.24+3.53A+0.21B-1.34C-2.28AB-0.075AC+0.90BC+0.35A2-4.72B2-0.52C2，回歸方程各項(xiàng)方差分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)選用模型高度顯著(prob>F值小于0.05，R2=0.928)，表明回歸方程擬合度較好，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值具有高度相關(guān)性；失擬項(xiàng)prob>F值大于 0.05，試驗(yàn)誤差較小，變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)為3.83%，說(shuō)明模型的置信度較高，模型方程能夠較好地反映真實(shí)的試驗(yàn)值，此模型可用于重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)別藻藍(lán)蛋白亞基的預(yù)測(cè)和分析，響應(yīng)面曲面圖見圖1～圖3。

表7　Box- Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

各因素對(duì)響應(yīng)值的影響并非簡(jiǎn)單線性關(guān)系。圖 1 顯示，隨著pH增加，別藻藍(lán)蛋白(holo-SA-apcA-PEB)表達(dá)量提高較快，約在pH8.0 時(shí)，表達(dá)量最高，誘導(dǎo)溫度在18 ℃前呈上升趨勢(shì)，其后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；圖2中pH對(duì)重組蛋白表達(dá)量的影響與圖1相似，接種量的最優(yōu)取值在4%附近；圖3所示，誘導(dǎo)溫度趨勢(shì)轉(zhuǎn)折點(diǎn)在19℃，接種量對(duì)表達(dá)量的影響與圖2一致。

表8　Box-Behnken試驗(yàn)方差分析結(jié)果

圖1　pH和誘導(dǎo)溫度對(duì)重組別藻藍(lán)蛋白表達(dá)量的影響Fig.1　Effects of pH and induce temperature on expression of holo-SA-apcA

圖2　pH和接種量對(duì)重組別藻藍(lán)蛋白表達(dá)量的影響Fig.2　Effects of pH and inoculation quantity on expression of holo-SA-apcA

圖3　誘導(dǎo)溫度和接種量對(duì)重組別藻藍(lán)蛋白表達(dá)量的影響Fig.3　Effects of induce temperature and inoculation amount on expression of holo-SA-apcA

2.4模型驗(yàn)證試驗(yàn)

Design-Expert 8.0軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)pH為8.0，誘導(dǎo)溫度為18.0 ℃，接種量為4%時(shí)，別藻藍(lán)蛋白的表達(dá)量為49.5 mg/L。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證性試驗(yàn)，重組蛋白的表達(dá)量為52.3 mg/L，與預(yù)測(cè)值基本一致，表明此響應(yīng)面模型與實(shí)際發(fā)酵情況具有高度擬合性。

3討論

本實(shí)驗(yàn)通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出pH、誘導(dǎo)溫度和接種量為發(fā)酵生產(chǎn)的顯著影響因素，利用最陡爬坡試驗(yàn)確定的最高表達(dá)率的 3 種因素相應(yīng)值作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)，通過Box-Behnken實(shí)驗(yàn)和Design-Expert8.0軟件分析，確定重組大腸桿菌表達(dá)holo-SA-apcA的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，其顯著性、失擬項(xiàng)和純誤差等重要參數(shù)均表明此模型與真實(shí)發(fā)酵情況有較高的擬合度。優(yōu)化后的發(fā)酵條件為：誘導(dǎo)溫度18 ℃、發(fā)酵培養(yǎng)基初始 pH 8.0、接種量4%，在此條件下發(fā)酵得到的重組別藻藍(lán)蛋白(holo-SA-apcA-PEB)重組蛋白的表達(dá)量為52.3 mg/L，與軟件預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為 5.66 %，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化得到的模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合度較好，達(dá)到了優(yōu)化重組別藻藍(lán)蛋白發(fā)酵條件的目的。

任何生物化學(xué)的酶促反應(yīng)都是與溫度變化有關(guān)的，根據(jù)酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)來(lái)看，隨著溫度的上升，反應(yīng)速度加快，呼吸強(qiáng)度增加，細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖加快。但隨著溫度的持續(xù)上升，酶失活的速度也越大，使衰老提前，發(fā)酵周期縮短，這對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)是及其不利的[10]。另一方面，隨著溫度升高，氣體在溶液中的溶解度減小，故溫度還可能通過影響氧在發(fā)酵液中的傳遞速率進(jìn)而影響目的蛋白的合成。此外，誘導(dǎo)溫度根據(jù)目的蛋白大小、性質(zhì)的不同而不同。因此，選擇合適的誘導(dǎo)溫度對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)目的蛋白(holo-SA-apcA)至關(guān)重要，本研究確定該蛋白的最佳誘導(dǎo)溫度為18 ℃，相對(duì)于有機(jī)體多數(shù)酶的最適溫度，該溫度較低，這可能是低溫能夠減少不必要的代謝反應(yīng)，增加外源蛋白的正確組裝和折疊等[11]。發(fā)酵培養(yǎng)基 pH 值對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的表達(dá)均存在一定的影響，因?yàn)橐宜崾谴竽c桿菌的主要副產(chǎn)物，它對(duì)其生長(zhǎng)和產(chǎn)物的表達(dá)都有抑制作用[12]，本文通過試驗(yàn)得到重組大腸桿菌的最適生長(zhǎng)pH為 8.0，該值高于常規(guī)大腸桿菌培養(yǎng)(pH 7.0)，較高的初始 pH 值對(duì)重組大腸桿菌菌體生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的乙酸存在一定的調(diào)節(jié)作用，從而利于菌體的生長(zhǎng)與目的蛋白的表達(dá)。培養(yǎng)基的 pH 還將影響酶分子和底物分子的帶電狀況，從而影響酶的合成，使代謝和細(xì)胞透性發(fā)生變化[10]。推測(cè)pH 值的增加可能導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性的增大，從而有利于誘導(dǎo)劑 IPTG進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮誘導(dǎo)效應(yīng)，目的蛋白轉(zhuǎn)錄水平得到加強(qiáng)。接種量是指移入種子液的體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例，接種量過大或者過小，均會(huì)影響發(fā)酵。過大會(huì)引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成，積累代謝廢物，過小會(huì)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。本文實(shí)驗(yàn)獲得重組大腸桿菌的最佳接種量為4%。說(shuō)明4%的接種量既可縮短發(fā)酵罐中菌體繁殖達(dá)到高峰的時(shí)間，使產(chǎn)物的形成提前到來(lái)，又可保證溶氧和營(yíng)養(yǎng)，避免積累過多代謝廢物。

綜上所述，利用Design-Expert軟件，確定了影響重組大腸桿菌產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白(holo-SA-apcA)因素，優(yōu)化了重組大腸桿菌的發(fā)酵條件，本研究為SA-apcA的規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization of fermentation conditions for production of recombinantallophycocyanin(holo-SA-apcA)fromEscherichiacoli

YANG Yu-ying1, CHEN Hua-xin2,3*, XU Yun-feng4, JIANG Peng2,3,ZHAO Jin2,3, CHEN Liang1*

1(School of Life Science, Xiamen University, Xiamen 361102,China)2(Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Qingdao 266071，China)3(Laboratory for Marine Biology and Biotechnology,Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology,Qingdao 266071，China)4(Huangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266555, China)

ABSTRACTThe fermentation condition of E. coli for holo-SA-apcA production was optimized. Design-Expert software was used to evaluate the effects of eight factors. Three factors playing important roles, including pH, induction temperature and inoculation quantity, were screened out. Then the steepest ascent path was employed to determine the optimal region for holo-SA-apcA production. The regression analysis was further undertaken by using Box-Behnken design and response surface analysis. The highest holo-SA-apcA production was obtained at pH 8.0, induction temperature of 18 ℃,and inoculation quantity of 4%. The validation experiments showed production of 52.3 mg/mL, which was similar to the predicted value.

Key wordsallophycocyanin;E. coli；Plackett-Burman design; optimization

收稿日期：2015-07-17，改回日期：2015-12-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201205027-2)；863計(jì)劃項(xiàng)目(2014AA093505，2014AA093501)；國(guó)家自然科學(xué)基金(41276164)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603028

第一作者：碩士研究生(陳華新、陳亮教授為通訊作者，chenhx001@126.com, chenlg@xmu.edu.cn.)。