蓋智星，王日葵,2,3，賀明陽,2,3*，周煉,2,3，韓冷,2,3，黃小蘭

1(西南大學(xué)柑桔研究所，重慶, 400712)　2(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶, 400712)　3(國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶, 400712)

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肉桂酸鉀對(duì)柑橘采后主要病原真菌的抑制作用

蓋智星1，王日葵1,2,3，賀明陽1,2,3*，周煉1,2,3，韓冷1,2,3，黃小蘭1

1(西南大學(xué)柑桔研究所，重慶, 400712)2(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶, 400712)3(國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶, 400712)

摘要探討了肉桂酸鉀對(duì)柑橘意大利青霉、指狀青霉、膠孢炭疽菌生長(zhǎng)的抑制作用。采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定肉桂酸鉀對(duì)致病真菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的抑制作用，并通過細(xì)胞膜通透性及細(xì)胞膜完整性試驗(yàn)闡述肉桂酸鉀對(duì)3種致病真菌的作用方式。結(jié)果表明：肉桂酸鉀對(duì)3種病原真菌表現(xiàn)出不同程度的生長(zhǎng)抑制作用，由大至小依次為指狀青霉、意大利青霉、膠孢炭疽菌，肉桂酸鉀質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，3種病原真菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為100%、53.88%、45.29%。肉桂酸鉀作用于病原真菌，菌懸液的相對(duì)電導(dǎo)率升高，DNA和蛋白質(zhì)等內(nèi)溶物釋放，表明細(xì)胞膜通透性及完整性發(fā)生改變。肉桂酸鉀對(duì)柑橘采后主要病原真菌具有較強(qiáng)的抑制作用，甚至是殺傷作用，適于作為柑橘保鮮劑。

關(guān)鍵詞柑橘；采后病原真菌；肉桂酸鉀；抑菌活性

柑橘采后貯運(yùn)期間的主要侵染性病害包括由意大利青霉(Penicillium italicum)引起的青霉病、由指狀青霉(Penicillium digitatum)引起的綠霉病[1]、由膠孢炭疽菌 (Colletotrichum gloeosporioides)引起的炭疽病[2]等，由此造成的柑橘采后腐爛損失十分嚴(yán)重。傳統(tǒng)化學(xué)藥劑[3-4]保鮮效果良好且操作簡(jiǎn)單，因此在柑橘采后大規(guī)模應(yīng)用，但易產(chǎn)生藥劑殘留及耐藥性問題。為此，尋找高效、安全的保鮮方法已成為柑橘采后貯運(yùn)中亟待解決的問題。

肉桂酸鉀是天然肉桂酸的鉀鹽，具有很好的可溶性與防腐性能，對(duì)人體無毒無害，是一種優(yōu)良的食品防腐劑[5]。肉桂酸鉀在酸性條件下可轉(zhuǎn)化為肉桂酸，肉桂酸對(duì)多種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及真菌均有較好的抑制效果。已報(bào)道肉桂酸對(duì)枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、白色假絲酵母、面包酵母、黑曲霉、腐霉菌均有抑菌活性[6-8]，如周夢(mèng)嬌等[9-10]報(bào)道了桂枝提取液對(duì)柑橘指狀青霉與意大利青霉具有較好的抑菌效果。但目前肉桂酸系列防腐劑在果蔬保鮮方面的研究總體較少，且抑菌試驗(yàn)的對(duì)象多集中于食品腐敗菌，而對(duì)果蔬采后病原真菌的抑制作用鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以柑橘意大利青霉、指狀青霉、膠孢炭疽菌等柑橘采后主要致病菌為供試菌，通過測(cè)定菌絲生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率、電導(dǎo)率及內(nèi)溶物釋放量，探究肉桂酸鉀對(duì)指狀青霉、意大利青霉、膠孢炭疽菌的抑制作用。

1材料與方法

1.1材料與儀器

意大利青霉、指狀青霉、膠孢炭疽菌，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所貯藏課題組保存；肉桂酸鉀，湖北運(yùn)成藥業(yè)有限公司，為分析純；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

SPX-150-Z生物恒溫培養(yǎng)箱，上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-50FBS高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械公司；MS2000生物顯微鏡，重慶賽奧光電有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DDS-307電導(dǎo)率儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司；H1850R高速冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1肉桂酸鉀對(duì)致病真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

將3種真菌在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，用打孔器制成直徑為7.5 mm、厚度為2 mm的菌餅。制作含藥培養(yǎng)基方法：向PDA培養(yǎng)基中加入肉桂酸鉀，使肉桂酸鉀的最終質(zhì)量濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/mL。以不含藥的PDA平板為空白對(duì)照，將菌餅反接到培養(yǎng)皿中央，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。28 ℃恒溫培養(yǎng)，十字交叉法測(cè)量菌落直徑(mm)，按公式(1)計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率；以肉桂酸鉀濃度的對(duì)數(shù)值(x)與菌絲生長(zhǎng)抑制率的概率值(y)計(jì)算毒力回歸方程及抑制中濃度(EC50)。

(1)

1.2.2肉桂酸鉀對(duì)致病真菌產(chǎn)孢的抑制效果

意大利青霉、指狀青霉、膠孢炭疽菌分別在肉桂酸鉀質(zhì)量濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/mL的PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d，純PDA培養(yǎng)基為對(duì)照組。意大利青霉、膠孢炭疽菌用10 mL無菌水清洗培養(yǎng)基，指狀青霉用5 mL無菌水清洗，洗液用10層紗布過濾獲得全部孢子，以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按式(2)計(jì)算產(chǎn)孢抑制率。

(2)

1.2.3肉桂酸鉀處理對(duì)致病真菌孢子萌發(fā)的抑制作用

將不同濃度的含藥培養(yǎng)基制做成直徑為7.5 mm的小餅，按照藏睿等[11]描述的方法制成保濕小室，將小餅置于其中，滴加20 μL孢子懸浮液(105spores/mL)。26 ℃恒溫培養(yǎng)7 h，記錄孢子萌發(fā)率。以純培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)處理檢查孢子數(shù)大于200個(gè)，孢子的萌發(fā)以芽管的長(zhǎng)度超過孢子直徑(長(zhǎng)徑)的一半為標(biāo)準(zhǔn)。

(3)

孢子萌發(fā)抑制率/%=

(4)

1.2.4肉桂酸鉀對(duì)病原真菌最小抑制濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MFC)的測(cè)定

采用倍半稀釋法制成不同濃度梯度的含藥平板，接種20 μL濃度為1×105spores/mL的孢子懸浮液，均勻涂布。28 ℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行觀察，以完全無菌生長(zhǎng)的最低藥劑濃度為MIC。繼續(xù)培養(yǎng)7 d，以完全無菌生長(zhǎng)的最低藥劑濃度為MFC。

1.2.5細(xì)胞膜通透性測(cè)定

采用電導(dǎo)率法測(cè)定細(xì)胞膜的通透性。稱取菌絲1 g(濕重)，加入15 mL無菌水，配制1 mg/mL肉桂酸鉀溶液，測(cè)定電導(dǎo)率的本底值J0。分別在5、15、30、60、120、180、240 min后取出離心(4 000 r/min、10 min)，測(cè)定上清液的電導(dǎo)率J1。最后將菌絲煮沸處理15 min，冷卻后離心，測(cè)定電導(dǎo)率為J2。計(jì)算每個(gè)時(shí)間段的相對(duì)電導(dǎo)率。

(5)

1.2.6細(xì)胞膜完整性測(cè)定

根據(jù)LV等[12]的方法略有改進(jìn)。稱取菌絲0.5 g(濕重)，加入20 mL磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH=7.0)，加入肉桂酸鉀使得最終質(zhì)量濃度為0、1、4 mg/mL，28 ℃下培養(yǎng)3 h。離心取上清液測(cè)定260 nm與230 nm下的吸光度，根據(jù)公式(6)、公式(7)計(jì)算菌液中DNA與蛋白質(zhì)的濃度。

DNA濃度=49.10×A260-3.48×A230

(6)

蛋白質(zhì)濃度=183.00×A230-75.80×A260

(7)

以上各項(xiàng)測(cè)定均為3重復(fù)，取平均值。

2結(jié)果與分析

2.1肉桂酸鉀對(duì)致病真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

如圖1所示，肉桂酸鉀對(duì)意大利青霉、指狀青霉、膠孢炭疽菌菌絲表現(xiàn)出不同程度的生長(zhǎng)抑制作用。隨著濃度的提高，其對(duì)3種真菌菌絲的生長(zhǎng)抑制作用也隨之增強(qiáng)，但當(dāng)肉桂酸鉀質(zhì)量濃度達(dá)到2 mg/mL后，抑制率增長(zhǎng)速度降低。質(zhì)量濃度為4 mg/mL的肉桂酸鉀對(duì)意大利青霉、指狀青霉及膠孢炭疽菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為53.88%，100%和45.29%，對(duì)指狀青霉的生長(zhǎng)抑制作用最明顯。

圖1　肉桂酸鉀質(zhì)量濃度對(duì)致病真菌菌絲生長(zhǎng)抑制率的影響Fig.1　Effects of potassium cinnamate with different concentrations on inhibitory rate of mycelium growth of fungal pathogens

表1　肉桂酸鉀對(duì)致病真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

2.2肉桂酸鉀對(duì)致病真菌產(chǎn)孢量的抑制作用

真菌產(chǎn)生孢子是由它的遺傳特性決定的，同時(shí)受環(huán)境條件的影響很大。如圖2所示，隨著肉桂酸鉀濃度的提高，其對(duì)指狀青霉、意大利青霉、膠孢炭疽菌的產(chǎn)孢抑制作用增強(qiáng)。當(dāng)肉桂酸鉀質(zhì)量濃度在0.125～1 mg/mL時(shí)，指狀青霉產(chǎn)孢抑制率的增速較快，當(dāng)肉桂酸鉀質(zhì)量濃度大于1 mg/mL時(shí)，指狀青霉產(chǎn)孢抑制率變化緩慢；肉桂酸鉀對(duì)3種菌的產(chǎn)孢抑制率變化趨勢(shì)雖然一致，但抑制程度有明顯差異，對(duì)意大利青霉與膠孢炭疽菌產(chǎn)孢的抑制作用要小于對(duì)指狀青霉的抑制作用，當(dāng)肉桂酸鉀質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí)的抑制率分別為93.18%、74.18%和60.75%。

圖2　肉桂酸鉀濃度對(duì)致病真菌產(chǎn)孢抑制率的影響Fig.2　Effects of potassium cinnamate with different concentrations on inhibitory rate of conidia production of fungal pathogens

毒力回歸方程直線斜率可以反映病原菌對(duì)藥劑的敏感性，斜率越大表明敏感性越強(qiáng)。由表2數(shù)據(jù)可知，意大利青霉與膠孢炭疽菌較指狀青霉對(duì)肉桂酸鉀更為敏感；由χ2和P值可知，該模型對(duì)肉桂酸鉀濃度與病原菌產(chǎn)孢抑制率的模擬擬合度良好；由EC50可知肉桂酸鉀對(duì)指狀青霉產(chǎn)孢的毒性較大，其次是意大利青霉。

2.3肉桂酸鉀對(duì)膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)的抑制作用

如圖3所示，不同濃度的肉桂酸鉀對(duì)3種病原真菌孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用，且隨著肉桂酸鉀濃度的增加，抑制率增大。當(dāng)肉桂酸鉀質(zhì)量濃度大于1 mg/mL時(shí)，意大利青霉與指狀青霉的孢子萌發(fā)抑制率為100%。肉桂酸鉀質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)抑制率為100%。周靈靈等[15]對(duì)R-多糖對(duì)荔枝膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)抑制作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)R-多糖濃度對(duì)數(shù)值與孢子萌發(fā)抑制率的幾率值之間成線性相關(guān)，這與本研究結(jié)果不同。本研究中，肉桂酸鉀質(zhì)量濃度在1～2 mg/mL時(shí)，孢子萌發(fā)抑制率急速升高，使得肉桂酸鉀濃度對(duì)數(shù)值與孢子萌發(fā)抑制率的幾率值之間不存在線性相關(guān)，原因有待確認(rèn)。

表2　肉桂酸鉀對(duì)致病真菌產(chǎn)孢量的抑制作用

圖3　肉桂酸鉀濃度對(duì)致病真菌孢子萌發(fā)抑制率的影響Fig.3　Effects of potassium cinnamate with different concentrations on inhibitory rate of spore germination of fungal pathogens

2.4肉桂酸鉀對(duì)3種病原真菌的MIC和MFC

由表3可知，肉桂酸鉀對(duì)意大利青霉、指狀青霉和膠孢炭疽菌的最低抑制質(zhì)量濃度相同，均為0.5 mg/mL，最低殺菌濃度由小到大依次為指狀青霉、意大利青霉、膠孢炭疽菌，這與肉桂酸鉀濃度對(duì)致病真菌菌絲生長(zhǎng)抑制率的擬合模型所得的EC50值大小排序結(jié)果相吻合。

表3　肉桂酸鉀對(duì)3種病原真菌的MIC和MFC

2.5肉桂酸鉀對(duì)膠孢炭疽菌細(xì)胞通透性的影響

菌懸液中相對(duì)電導(dǎo)率的變化反應(yīng)肉桂酸鉀對(duì)菌體膜通透性的影響。細(xì)胞膜是細(xì)胞與細(xì)胞環(huán)境間的半透膜屏障，對(duì)于細(xì)胞的物質(zhì)進(jìn)出具有選擇性調(diào)節(jié)作用。

A-意大利青霉；B-指狀青霉；C-膠孢炭疽菌圖4　肉桂酸鉀對(duì)致病真菌膜通透性的影響Fig.4　Effects of potassium cinnamate on permeability of the fungal pathogens cell membrane

如圖4所示，3種菌懸液中的相對(duì)電導(dǎo)率隨時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈上升趨勢(shì)。意大利青霉在肉桂酸鉀處理60 min內(nèi)，菌液中相對(duì)電導(dǎo)率增長(zhǎng)迅速；指狀青霉在肉桂酸鉀處理前120 min，菌液相對(duì)電導(dǎo)率處于上升趨勢(shì)；膠孢炭疽菌與肉桂酸鉀作用的前60 min，菌液中相對(duì)電導(dǎo)率迅速增大，隨后，相對(duì)電導(dǎo)率值處于穩(wěn)定狀態(tài)，這與張赟彬等[16]研究肉桂醛對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制作用的結(jié)果相似。經(jīng)1 mg/mL肉桂酸鉀處理的菌懸液中相對(duì)電導(dǎo)率要遠(yuǎn)高于對(duì)照組。對(duì)照組相對(duì)電導(dǎo)率的升高可能與正常菌體的自溶和死亡有關(guān)。肉桂酸鉀使得細(xì)胞膜透性增大，使離子穩(wěn)態(tài)遭到破壞[17]，從而影響菌體的正常代謝。

2.6肉桂酸鉀對(duì)膠孢炭疽菌細(xì)胞膜完整性的影響

菌體DNA、蛋白質(zhì)的釋放可以表明肉桂酸鉀對(duì)菌體細(xì)胞膜完整性的影響，測(cè)定結(jié)果如表3所示。隨著肉桂酸鉀濃度的增大，菌懸液中DNA與蛋白質(zhì)的含量均呈增大趨勢(shì)，其中膠孢炭疽菌懸液中的DNA濃度增幅最大，其次為指狀青霉；膠孢炭疽菌懸液中的蛋白質(zhì)濃度增幅最大，其次為意大利青霉。肉桂酸鉀質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，膠孢炭疽菌懸液中的DNA和蛋白質(zhì)濃度最高。試驗(yàn)結(jié)果表明肉桂酸鉀對(duì)細(xì)胞膜完整性會(huì)造成破壞，引起細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)外流，嚴(yán)重影響了菌體的正常生長(zhǎng)代謝，從而抑制了病原真菌的繁殖，此結(jié)果與劉淑宇等[18]的研究結(jié)果相符。

表3　肉桂酸鉀對(duì)致病真菌內(nèi)溶物釋放的影響

3結(jié) 論

(1)肉桂酸鉀對(duì)3種病原真菌均有抑菌效果，抑制作用由大到小依次為指狀青霉、意大利青霉和膠孢炭疽菌；

(2)肉桂酸鉀作用于病原真菌，可抑制孢子萌發(fā)，抑制作用由大到小依次為意大利青霉、指狀青霉和膠孢炭疽菌；

(3)肉桂酸鉀可改變病原真菌的細(xì)胞膜通透性，破壞細(xì)胞膜完整性，使得3種病原真菌新陳代謝紊亂直至死亡，可見肉桂酸鉀不僅對(duì)致病菌具有抑制作用，還具有殺傷作用。

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Antifungal acitivity of potassium cinnamate against the main postharvest fungal pathogens of citrus fruits

GE Zhi-xing1, WANG Ri-kui1,2,3, HE Ming-yang1,2,3*,ZHOU Lian1,2,3, HAN Leng1,2,3, HUANG Xiao-lan1

1(Citrus Research Institute, Southwest University, Chongqing 400712, China)2(Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712, China)3(National Citrus Engineering Research Center, Chongqing 400712, China)

ABSTRACTThe antifungal activities of potassium cinnamate against the growth of Penicillium italicum, Penicillium digitatum and Colletotrichum gloeosporioides were evaluated. Agar plate test was conducted to test the inhibitory effect of potassium cinnamate on mycelium growth, conidia production and spore germination of fungal pathogens. Furthermore, the antifungal mechanism was explored by assay on cell membrane permeability and integrity. The results showed that potassium cinnamate displayed strong antifungal activity to Penicillium digitatum, Penicillium italicum, Colletotrichum gloeosporioides from high to low. When the concentrations of potassium cinnamate was 4mg/mL, the inhibitory rate of mycelium growth of three fungal pathogens were 100%, 53.88% and 45.29%, respectively. After treatment with potassium cinnamate, the relative electric conductivity increased rapidly and the cellular constituent released, indicating that the permeability and integrity of the cell membrane was affected. Consequently, potassium cinnamate had a strong inhibitory action and lethal effect on postharvest pathogens of citrus, and was suitable to be used as a citrus preservative to inhibit the growth of fungal pathogens.

Key wordscitrus; postharvest fungal pathogens; potassium cinnamate; antifungal activity

收稿日期：2015-10-10，改回日期：2015-11-16

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201203034)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(XDJK2013C014)；重慶市應(yīng)用開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2013yykfA80008)；重慶市科技支撐示范工程項(xiàng)目(cstc2014fazktjcsf80007)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603019

第一作者：碩士研究生(賀明陽博士為通訊作者，E-mail:hemingyang@cric.cn)。