譚才鄧，王文文，朱美娟，廖延智，姚勇芳

(廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州, 510300)

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1株耐高溫高鹽生香酵母的選育及特性分析

譚才鄧，王文文，朱美娟，廖延智，姚勇芳*

(廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州, 510300)

摘要以豆瓣醬為材料篩選出86株產(chǎn)酯菌，以期從中得到1株耐高溫高鹽生香酵母菌。通過(guò)耐高溫、耐高鹽和產(chǎn)酯能力試驗(yàn)，獲得1株耐高溫高鹽生香酵母菌PX-8，其在溫度高達(dá)40 ℃和NaCl質(zhì)量濃度高達(dá)180 g/L的條件下能正常生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)26S rDNA鑒定，確定菌株P(guān)X-8為魯氏結(jié)合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)。經(jīng)過(guò)產(chǎn)酯發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)，菌株P(guān)X-8的最佳產(chǎn)酯培養(yǎng)條件為：葡萄糖80 g/L，酵母粉40 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4 0.5 g/L，pH 6.0，32 ℃，150 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)6 d，總酯產(chǎn)量高達(dá)2.615 g/L；在高溫高鹽條件下(發(fā)酵培養(yǎng)溫度為40 ℃，鹽質(zhì)量濃度為180 g/L)，發(fā)酵培養(yǎng)21 d，總酯產(chǎn)量可達(dá)1.518 g/L。

關(guān)鍵詞耐高溫；耐鹽；酵母；產(chǎn)酯

耐鹽生香酵母主要應(yīng)用于醬油的生產(chǎn)，由于其能夠生產(chǎn)酯類、醇類等風(fēng)味物質(zhì)，故對(duì)醬油的品質(zhì)有很大的影響。目前低鹽固態(tài)醬油占我國(guó)醬油生產(chǎn)總量的70%以上[1]，低鹽固態(tài)發(fā)酵的特點(diǎn)主要是生產(chǎn)周期短、工藝成熟、投資規(guī)模要求較小等，但缺點(diǎn)是由于發(fā)酵溫度較高，發(fā)酵過(guò)程中除米曲霉外的有益微生物含量較低，使得醬油的色香味較差[1-3]。在已有的報(bào)道中，用于醬油生產(chǎn)的耐鹽產(chǎn)酯酵母主要有：魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、蒙奇球擬酵母(Torulopsismogii)、埃契氏球擬酵母(Torulopsisetchellsii)、易變球擬酵母(Torulopsisutilis)等[4-5]，它們?cè)诎l(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)有酯類、醇類、醛類、酚類、有機(jī)酸、糠醛類、呋喃酮類等[4-6]。另有研究表明，魯氏酵母的谷氨酰胺酶還能轉(zhuǎn)化底物生成谷氨酸從而增強(qiáng)醬油的鮮味[7]。

目前關(guān)于耐鹽酵母種質(zhì)資源的報(bào)道較多，如閆美[8]在辣椒醬中篩選出了1株耐鹽性達(dá)240 g/L的魯氏酵母，王春玲等[9]通過(guò)原生質(zhì)體融合的方法篩選出一株耐鹽性高于180 g/L的釀酒酵母，都有效提高了乙酸乙酯、乳酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)的含量，但關(guān)于耐高溫高鹽酵母的研究鮮見報(bào)道。在低鹽固態(tài)醬油的生產(chǎn)過(guò)程中，有高溫的發(fā)酵階段，因而一般添加生香酵母只能在后發(fā)酵階段，這樣會(huì)導(dǎo)致酵母發(fā)酵時(shí)間不夠長(zhǎng)，醬油的整體品質(zhì)提不上來(lái)。本試驗(yàn)旨在篩選出一株耐高溫高鹽的生香酵母，為醬油的低鹽固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)提供種質(zhì)資源參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1篩選材料

四川郫縣豆瓣醬，市售。

1.1.2培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，NaCl 180 g/L，氯霉素0.1 g/L，pH6.0。

產(chǎn)酯篩選培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L，氯霉素0.1 g/L，溴甲酚紫0.05 g/L，吐溫-80 5 mL /L，三乙酸甘油酯30 mL/L(滅菌后加入)，pH 7.2。

YPD(平板、斜面)培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，氯霉素0.1 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH6.0。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 6.0。

1.2方法

1.2.1菌株富集培養(yǎng)與分離篩選

稱取10 g左右的樣品，接入200 mL富集培養(yǎng)基，40 ℃靜置培養(yǎng)7 d。在無(wú)菌條件下，對(duì)富集液進(jìn)行梯度稀釋，涂布產(chǎn)酯篩選培養(yǎng)基，封口膜封口，40 ℃培養(yǎng)3～7 d至長(zhǎng)出單菌落。從平板上挑取菌落附近有黃色圈的單菌落接入斜面培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌苔，放入4 ℃冰箱保藏。

1.2.2菌株耐高溫篩選

將篩選獲得的菌株接種于50 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24 h制成種子液，然后以1%的接種量分別接種于100 mL新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，于40℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，觀察菌體生長(zhǎng)情況，取樣并于600 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.3菌株耐高鹽篩選

按方法1.2.2制成種子液，以1%的接種量分別接種于100 mL含NaCl 180 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基，40℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)5 d，觀察菌體生長(zhǎng)情況，取樣并于600 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.4菌株產(chǎn)酯能力試驗(yàn)

按方法1.2.2制成種子液，以10%的接種量分別接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖含量為80 g/L)，30 ℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)7 d，每隔1 d分別取樣測(cè)定各菌株發(fā)酵液的總酯。

1.2.5總酯的測(cè)定[10-11]

量取50 mL發(fā)酵液，加入200 mL的蒸餾水，100 ℃進(jìn)行蒸餾，收集餾出液50 mL，用回流皂化法測(cè)定餾出液中的總酯(以乙酸乙酯計(jì))。

1.2.6菌株26S rDNA鑒定[12-13]

離心收集菌體，用酵母基因組DNA抽提試劑盒提取總DNA，作為PCR反應(yīng)模板。PCR反應(yīng)體系：5×PrimeSTAR Buffer 10 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol each) 5 μL，Primer-F(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3') 1 μL，Primer-R(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3') 1 μL，DNA模板1 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U/μL) 0.5 μL，補(bǔ)水至50 μL。PCR反應(yīng)程序：96 ℃預(yù)變性4 min；96 ℃變性20 s，55 ℃退火15 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，并用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增情況。PCR產(chǎn)物送華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。獲得序列結(jié)果后，在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)，挑選與之同源性在95%以上的菌株的26S rDNA序列，利用Mega 6.0軟件以Neighbor-Joining法進(jìn)行1 000次步長(zhǎng)計(jì)算構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.7目標(biāo)菌株產(chǎn)酯發(fā)酵條件優(yōu)化

按方法1.2.4，探討碳源、氮源、溫度、NaCl含量對(duì)菌株產(chǎn)酯的影響，具體種類及用量范圍見表1。

表1　目標(biāo)菌株產(chǎn)酯發(fā)酵條件優(yōu)化因素表

注：搖瓶為1000 mL三角瓶裝200 mL培養(yǎng)基，種子液接種量為10%，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，振蕩培養(yǎng)6 d。

2結(jié)果與分析

2.1菌株分離純化

經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)和分離純化，共獲得86個(gè)帶黃色圈的單菌落，選取10個(gè)黃色圈較大的單菌落劃線至YPD平板，觀察菌落形態(tài)并進(jìn)行鏡檢，結(jié)果見表2。

表2　菌落與菌體特征

如表2所示，菌株P(guān)X-1、PX-2、PX-6、PX-7、PX-9的菌落形態(tài)均為圓形、乳白色、表面光滑，細(xì)胞形態(tài)為橢圓形，兩端出芽繁殖；菌株P(guān)X-3、PX-4、PX-5、PX-8、PX-10的菌落形態(tài)均為圓形、乳白色、表面干燥，細(xì)胞形態(tài)為圓形，一端出芽繁殖。

2.2菌株耐高溫、耐高鹽實(shí)驗(yàn)

對(duì)獲得的10株菌進(jìn)行耐高溫耐高鹽實(shí)驗(yàn)，溫度選擇40℃，NaCl含量為180 g/L，結(jié)果見圖1。

圖1　菌株耐高溫、耐高鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1　The test results of thermotolerant and salt-tolerance of target strains

從圖1可知，在耐高溫實(shí)驗(yàn)中，菌株P(guān)X-8長(zhǎng)勢(shì)最好，在600 nm處的吸光度為2.860，其次為菌株P(guān)X-3和PX-5，其吸光度分別為2.685和2.610，其余菌株的吸光度均小于2.600；在耐高鹽實(shí)驗(yàn)中，菌株P(guān)X-10長(zhǎng)勢(shì)最好，吸光度達(dá)2.930，其次為菌株P(guān)X-8，其吸光度為2.910，其余菌株的吸光度均小于2.600。綜合分析，菌株P(guān)X-8在耐高溫耐高鹽實(shí)驗(yàn)中，綜合性能表現(xiàn)最優(yōu)，而菌株P(guān)X-10雖然在耐高溫實(shí)驗(yàn)中長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)一般(吸光度為2.586)，但其在耐高鹽實(shí)驗(yàn)中長(zhǎng)勢(shì)最好，故考慮選擇菌株P(guān)X-8和PX-10進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3菌株產(chǎn)酯能力實(shí)驗(yàn)

為了探討篩選獲得的兩株耐高溫高鹽菌株P(guān)X-8和PX-10的產(chǎn)酯能力，對(duì)其進(jìn)行了發(fā)酵產(chǎn)酯能力實(shí)驗(yàn)，其中發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量提高到80 g/L，結(jié)果見圖2。

圖2　菌株P(guān)X-8和PX-10產(chǎn)酯能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2　Yield of total ester produced from strain PX-8 and PX-10(培養(yǎng)條件為30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d)

由圖2可知，菌株P(guān)X-8和PX-10在發(fā)酵1天后都明顯產(chǎn)酯，而且總酯產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，到第6天達(dá)到最高值，分別為2.353 g/L和2.112 g/L。兩株菌相比較，相同的發(fā)酵時(shí)間下PX-8比PX-10總酯產(chǎn)量高，在最高產(chǎn)量處高出11.4%左右。因此，在后續(xù)研究中，應(yīng)選擇菌株P(guān)X-8進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.4菌種鑒定

用酵母基因組DNA抽提試劑盒提取目標(biāo)菌株P(guān)X-8的總DNA，用設(shè)計(jì)合成的通用引物和高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增26S rDNA D1/D2區(qū)序列，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，獲得特異擴(kuò)增目的片段，其大小約600 bp，與預(yù)計(jì)片段大小吻合。PCR產(chǎn)物送華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，序列長(zhǎng)度為576 bp。在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示，前100個(gè)相似性高的菌株中有78個(gè)為Z.rouxii，挑選與之同源性在95%以上的菌株的26S rDNA序列，利用Mega 6.0軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析圖，如圖3所示。

圖3　菌株P(guān)X-8基于26S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析圖Fig.3　Phylogenetic analysis of strain PX-8 according to 26S rDNA sequence

由圖3可看出，在系統(tǒng)發(fā)育分析圖上，菌株P(guān)X-8與魯氏結(jié)合酵母(Z.rouxiiY12)同源性可信度為100%，可認(rèn)定PX-8為魯氏結(jié)合酵母的一種。

2.5菌株P(guān)X-8產(chǎn)酯發(fā)酵條件優(yōu)化

2.5.1碳源對(duì)菌株產(chǎn)酯量的影響

實(shí)驗(yàn)使用的碳源有葡萄糖、果糖、麥芽糖和蔗糖，為了探討其對(duì)菌株P(guān)X-8產(chǎn)酯量的影響，使用不同濃度的碳源配合基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行研究，結(jié)果見圖4。

圖4　碳源對(duì)菌株P(guān)X-8產(chǎn)酯量的影響Fig.4　Effect of carbon sources on ester yield of strain PX-8(培養(yǎng)條件為30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)6 d)

從圖4可知，4種糖類當(dāng)中，在相同濃度下，葡萄糖對(duì)菌株P(guān)X-8產(chǎn)酯貢獻(xiàn)量最大，蔗糖最小，可認(rèn)為葡萄糖更容易被菌株利用轉(zhuǎn)化產(chǎn)生酯類物質(zhì)，其用量在80 g/L時(shí)總酯產(chǎn)量最高，達(dá)到2.353 g/L，可見葡萄糖為最適合的碳源，應(yīng)選擇其作為碳源進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，其使用質(zhì)量濃度應(yīng)為80 g/L。

2.5.2氮源對(duì)菌株產(chǎn)酯量的影響

本實(shí)驗(yàn)使用的氮源分為有機(jī)態(tài)氮(酵母粉、蛋白胨)和無(wú)機(jī)態(tài)氮(尿素、硝酸銨)兩大類，為了探討其對(duì)菌株P(guān)X-8產(chǎn)酯量的影響，使用不同含量的氮源配合葡萄糖(用量為80 g/L)進(jìn)行研究，結(jié)果見圖5。

圖5　氮源對(duì)菌株P(guān)X-8產(chǎn)酯量的影響Fig.5　Effect of nitrogen sources on ester yield of strain PX-8(培養(yǎng)條件為30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)6 d)

由圖5可知，有機(jī)態(tài)氮更有利于菌株生產(chǎn)酯類物質(zhì)，可能是有機(jī)態(tài)氮源在被菌體利用的過(guò)程當(dāng)中，除了提供氮源之外，還為菌體提供某些因子，能促進(jìn)酯化反應(yīng)朝合成酯類物質(zhì)的方向進(jìn)行，從而提高總酯產(chǎn)量。4種氮源當(dāng)中，在相同濃度下，酵母粉對(duì)菌株P(guān)X-8產(chǎn)酯貢獻(xiàn)量最大，硝酸銨最小，可認(rèn)為酵母粉更容易被菌株利用轉(zhuǎn)化產(chǎn)生酯類物質(zhì)，其用量在40 g/L時(shí)總酯產(chǎn)量最高，達(dá)到2.528 g/L，可見酵母粉為最適合的氮源，應(yīng)選擇其作為氮源進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，其使用質(zhì)量濃度應(yīng)為40 g/L。

2.5.3培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)酯量的影響

為了探討培養(yǎng)溫度對(duì)菌株P(guān)X-8產(chǎn)酯量的影響，在最佳碳源和氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基配比下，本實(shí)驗(yàn)溫度范圍選擇在26～44℃之間，總酯產(chǎn)量結(jié)果如圖6。

圖6　培養(yǎng)溫度對(duì)菌株P(guān)X-8產(chǎn)酯量的影響Fig.6　Effect of culture temperature on ester yield of strain PX-8(發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖80 g/L，酵母粉40 g/L，150 r/min振蕩培養(yǎng)6 d)

由圖6可知，培養(yǎng)溫度低于32 ℃時(shí)，總酯產(chǎn)量隨著培養(yǎng)溫度的升高而增加；在培養(yǎng)溫度高于32 ℃時(shí)，總酯產(chǎn)量隨著培養(yǎng)溫度的升高而減少。培養(yǎng)溫度在30～34 ℃時(shí)菌株P(guān)X-8產(chǎn)酯量較高，在32 ℃時(shí)達(dá)到最高，總酯含量達(dá)2.615 g/L。當(dāng)培養(yǎng)溫度超過(guò)40 ℃時(shí)，總酯產(chǎn)量大幅度下降，由40 ℃時(shí)的1.596 g/L下降到44 ℃時(shí)的0.168 g/L，可能是溫度過(guò)高，菌體生長(zhǎng)與代謝過(guò)慢的緣故而嚴(yán)重降低了總酯的產(chǎn)量。

2.5.4鹽質(zhì)量濃度對(duì)菌株產(chǎn)酯量的影響

菌株P(guān)X-8在不同鹽質(zhì)量濃度下總酯產(chǎn)量如圖7所示，隨著培養(yǎng)基中NaCl質(zhì)量濃度的增大，總酯產(chǎn)量呈不斷下降趨勢(shì)。其中，NaCl質(zhì)量濃度在0～75 g/L，總酯產(chǎn)量由2.612 g/L逐漸下降至1.850 g/L，降幅較小，總酯產(chǎn)量總體也較高；當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度在75～200 g/L時(shí)，總酯產(chǎn)量由1.850 g/L迅速下降至0.105 g/L，降幅較大，總酯產(chǎn)量總體也較低?？梢?，低NaCl質(zhì)量濃度(0～75 g/L)較適合菌株P(guān)X-8產(chǎn)酯。

圖7　鹽濃度對(duì)菌株P(guān)X-8產(chǎn)酯量的影響Fig.7　Effect of salinity on ester yield of strain PX-8(發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖80 g/L，酵母粉40 g/L，32 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)6 d)

2.6菌株P(guān)X-8高溫高鹽條件下產(chǎn)酯能力測(cè)試

為了探討菌株P(guān)X-8在高溫高鹽條件下的產(chǎn)酯能力，本實(shí)驗(yàn)在最佳碳源和氮源配比下延長(zhǎng)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間，考察了鹽濃度在180 g/L、溫度在40與42 ℃的條件下菌株產(chǎn)酯情況，總酯產(chǎn)量結(jié)果見圖8。

圖8　菌株P(guān)X-8在高溫高鹽條件下產(chǎn)酯結(jié)果Fig.8　Yield of total ester produced from strain PX-8 under high temperature and high salt conditions

從圖8可知，在高溫高鹽條件下，隨著發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，總酯產(chǎn)量呈上升趨勢(shì)，在第21天時(shí)達(dá)到最高值，之后呈下降趨勢(shì)。40 ℃培養(yǎng)與42 ℃培養(yǎng)相比，相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，40 ℃的總酯產(chǎn)量大大高于42 ℃，兩者的最高值分別為1.518 g/L和0.695 g/L，前者為后者的218%?？梢娋關(guān)X-8在用于醬油的后發(fā)酵時(shí)，為提高總酯產(chǎn)量，溫度不應(yīng)高于40 ℃。

3結(jié)論

以豆瓣醬為篩選材料，通過(guò)富集、分離純化、耐高溫、耐高鹽、發(fā)酵產(chǎn)酯能力的試驗(yàn)，選出1株耐高溫高鹽生香酵母菌PX-8，其在溫度高達(dá)40 ℃和NaCl質(zhì)量濃度高達(dá)180 g/L的條件下能正常生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)26S rDNA鑒定，基本確定其為魯氏結(jié)合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基碳源、氮源、培養(yǎng)溫度、NaCl濃度等因子的試驗(yàn)，確定菌株P(guān)X-8最佳產(chǎn)酯培養(yǎng)條件為：葡萄糖80 g/L，酵母粉40 g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5 g/L，pH 6.0，32 ℃，150 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)6 d，總酯產(chǎn)量最高達(dá)到2.615 g/L；在高溫高鹽條件下(發(fā)酵培養(yǎng)溫度為40 ℃，鹽質(zhì)量濃度為180 g/L)，發(fā)酵培養(yǎng)21 d，總酯產(chǎn)量可達(dá)1.518 g/L。

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Screening and characterization of aroma yeast with thermo-tolerant and salt-tolerance

TAN Cai-deng, WANG Wen-wen, ZHU Mei-juan, LIAO Yan-zhi, YAO Yong-fang*

(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300,China)

ABSTRACTTo obtain an aroma yeast strain with thermo-tolerance and salt-tolerance, 86 strains was isolated from bean paste. Through thermo-tolerance test, salt-tolerance test and determination of yield of este, strain PX-8 was screened out because it could grow normally at temperature up to 40 ℃ and NaCl concentration up to 180 g/L. According to 26S rDNA sequence analysis, strain PX-8 was identified as Zygosaccharomyces rouxii. The optimum conditions for production of ester with strain PX-8 were fermentation in medium cotaining glucose 80 g/L, yeast extract 40 g/L, KH2PO4 1 g/L, MgSO4 0.5 g/L, at pH6.0, 32 ℃, with 150 r/min shaking for 6 days. The yield of total ester was up to 2.615 g/L. After fermentation under high temperature and high salt conditions (fermentation temperature was 40 ℃, NaCl concentration was 180 g/L) for 21 days, the yield of total ester could reach 1.518 g/L. This study could provide useful reference for germplasm resources in the flavor promotion of fermented food such as soy sauce.

Key wordsthermotolerant; salt-tolerance; yeast; ester producing

收稿日期：2015-09-30，改回日期：2016-01-12

基金項(xiàng)目：廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201510010113)；創(chuàng)新強(qiáng)校工程專項(xiàng)資金項(xiàng)目(1A20205)。

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603016

第一作者：碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師(姚勇芳教授為通訊作者,E-mail:2002102016@gdite.edu.cn)。