徐曉霞，陳安均，趙江欣，劉興艷，費(fèi)召軍，鄧雯瑾，李見森

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 四川 雅安，625014)

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鮮切生菜貯藏期病原真菌的分離及鑒定

徐曉霞，陳安均*，趙江欣，劉興艷，費(fèi)召軍，鄧雯瑾，李見森

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 四川 雅安，625014)

摘要以鮮切生菜為試材，采用傳統(tǒng)的微生物分離手段分離純化在4 ℃貯藏過程中引起腐爛的主要病原真菌，通過回接試驗(yàn)驗(yàn)證其致病性。通過形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析其分類地位。結(jié)果表明：從貨架期終點(diǎn)的鮮切生菜中共篩選出菌落形態(tài)差別比較明顯的病原真菌4株，經(jīng)鑒定其依次為短柄帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)、擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)、翅孢殼霉(Emericellopsis sp).和暗孢節(jié)菱孢(Arthrinium phaeospermum)，4種病原真菌中擴(kuò)展青霉為主要致病菌。

關(guān)鍵詞鮮切生菜;病原真菌;分離;鑒定

鮮切生菜是指以新鮮生菜為原料，經(jīng)篩選、清洗、切割、殺菌、包裝等加工過程，再經(jīng)冷藏運(yùn)輸進(jìn)入超市、冷柜銷售或快餐食品企業(yè)的即食產(chǎn)品[1]。其不但符合消費(fèi)者對新鮮、衛(wèi)生、方便、環(huán)保及健康食品的需要，而且還可以滿足食品快餐業(yè)、團(tuán)體飲食業(yè)、軍事后勤供給的特殊需要，拓寬生菜原料的應(yīng)用范圍，實(shí)現(xiàn)生菜的綜合利用。近年來鮮切生菜的消費(fèi)量持續(xù)增加，具有巨大的市場前景和經(jīng)濟(jì)效益[2-4]。

鮮切生菜在流通過程中極易發(fā)生品質(zhì)變化，且微生物侵染是造成其在貯藏期腐敗變質(zhì)并限制產(chǎn)品流通和貨架期最主要的原因[5]，其中霉菌是常見的微生物致腐菌[6]，可引起多種鮮切蔬菜腐敗。鮮切生菜腐敗變質(zhì)不僅導(dǎo)致其在冷藏條件下的貨架期很短，同時造成了大量的經(jīng)濟(jì)損失，還存在一定的食品安全隱患，因此微生物病害已成為鮮切生菜進(jìn)一步發(fā)展的瓶頸[7]。蔬菜很適合霉菌、細(xì)菌和酵母菌的生長，其中細(xì)菌和霉菌較常見，酵母菌數(shù)量較少[8]。但國內(nèi)外對鮮切生菜病原微生物的研究主要集中在引起食源性疾病的致病菌上[9-10]，對腐敗菌的研究較少，并且主要集中在采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對微生物菌落計(jì)數(shù)，同時對鮮切生菜病原菌研究主要集中對腐敗細(xì)菌的研究[11]，對病原真菌的研究較少，無法明確導(dǎo)致鮮切生菜腐爛的主導(dǎo)真菌。因此，對鮮切生菜致腐病原真菌進(jìn)行研究能夠?yàn)轷r切生菜微生物病理研究奠定基礎(chǔ)，同時為進(jìn)一步有針對性的殺菌處理提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)借鑒，并為鮮切生菜加工過程進(jìn)行有效控制提供參考，從而有效的延長鮮切生菜的貨架期。

1材料與方法

1.1材料與設(shè)備

1.1.1材料

生菜購買于雅安市雨城區(qū)農(nóng)貿(mào)市場，選擇新鮮、健壯、無機(jī)械傷、清潔、成熟度基本一致且無病蟲害的生菜作為供試材料，迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后置于4 ℃冰箱中備用。

1.1.2供試培養(yǎng)基及試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)；用于PCR擴(kuò)增的試劑和擴(kuò)增引物購自天根生化科技(北京)有限公司和英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司；真菌基因組DNA提取試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3主要儀器設(shè)備

冷凍離心機(jī)(Sorvall ST 16R)，美國Thermo Fisher Scientific公司；人工氣候箱(GZ-380-GSI)，韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；PCR儀(PTC-200)，BIO-RAD公司；電泳儀(DY-A)，上?？颠_(dá)儀器廠；凝膠成像儀(Gel Doc XR)，BIO-RAD公司；生物安全柜(HR20-ⅡA2)，青島海爾特種電器有限公司；生化培養(yǎng)箱(BPC-250 F)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電熱手提式壓力蒸汽滅菌鍋(SYQ-DSX-280B)，上海申安醫(yī)療器械廠；超純水機(jī)(Milli-Q Gradient)，美國Millipore公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1鮮切生菜的處理方法

新鮮生菜去除表面葉片經(jīng)流動自來水沖洗，于無菌超凈工作臺中用75%的酒精滅菌的鋒利的不銹鋼刀去除中心桿莖并切分成長寬各3 cm左右的塊，切分好的生菜立即在250 IU/mL nisin+0.15%檸檬酸+0.05%雙乙酸鈉復(fù)合抑菌劑中浸泡2 min[12]，4℃無菌蒸餾水清洗3次，手動果蔬甩干機(jī)去掉多余的水分，取200 g為1組，分為若干組，用0.02 mm聚乙烯保鮮袋包裝，置于樂扣箱中，以保持鮮切生菜貯藏環(huán)境中的相對濕度，置于4 ℃條件下貯藏，在貨架期終點(diǎn)時取樣。

1.2.2菌株的分離純化與致病性測定

在無菌條件下準(zhǔn)確稱取樣品25 g，剪碎、混勻，放入225 mL無菌生理鹽水(濃度0.85%)中，充分搖勻之后用1 mL移液槍加入含有9 mL的生理鹽水試管中進(jìn)行10倍遞增稀釋，稀釋成所需濃度梯度，充分搖勻。選取合適梯度的稀釋液0.1 mL涂布在PDA培養(yǎng)基上，每個稀釋度做3個平行，同時分別吸取0.1 mL空白稀釋液加入無菌平皿中作空白對照。從培養(yǎng)基上挑取典型生長的形態(tài)不同的菌落，平板劃線法反復(fù)分離、純化，直至菌落的生長狀態(tài)和形態(tài)特征表現(xiàn)一致時得到純的菌落，于4 ℃保存。

刮取PDA培養(yǎng)基平板上真菌分離物的子實(shí)體于100 mL的滅菌蒸餾水中，置渦旋儀上振蕩3 min，用4層滅菌紗布過濾，去除雜質(zhì)和菌絲，得到分生孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并用無菌蒸餾水調(diào)節(jié)菌懸液濃度使其最終濃度大約為1×106個/mL分生孢子，以噴霧法進(jìn)行回接試驗(yàn)，以不接種為對照，觀察感病鮮切生菜外觀發(fā)病癥狀、發(fā)病速度與發(fā)病程度，確定它們的致病性，從而初步選擇出病原真菌。根據(jù)柯赫氏法則，從接種并發(fā)病的鮮切生菜中分離純化微生物，將分離出的菌株與所接種菌株的菌落形態(tài)及菌絲形態(tài)進(jìn)行比較，判斷是否與接種菌株一致，確定鮮切生菜的病原真菌。

1.2.3鮮切生菜病原真菌的鑒定

1.2.3.1病原真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

分離的真菌在28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3～7 d后，觀察并記錄真菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，包括形狀、色澤、菌絲特征等。采用直接挑取法和濕室培養(yǎng)法[13]，顯微鏡觀察菌絲形態(tài)、孢子形狀和分生孢子梗著生情況，記錄觀察結(jié)果并拍照，根據(jù)《真菌鑒定手冊》[14]與《真菌分類學(xué)》[15]對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.3.2病原真菌分子生物學(xué)鑒定

活化從鮮切生菜中已經(jīng)分離純化得到的病原真菌，按照真菌基因組DNA提取試劑盒的說明書提取DNA后，進(jìn)行 ITS序列的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增用引物ITS1與ITS4。PCR擴(kuò)增在PCR儀上進(jìn)行。PCR 反應(yīng)體系(30 μL)：上下游引物各1 μL，模板DNA1 μL，2×PCR Master Mix 15 μL，超純水12 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃終延伸5 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照。PCR產(chǎn)物由擎科生物有限公司進(jìn)行測序。將得到的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性檢索和比對分析，獲得與其同源性較高的相似序列，使用MEGA5.1進(jìn)行序列比對，比對結(jié)果Neighbor-Joining法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[16]。

2結(jié)果與分析

2.1病原真菌的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

鮮切生菜貯藏至感官拒絕點(diǎn)時，利用純培養(yǎng)的方法，從PDA培養(yǎng)基中共篩選出菌落形態(tài)差別比較明顯的疑似病原真菌7株，經(jīng)回接試驗(yàn)，確定目標(biāo)菌落，共篩選出4株病原真菌，標(biāo)號分別為P1、P2、P4和P5。將純化后的菌株接種于PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)2～10 d，觀察菌落及顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)(見圖1)。

圖1　真菌菌落形態(tài)與顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.1　Colony morphology and microscopic structure of fungi

P1在PDA培養(yǎng)基上生長旺盛，菌落質(zhì)地松散，絲絨狀，表面干燥，邊緣不整齊，培養(yǎng)初期菌落為白色，培養(yǎng)10 d后菌變?yōu)榈稚?，培養(yǎng)基反面為淡黃色；菌絲無隔膜，分生孢子梗直接產(chǎn)生于氣生菌絲上，球形，透明，呈鏈狀。根據(jù)文獻(xiàn)[17]鑒定為帚霉屬。

菌株P(guān)2在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落初期白色，繼續(xù)培養(yǎng)至10 d時，菌落向培養(yǎng)基周圍的均勻伸展，整體呈現(xiàn)灰綠色，菌落表面密生綠色粉末孢子粉，菌落邊緣不整齊，白色，培養(yǎng)皿背面黃色；其分生孢子梗從菌絲垂直生出，分散或聚集成孢梗束，菌絲具清晰隔膜，頂端分支排列成掃帚狀，不對稱分枝，最后一級產(chǎn)生分生孢子，分生孢子串生，單個孢子球形。根據(jù)上述特征將該菌鑒定為半知菌亞門絲孢綱絲孢目叢梗孢科青霉屬。

P4在PDA培養(yǎng)基上圓形，淺橙粉色，中心有放射狀接種點(diǎn)，外表呈短絨毛狀，滲透在培養(yǎng)基表面淺層，干扁狀，均勻，以接種點(diǎn)為中心向周圍蔓延生長，培養(yǎng)皿的反面為橙色。菌絲無明顯隔膜，菌絲末端長出分生孢子，分生孢子不易脫落且形成分支菌絲，分生孢子長的橢球形，菌株P(guān)4的形態(tài)特征與已報(bào)道翅孢殼屬較為相似[18]，初步鑒定出P4為翅孢殼屬。

菌株P(guān)5在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，28 ℃培養(yǎng)2 d即可，菌落質(zhì)地松散，外觀干燥，白色，呈絨毛狀，培養(yǎng)基背面為白色，菌株氣生菌絲發(fā)達(dá)，初期菌絲較細(xì)，白色，培養(yǎng)7 d后菌落鋪滿整個平板，菌絲變粗，不產(chǎn)色素；菌絲具有隔膜，分生孢子串生，球形。根據(jù)菌落及細(xì)胞形態(tài)初步鑒定為節(jié)菱孢屬[19]。

2.2致腐真菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

所提取的4株鮮切生菜病原真菌的DNA，PCR擴(kuò)增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，均得到重復(fù)性好且穩(wěn)定、清晰的單一條帶。圖2為鮮切生菜4 ℃下病原真菌PCR產(chǎn)物電泳圖。

圖2　ITS擴(kuò)增電泳圖Fig.2　Amplification electrophoretogram of ITS

PCR產(chǎn)物由擎科生物有限公司進(jìn)行測序。將得到的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性檢索和比對分析，獲得與其同源性較高的相似序列，使用MEGA5.1進(jìn)行序列比對，比對結(jié)果用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖3。

3結(jié)論與討論

從貨架期終點(diǎn)鮮切生菜分離到7種疑似病原真菌，通過致病性測定，發(fā)現(xiàn)4種真菌具有致病性，接種后再分離菌株與自然腐爛分離到的菌株形態(tài)一致。根據(jù)病原真菌形態(tài)學(xué)特征及rDNA-ITS序列分析，最終確定P1為短柄帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)，P2為擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)，P4為翅孢殼屬(Emericellopsis sp.)，P5為暗孢節(jié)菱孢(Arthrinium phaeospermum)。

由于生菜品種、貯存條件及操作環(huán)境的不同，因此所分離的病原真菌的種類受到一定的限制，隨著采樣數(shù)量的增大和采樣地點(diǎn)的增多，鮮切生菜致腐真菌的種類可能還會進(jìn)一步增加。目前關(guān)于這幾種菌株的報(bào)道多集中在其他果蔬上，擴(kuò)展青霉菌在柑橘、鮮切卷心菜上均有報(bào)道，青霉菌具有較強(qiáng)的致病性，可引起多種果蔬的病害[11,20]。擴(kuò)展青霉產(chǎn)生展青霉素[21]，展青霉素是一種對動物具有致癌、致畸、致突變的真菌毒素，而腐爛的傷口有利于展青霉素產(chǎn)生菌擴(kuò)展青霉的侵入與生長[22]，故而鮮切生菜易受到此菌的侵害。劉波等[23]報(bào)道了短柄帚霉是蘑菇的病原菌，楊建勛等[24]研究報(bào)道了短柄帚霉具有較強(qiáng)的致病性。饒霖在甘蔗中分離鑒定出暗孢節(jié)菱孢菌株，同時證明其具有較強(qiáng)的致病性[25]。但可能由于貯存條件及操作環(huán)境的不同，在其他果蔬研究報(bào)道中沒有發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)檢測到的翅孢殼屬。

鮮切生菜貯藏過程中微生物的侵染嚴(yán)重，但目前國內(nèi)外對鮮切生菜病原微生物的研究主要集中在引起食源性疾病的致病菌上[9-10]，對腐敗菌的研究主要集中在對鮮切生菜腐敗細(xì)菌的研究[11]，對鮮切生菜病原真菌研究報(bào)道較少，在鮮切生菜貯藏過程中病原真菌之間的相互作用、生化活性、影響因素、致病機(jī)制以及控制方法等方面還需進(jìn)行深入、全面的研究，進(jìn)一步加強(qiáng)和完善鮮切生菜病原微生物學(xué)理論，從而更全面、科學(xué)、有效地控制鮮切生菜中病原微生物的生長，提高鮮切生菜的品質(zhì)，為廣大的消費(fèi)者提供營養(yǎng)、安全的鮮切生菜產(chǎn)品。本文對鮮切生菜病原真菌的確定可以強(qiáng)化鮮切生菜的質(zhì)量控制，幫助企業(yè)采取有效的加工工藝，為以后鮮切生菜的保鮮研究提供了一定的理論依據(jù)。

圖3　以ITS-rDNA基因序列為分子標(biāo)記的真菌菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3　The phylogenetic tree of fungi based on ITS-rDNA sequence

測序結(jié)果表明，P1與NCBI登錄號KP269018.1菌株序列相似度達(dá)99%，系統(tǒng)進(jìn)化樹同源性比對結(jié)果表明，菌株P(guān)1與短柄帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)同源性最近，以100%的置信度聚在一支上。此外，形態(tài)學(xué)觀察表明P1菌株形態(tài)特征與短柄帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)基本一致，因此P1確定為Scopulariopsis brevicaulis。P2菌與擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)親緣關(guān)系最近，自檢支持率達(dá)99%，與該屬其他2個種存在一定距離，與其余幾個屬距離則更遠(yuǎn)，確定P2與Penicillium expansum為同種真菌。P4與翅孢殼屬(Emericellopsissp.)同源性最高，為98%，且與其遺傳距離最近，自檢支持率達(dá)98%，這與NCBI比對的結(jié)果完全符合，菌株P(guān)4確定為翅孢殼屬(Emericellopsissp.)。P5與暗孢節(jié)菱孢(Arthrinium phaeospermum)以99%的自檢支持率聚在一起，同時，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察確定P5為Arthrinium phaeospermum。

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Isolation and identification of pathogenic fungi from fresh-cut lettuce during storage

XU Xiao-xia，CHEN An-jun*，ZHAO Jiang-xin， LIU Xing-yan，F(xiàn)EI Zhao-jun，DENG Wen-jin，LI Jian-sen

(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

ABSTRACTWith fresh-cut letter as experimental material, the main pathogenic fungal were isolated and purified at 4 ℃ during its storage through the traditional microbial isolation method, and then their corruptibility were verified by tie-back experiment. The taxonomy information of these isolated fungi was analyzed through morphologic observation, molecular biological identification and phylogenetic analysis. The results showed that four pathogenic strains were isolated by comparing the differences on colony morphology of the fresh-cut lettuce at the end of shelf life, which were identified as Scopulariopsis brevicaulis, Penicillium expansum, Emericellopsis sp. and Arthrinium phaeospermum. Penicillium expansum was the main pathogenic bacteria.

Key wordsfresh-cut lettuce； pathogenic fungi； isolation； identification

收稿日期：2015-11-09，改回日期：2015-12-01

基金項(xiàng)目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(“863”計(jì)劃)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603015

第一作者：碩士研究生(陳安均副教授為通訊作者，E-mail:59191946@qq.com)。