李瑩瑩 熊煒 宋婷 曹振華 欒維江＊

（天津師范大學生命科學學院／天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387；＊通訊聯(lián)系人，E－mail：lwjzsq＠163.com）

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水稻開花時間基因OsDTH 10的過表達分析

李瑩瑩 熊煒 宋婷 曹振華 欒維江＊

（天津師范大學生命科學學院／天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387；＊通訊聯(lián)系人，E－mail：lwjzsq＠163.com）

李瑩瑩，熊煒，宋婷，等.水稻開花時間基因OsDTH10的過表達分析.中國水稻科學，2016，30（2）：121－126.

摘 要：開花時間（抽穗期）是農作物一個重要的農藝性狀，與農作物的產量息息相關。調節(jié)農作物的開花抽穗時間是提高農作物產量的一條重要途徑。為了揭示水稻開花時間基因OsDTH10在水稻抽穗期調控中的功能，利用反向遺傳學方法構建了水稻OsDTH10基因過量表達載體，獲得轉基因植株，分析目的基因在過量表達條件下的功能。結果表明，過量表達OsDTH10導致水稻的抽穗期推遲；RT－PCR檢測結果表明OsDTH10的表達量在晚抽穗的轉基因株系中明顯提高，但在沒有表型的轉基因株系及野生型中表達量較低，說明晚抽穗的表型是由于OsDTH10過量表達所致。組織特異性表達結果表明OsDTH10在植物的不同器官中都有表達，但在水稻的莖、葉鞘中表達量較高。分析OsDTH10在不同葉齡葉片中的表達，結果表明OsDTH10在未完全展開的劍葉葉片及倒2葉中的表達量較高，但在下部較老的倒3葉及倒4葉中的表達量下降。另外，分析OsDTH10在不同光周期條件下的晝夜節(jié)律性表達，結果表明無論在短日照還是長日照條件下，OsDTH10都在白天（光期）有表達高峰，在夜晚（暗期）表達降低，表明OsDTH10可能涉及光周期調控通路調節(jié)水稻的抽穗期。

關鍵詞：水稻；OsDTH10；過量表達；表達分析

植物開花轉變受其內部基因及外界環(huán)境因素共同影響。光周期（日照長短）是植物開花轉變和開花時間的主要環(huán)境決定因素。植物通過內部基因網絡識別和測量日照長短，并對光周期作出反應來調控植物開花的時間［1－3］。根據光周期對植物開花的影響將其劃分為短日照植物、長日照植物和日中性植物［4］。水稻是典型的短日照植物，短日照條件下水稻的抽穗期提早，而長日照條件下水稻的抽穗期延遲?，F已明確短日照條件下水稻抽穗提早主要通過兩條途徑實現：一條是與模式植物擬南芥CO－FT途徑保守的Hd1－Hd3a途徑；另一條是水稻所特有的Ehd1－Hd3a途徑［5－7］。在這兩條途徑中，有幾個調控基因起重要作用。Hd1編碼一個鋅指蛋白，通過調控其下游的Hd3a基因，在短日條件下促進水稻的開花，但在長日條件下Hd1通過抑制Hd3a的表達延遲水稻的開花［8－9］。Hd3a是水稻抽穗開花的激活子，它可以促進水稻成花，是水稻的成花素［10］，Hd3a在短日照條件下有較高的水平，但在長日照條件下表達水平很低。RFT1是Hd3a的同源基因，也是水稻開花的激活子。在短日照條件下與Hd3a功能冗余，但在長日照條件下可以促進水稻開花，是水稻在長日照條件下的成花素［11］。Ehd1編碼一個B型的應答效應因子，在短日照條件下通過誘導FT－like基因（如Hd3a、RFT1等）的表達而促進水稻開花［12］。而在長日照條件下水稻開花延遲主要通過兩條途徑實現：一條途徑是通過Hd1的抑制作用，負向調控Hd3a的表達從而推遲水稻的抽穗開花時間；另一條途徑是通過開花的抑制子Ghd7在長日照條件下抑制Ehd1的表達，進而抑制Hd3a和RFT1的表達，從而推遲水稻的抽穗［13］。這兩條途徑最終都通過成花素基因Hd3a和RFT1的表達調控調節(jié)水稻抽穗開花。成花素基因編碼一個磷酯酰乙醇胺結合蛋白（Phosphatidylethanolaminebinding protein，PEBP）家族［14］，擬南芥中已發(fā)現該家族成員在功能上已有了分化，除了促進擬南芥成花的FT基因外，還發(fā)現一個與FT基因同源但功能卻完全相反的TFL1家族成員，它能夠抑制擬南芥開花［15］。水稻中該家族有13個成員［16］，Hd3a和RFT1是兩個功能明確的成員，但其他成員功能仍然未知。為了進一步研究水稻中成花素家族成員的功能，我們對其他未知的家族成員進行反向遺傳學分析，發(fā)現其中一個家族成員OsDTH10（Os06g35940）與Hd3a和RFT1在水稻抽穗開花上具有相反的功能，過量表達Os－DTH10延遲了水稻抽穗。另外還揭示了Os－DTH10的表達規(guī)律，表明OsDTH10可能涉及光周期調控通路調控水稻的抽穗期。

1 材料與方法

1.1 材料

粳稻品種中花11（Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Zhonghua 11）及其轉基因植株用于本實驗，材料種植于天津市農業(yè)科學院試驗田。田間常規(guī)管理。

1.2 OsDTH10過表達載體的構建

OsDTH10目的基因用RT－PCR方法獲得，總RNA從40d的水稻葉片中提取，用M－MLV反轉錄酶反轉錄合成cDNA，以它為模板，用基因特異性引物OsDTH10F（5′－ATTggtaccGCTTAGCTTCA GCTCACACC－3′，小寫字母為酶切位點）和OsDTH10R（5′－ATTgtcgacGCTGGCTAGACACA CACTGCAT－3′，小寫字母為酶切位點）進行PCR擴增，獲得目的基因完整的ORF（開放閱讀框）。PCR運行程序如下：95℃下1 min；95℃下30s，60℃下30s，72℃下30s，35次循環(huán)；之后72℃下延伸5min。凝膠檢測后回收純化目的片段，將獲得的目的片段用相應酶切位點連入空載體pCAMBIA2300中，獲得過表達融合載體。對融合載體進行測序驗證，正確無誤后用農桿菌介導的遺傳轉化方法獲得轉基因植株，并用空載體產生轉基因植株作對照，具體程序參照文獻［17］。

1.3 DNA的提取及轉基因植株的分子檢測

用CTAB法［18］從水稻葉片中提取基因組DNA。然后用載體中的新霉素磷酸轉移酶抗性基因（NPTⅡ）對獲得的過表達轉基因植株進行PCR檢測。所用引物為NPTⅡF（5′－TTCTCACTGAA GCGGGAAGGG－3′）和NPTⅡR（5′－GCGATACC GTAAAGCACCAGG－3′）。反應條件如下：94℃下4min；94℃下30s，57℃下30s，72℃下30s，30次循環(huán)；之后72℃下延伸5min。

1.4 目的基因的表達分析

在過表達轉基因植株的表達分析中，總RNA 從60d水稻植株的葉片中提取；在水稻組織特異性表達分析中，總RNA分別從水稻根、莖、不同部位的葉片、莖頂端分生組織、不同時期的幼穗中提取。提取的總RNA用DNaseⅠ進行處理，消化基因DNA后用M－MLV反轉錄酶反轉錄合成cDNA后進行RT－PCR。引物序列為OsDTH10F（5′－CTGT GATGTATGATGGGAGG－3′）和OsDTH10R（5′－AAGGTTGGGTTGCTGGGATT－3′）。運行程序如下：94℃下4min；94℃下30s，58℃下30s，72℃下30s，32次循環(huán)；之后72℃下延伸5min。并以水稻OsActin1為內參進行相對定量分析。引物為OsActin1F（5′－GACTCTGGTGATGGTGTCAGC－3′）和OsActin1R（5′－GGCTGGAAGAGGACCTC AGG－3′）。反應條件為94℃下4min；94℃下30s，60℃下30s，72℃下30s，24次循環(huán)；之后72℃下延伸5min。

1.5 光周期材料的處理及表達分析

田間生長40d、健壯一致的野生型中花11移入大型人工氣候箱中，分別用兩個光周期條件進行處理，即長日照（LD，15h光照／9h黑暗）和短日照（SD，11h光照／13h黑暗）。溫度為28℃。處理25 d后，按24h節(jié)律性，每隔3h取樣提取總RNA，并用DNaseⅠ進行處理，消化基因DNA后反轉錄合成cDNA，利用qRT－PCR分析目的基因在不同光周期條件下的表達模式。qRT－PCR按照SYBR Green PCR master mix（Vazyme，南京）試劑盒說明操作，在7500Fast實時PCR System（ABi－7500，美國）熒光定量PCR儀上進行擴增反應，并用2－△△Ct方法進行相對定量分析，每個反應重復3次。所用引物同1.4所述。

2 結果與分析

2.1 OsDTH10過表達載體的構建

用RT－PCR方法從水稻葉片中獲得OsDTH10的全長ORF，目的片段符合預期設計（圖1－B）。純化回收后用限制性內切酶KpnⅠ和BamHⅠ對目的片段和空質粒pCAMBIA2300進行酶切，純化回收后用T4DNA連接酶進行連接，獲得重組載體。對重組質粒進行酶切檢測，發(fā)現切出了預期的目的片段（圖1－C），表明目的片段已成功連入空載體中，獲得最終的過表達載體（圖1－A）。將構建成功的重組質粒進行測序驗證后，轉化到農桿菌EHA105中，用于后續(xù)的轉基因實驗。

2.2 轉基因植株的表型分析

通過農桿菌介導的遺傳轉化，將重組載體pCAMBIA2300－Os DTH10導入野生型中花11中，最終獲得了11個獨立株系的98株T0代轉基因陽性植株。我們選取了5個株系種植到大田里，獲得T1代轉基因株系。并檢測了轉基因植株中目的基因的表達，發(fā)現其中3個株系目的基因表達水平明顯提高（3～5號株系；圖2－B），其他兩個株系與野生型相比沒有明顯差異（1號和2號株系；圖2－B），表明所構建的過表達載體正常工作。表型觀察發(fā)現這3個表達量明顯提高株系（3～5號株系）的抽穗期比野生型對照分別推遲了4、7和16d（圖2－A，C），而1號和2號株系的抽穗期與野生型沒有明顯差異，說明轉基因植株延遲抽穗是由OsDTH10基因過量表達所致（圖2－C）。

A－過表達載體結構；LB為T－DNA左邊界；NPTⅡ－新霉素磷酸轉移酶抗性篩選標記；p2×35S－2個串連的花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子；RB為T－DNA右邊界。B－OsDTH10全長開放閱讀框的PCR擴增。C－過表達載體的酶切鑒定。1～3為3個不同單克?。籑－DNA標記。A，Constructure of overexpression vetor；LB，Left border of TDNA；NPTⅡ，Neomycin phosphotransferaseⅡ；p2×35S，Double cauliflower mosaic virus（CaMV）35Spromoter；RB，Right border of T－DNA；B，PCR amplification of OsDTH10 full open reading frame；C，Digesting identification of recombinant plasmid；1 －3，Three independent clones of recombinant plasmid；M，DNA marker.圖1 過表達載體的構建Fig.1.Construction of overexpression vetor.

2.3 OsDTH10基因的組織特異性表達分析

為了確定OsDTH10在不同組織器官中的表達，分別提取了野生型水稻中花11的莖頂端分生組織、根、葉片、葉鞘、莖和不同時期幼穗的總RNA，反轉錄合成cDNA，通過RT－PCR檢測目的基因在水稻不同器官中的表達差異。結果顯示OsDTH10在水稻各個組織器官中均有表達，但表達量有差異。比較而言，在莖和葉鞘中的表達量最高（圖3－A），在莖頂端分生組織、14cm長幼穗及葉片中次之。我們進一步分析了OsDTH10在同一株水稻上不同葉齡葉片中的表達。結果顯示，OsDTH10在最上部還未完全展開葉片和倒2葉中的表達量較高，但在較老的倒3葉和倒4葉中表達量比較低（圖3－B）。

2.4 OsDTH10基因在不同光周期條件下晝夜節(jié)律性表達

A－過表達轉基因植株的表型；WT為空載體轉基因植株對照，OsDTH10－OV為過表達轉基因植株；B－轉基因植株的表達分析；1～5分別為5個獨立的轉基因株系；C－轉基因株系的抽穗期（平均值±標準差，n≥15）。A，Phenotype of transgenic plants；WT，Transgenic plants with empty vector；OsDTH10－OV，OsDTH10－Overexpressing transgenic plants.B，qRT－PCR and RT－PCR analysis of OsDTH10 expression level in different OsDTH10－OVlines；1to 5are five independent OsDTH10－OV lines；C，Heading date of OsDTH10－OVline（mean±SD，n≥15）.圖2 過表達轉基因植株的表型及表達分析Fig.2.Phenotype and expression analysis of OsDTH10－overexpressing transgenic lines（OsDTH10－OV）.

A－OsDTH10組織特異性表達；M－莖頂端分生組織；R－根；L－葉片；LS－葉鞘；S－莖；P1－14cm長幼穗；P2－4cm長幼穗；P3－25 cm長幼穗。B－OsDTH10在不同葉齡葉片中的表達。L1－未完全展開的劍葉葉片，L2－倒2葉，L3－倒3葉，L4－倒4葉。A，Tissue－specific expression of OsDTH10；M，Shoot apical meristem；R，Root；L，Leaf；LS，Leaf sheath；S，Stem；P1，14cm panicle；P2，4cm panicle；P3，25cm panicle.B，Expression of OsDTH10in leaves at various leaf－ages.L1，The unexpanded flag leaf；L2，The second leaf from the top；L3，The third leaf from the top；L4，The fourth leaf from the top.圖3 OsDTH10的組織特異性表達分析Fig.3.Tissue－specific expression of OsDTH10.

A－短日照條件下OsDTH10的表達水平；B－長日照條件下OsDTH10的表達水平。A，Expression level of OsDTH10in short－day conditions；B，Expression level of OsDTH10in long－day conditions.圖4 OsDTH10基因在不同光周期條件下的晝夜節(jié)律性表達Fig.4.Circadian rhythm expression of OsDTH10 under different photoperiods.

由于過表達轉基因植株表現延遲抽穗，我們推測OsDTH10基因可能與光周期途徑相關，為此我們進一步分析了目的基因在不同光周期下的表達。結果表明，無論在長日照還是短日照條件下，Os－DTH10在白天（光期）的表達量較高，而在晚上（暗期）表達量較低（圖4－A，B）。短日照條件下，Os－DTH10 mRNA水平從早上6：30開始積累到下午15：30達到峰值，在凌晨降到最低（圖4－A）。長日照條件下，OsDTH10 mRNA積累表現為雙峰，分別在9：30和15：30達到峰值，在凌晨3：30降到最低（圖4－B）。

3 討論

植物開花是環(huán)境因素與控制植物開花的基因網絡相互作用的結果，目前已明確水稻的成花主要是由成花素負責［6－7］。短日照條件下起主要作用的成花素是Hd3a，在長日照條件下起主要作用的成花素是RFT1［11］。這兩個成花素都是FT－like家族基因［16］。模式植物擬南芥中FT和TFL1是FT－like家族中的兩個成員，但它們的功能完全相反［15］，FT促進擬南芥開花，而TFL1則抑制擬南芥開花，維持其營養(yǎng)生長，充當反成花素的作用［19－20］。水稻中FT－like家族共有13個成員［16］，除了已經報道的RFT1和Hd3a分別履行水稻長日照及短日照成花素的功能外，其他成員的功能仍不清楚。本研究揭示了該家族另一成員OsDTH10在水稻中的功能，即過量表達OsDTH10推遲了水稻的抽穗開花時間。這與Hd3a及RFT1有所不同，Hd3a及RFT1是水稻開花的激活子，過量表達Hd3a及RFT1導致水稻提早抽穗。OsDTH10是水稻開花的抑制子，這與擬南芥TFL1基因的功能相似，是水稻中的反成花素。這一結果充分說明了水稻FT－like家族的成員在進化中功能有了很大的分化，因此弄清該家族中每個成員的功能，揭示哪些成員在功能上是冗余的，哪些成員在功能上已有分化，對于揭示水稻成花素基因的進化及功能具有重要的意義。

實時定量PCR結果表明，OsDTH10具有晝夜節(jié)律性表達，在白天表達量較高，而在夜晚表達量較低，這與Hd3a及RFT1表達模式一致。但Os－DTH10無論短日照還是長日照條件下都有較高的表達，這與Hd3a在短日照條件下表達量低有所不同。另外，現已明確成花素基因Hd3a及RFT1首先在葉片接受光的信號，然后運輸到莖頂端分生組織中起作用。分子機理方面，Hd3a或RFT1首先在細胞質中與水稻14－3－3基因（OsGF14b，OsGF14c）互作形成復合體，然后進入細胞核中與水稻OsFD1結合形成復合體，最終調控開花身份基因OsMADS14和OsMADS15的表達水平來調控水稻抽穗的早晚［21－22］。OsDTH10是否有這樣的功能，能否和這些已知的基因相互調控還不清楚，因此，后期創(chuàng)建OsDTH10 RNAi轉基因植株，利用RNAi及過表達轉基因植株，用不同的光周期條件處理，研究光周期調控通路中其他已知基因的表達，揭示目的基因與光周期通路中其他關鍵基因的調控關系，從而揭示OsDTH10在水稻抽穗開花時間上的功能。

參考文獻：

［1］ 宋遠麗，欒維江.水稻開花的光溫調控分子機理.中國水稻科學，2012，26（4）：383－392.Song Y L，Luan W J.The molecular mechanism of light and temperature control the flowering in rice.Chin J Rice Sci，2012，26（4）：383－392.（in Chinese with English abstract）

［2］ Song Y L，Gao Z，Luan W S.Interaction between temperature and photoperiod in regulation of flowering time in rice.Sci China Life Sci，2012，55（3）：241－249.

［3］ Izawa T.Daylength measurements by rice plants in photoperiodic short－day flowering.Int Rev Cytol，2007，256：191－222.

［4］ Garner W W，Allard H A.Effect of the relative length of day and night and other factors of the environment on growth and reproduction in plants.J Agric Res，1920，18：553－606.

［5］ Itoh H，Nonoue Y，Yano M，et al.A pair of floral regulators sets critical day length for Hd3aflorigen expression in rice.Nat Genet，2010，42：635－638.

［6］ Song Y L，Luan W J.Molecular regulatory network of flowering by photoperiod and temperature in rice.Rice Sci，2012，19 （3）：169－176.

［7］ Tsuji H，Taoka K，Shimamoto K.Regulation of flowering in rice：Two florigen genes，a complex gene network，and natural variation.Curr Opin Plant Biol，2011，14（1）：45－52.

［8］ Luan W，Chen H，Fu Y，et al.The effect of the crosstalk between photoperiod and temperature on the heading－date in rice.PLoS ONE，2009，4：e5891.

［9］ Yano M，Katayose Y，Ashikari M，et al.Hd1，a major photoperiod sensitivity quantitative trait locus in rice，is closely related to the Arabidopsis flowering time gene CONSTANS.Plant Cell，2000，12：2473－2484.

［10］Tamaki S，Matsuo S，Wong H L，et al.Hd3aprotein is a mobile flowering signal in rice.Science，2007，316：1033－1036.

［11］Komiya R，Yokoi R，Shimamoto K.A gene network for longday flowering activates RFT1 encoding a mobile flowering signal in rice.Development，2009，136：3443－3450.

［12］Doi K，Izawa T，Fuse T，et al.Ehd1，a B－type response regulator in rice，confers short－day promotion of flowering and controls FT－like gene expression independently of Hd1.Genes Dev，2004，18：926－936.

［13］Xue W，Xing Y，Weng X，et al.Natural variation in Ghd7 is an important regulator of heading date and yield potential in rice.Nat Genet，2008，40：761－767.

［14］Chardon F，Damerval C.Phylogenomic analysis of the PEBP gene family in cereals.J Mol Evol，2005，61（5）：579－590.

［15］Kobayashi Y，Kaya H，Goto K，et al.A pair of related genes with antagonistic roles in mediating flowering signals.Science，1999，286（5446）：1960－1962.

［16］Ogiso－Tanaka E，Matsubara K，Yamamoto S，et al.Natural variation of the RICE FLOWERING LOCUS T 1 contributes to flowering time divergence in rice.PLoS One，2013，8（10）：e75959.

［17］Hiei Y，Ohta S，Komari T，et al.Efficient transformation of rice（Oryza sativa L.）mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T－DNA.Plant J，1994，6（2）：271－282.

［18］盧揚江，鄭康樂.提取水稻DNA的一種簡易方法.中國水稻科學，1992，6（1）：47－48.Lu Y J，Zheng K L.A simple extraction methods of rice DNA.Chin J Rice Sci，1992，6（1）：47－48.（in Chinese with English abstract）

［19］Kardailsky I，Shukla V K，Ahn J H，et al.Activation tagging of the floral inducer FT.Science，1999，286（5446）：1962－1965.

［20］Abe M，Kobayashi Y，Yamamoto S，et al.FD，a bZIP protein mediating signals from the floral pathway integrator FT at the shoot apex.Science，2005，309（5737）：1052－1056.

［21］Taoka K，Ohki I，Tsuji H，et al.Structure and function of florigen and the receptor complex.Trends Plant Sci，2013，18 （5）：287－294.

［22］Tsuji H，Taoka K，Shimamoto K.Florigen in rice：Complex gene network for florigen transcription，florigen activation complex，and multiple functions.Curr Opin Plant Biol，2013，16（2）：228－235.

Overexpressing Analysis of the Flowering Time Gene OsDTH 10in Rice

LI Ying－ying，XIONG Wei，SONG Ting，CAOZhen－h(huán)ua，LUAN Wei－jiang＊
（College of Life Science，Tianjin Normal University／Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，Tianjin 300387，China；＊Corresponding author，E－mail：lwjzsq＠163.com）

LI Yingying，XIONG Wei，SONG Ting，et al.Overexpressing analysis of the flowering time gene OsDTH10 in rice.Chin J Rice Sci，2016，30（2）：121－126.

Abstract：Flowering time（heading date）is an important agronomic trait of crops，and it is closely linked with the yield of crops.To reveal the function of rice flowering time gene OsDTH10in rice，we constructed an overexpressing vector of OsDTH10 and analyzed the function of OsDTH10 by the reverse genetics.The results showed that the OsDTH10－overexpressing（OsDTH10－OV）transgenic plants displayed a late heading phenotype，suggesting that the overexpression of OsDTH10delayed the heading－date of rice.RT－PCR expression analysis showed that the expression level of OsDTH10was increased obviously in OsDTH10－OVlines with phenotype compared with the transgenic lines without phenotype and wild type plants，indicating that late heading phenotype in OsDTH10－OVlines was caused by the overexpression of OsDTH10.The tissue－specific expression showed that OsDTH10 was expressed in different organs，with the higher expression levels in stem and leaf sheath.Also，we further analyzed the expression of OsDTH10 in leaves at various leaf－ages，and the result showed that OsDTH10 exhibited higher expression in unexpanded flag leaf and the second leaf from the top than these in the third and the fourth leaf from the top.In addition，we also analyzed the expression of OsDTH10 in different photoperiods，and the result indicated that OsDTH10displayed a higher expression during the day time（light stage）and a lower expression at night（dark stage）whatever short－day and long－day conditions，suggesting that OsDTH10 might be involved in the photoperiodic pathways to regulate the heading－date in rice.

Key words：rice；OsDTH10；overexpression；expression analysis

中圖分類號：Q786；S511.01

文獻標識碼：A

文章編號：1001－7216（2016）02－0121－06

基金項目：國家自然科學基金資助項目（31171515）；天津市高校中青年骨干創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃資助項目（ZX110GG017）。

收稿日期：2015－09－21；修改稿收到日期：2015－12－17。