陳雪菲,王　堯,秦召遠(yuǎn),王全喜,2,曹建國*

(1 上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234;2 上海資源植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海辰山植物園,上海 201602)

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水蕨中心體蛋白基因的克隆與原核表達(dá)

陳雪菲1,王堯1,秦召遠(yuǎn)1,王全喜1,2,曹建國1*

(1 上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234;2 上海資源植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海辰山植物園,上海 201602)

摘要:蕨類植物的精子形成是一個(gè)運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器重新發(fā)生的過程,但對(duì)其精子發(fā)生的分子機(jī)制仍不甚了解。中心體蛋白(centrin)是定位于細(xì)胞中心體上的一種高度保守的鈣結(jié)合蛋白,被認(rèn)為可能是最早參與運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器發(fā)生的蛋白質(zhì)?？寺¤b定centrin蛋白為進(jìn)一步分析蕨類精子發(fā)生的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。該研究從蕨類模式植物水蕨(Ceratopteris thalictroides)中克隆到了水蕨centrin基因(CtCEN),其cDNA序列全長為1 077 bp,結(jié)構(gòu)分析表明CtCEN基因?qū)儆贓F-hand超家族的centrin基因。Centrin的系統(tǒng)樹分析發(fā)現(xiàn),藻類、蕨類以及動(dòng)物等具鞭毛游動(dòng)精子的生物聚為一支,而被子植物聚為另一分支,表明centrin的功能可能與運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器鞭毛發(fā)生有關(guān)。原核表達(dá)和Western blot分析表明,CtCEN基因表達(dá)的蛋白能與人源centrin抗體發(fā)生結(jié)合,這一結(jié)果證實(shí)克隆到了centrin基因。

關(guān)鍵詞:中心體蛋白;克隆;原核表達(dá)

中心體蛋白,即centrin最初是從綠藻(Tetraselmisstriata)中分離得到的一種鈣結(jié)合蛋白,屬于高度保守的EF-hand蛋白超家族[1],現(xiàn)已知centrin蛋白存在于從藻類、酵母到人類等所有生物的微管組織中心中[2]。衣藻中centrin主要參與鞭毛形成,是核-基體連接纖維的一個(gè)主要成分[3-4]。芽殖酵母centrin蛋白對(duì)細(xì)胞周期依賴性的紡錘體復(fù)制起重要作用[5]。Errabolu等從人中克隆及鑒定到了3個(gè)centrin同源蛋白[6-7],其中Hscen3在中心體復(fù)制中具有重要作用[8]。高等植物的centrin蛋白研究比較少,最早在擬南芥(Arabidopsisthaliana) 和煙草(Nicotianatabacum)中獲得了centrin同源基因[9-11],但有關(guān)它們的功能未見報(bào)道。隨后Klink等[12]在異形孢子蕨類蘋(Marsileavestita)中克隆得到Mv-centrin,這個(gè)基因在蘋小孢子發(fā)育階段就已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)錄并且以蛋白形式儲(chǔ)存于未萌發(fā)的孢子中,此后在雄配子體發(fā)育和精子發(fā)生過程中,centrin蛋白參與了運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器的形成過程[12]。綜上所述,centrin蛋白在高等生物中主要參與中心體復(fù)制以及細(xì)胞分裂過程,而在低等生物中主要參與運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器鞭毛的發(fā)生。蕨類植物是高等植物中的一個(gè)特殊類群,其精子發(fā)生是一個(gè)運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器重新形成的過程,centrin蛋白極有可能參與了這一過程。本研究從蕨類模式植物水蕨[Ceratopteristhalictroides(L.) Brongn.]中克隆到centrin基因(CtCEN)并對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證,這對(duì)闡明centrin在蕨類精子發(fā)生中的功能以及進(jìn)一步研究centrin蛋白參與運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器形成的過程和分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

以無菌培養(yǎng)3周左右的水蕨成熟雄配子體為實(shí)驗(yàn)材料。載體pET-32a購買于北京全式金基因有限公司。菌株購買于北京博大泰克生物科技有限公司。人源centrin蛋白的鼠抗購買于上海熠晨生物科技有限公司。

1.2CtCEN基因的克隆

1.3CtCEN基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)CtCEN編碼區(qū)PCR產(chǎn)物,采用DNA純化試劑盒進(jìn)行目的片段回收。使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)測(cè)序正確的目的基因和原核表達(dá)載體(pET-32a)分別雙酶切,對(duì)酶切后的質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行回收,按1∶4的比例用T4DNA連接酶在16 ℃連接過夜。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂板挑取單克隆,測(cè)序檢測(cè)重組目的基因。提取轉(zhuǎn)化成功的重組質(zhì)粒,命名為pET32a-CtCEN。

1.4CtCEN基因原核表達(dá)

將pET32a-CtCEN重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21菌株,挑選單個(gè)菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。在菌液OD600達(dá)到0.6左右時(shí),加入適量誘導(dǎo)劑IPTG,37 ℃繼續(xù)振蕩4 h,每小時(shí)取1次菌液(0.5 mL),離心收集菌體,使用超聲儀進(jìn)行超聲破碎,離心后分別取上清和沉淀制樣并通過SDS-PAGE凝膠電泳鑒定表達(dá)結(jié)果。為了進(jìn)一步證實(shí)該蛋白屬于centrin蛋白,對(duì)上述誘導(dǎo)重組蛋白樣品進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。一抗采用的是人源centrin蛋白的鼠抗,稀釋倍數(shù)是1∶1000;二抗選擇的是辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG,稀釋倍數(shù)是1∶2500。最后,按辣根過氧化物DAB顯色試劑盒說明書進(jìn)行顯色及終止反應(yīng)。

1.5CtCEN基因的生物信息學(xué)分析

對(duì)測(cè)序獲得的CtCEN基因所編碼的氨基酸序列同GenBank中已知的centrin氨基酸序列進(jìn)行相似性比對(duì)。利用Clustal X和MEGA 5.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹。

2結(jié)果與分析

2.1CtCEN基因的克隆與序列分析

根據(jù)蘋Mv-centrin基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增獲得的水蕨CtCEN基因保守區(qū)序列,經(jīng)克隆測(cè)序獲得長度為342 bp的序列。利用RACE技術(shù)分別對(duì)CtCEN基因5′末端和3′末端進(jìn)行擴(kuò)增,經(jīng)克隆測(cè)序去除引物接頭后分別獲得5′末端504 bp、3′末端734 bp的序列。對(duì)獲得的序列進(jìn)行拼接,設(shè)計(jì)全長引物獲得CtCEN基因的全長cDNA。由圖1可知,擴(kuò)增序列長度大約1 000 bp,與目的基因的序列長度相似。

將目的基因片段切膠回收后連接至克隆載體,轉(zhuǎn)化挑選陽性菌落測(cè)序,測(cè)序結(jié)果比對(duì)后發(fā)現(xiàn)其與其他物種的centrin基因同源,序列全長為1 077 bp(圖2)。通過在NCBI中進(jìn)行Blastn分析,結(jié)果表明CtCEN序列與蘋、小立碗蘚、衣藻、江南卷柏具有較高相似性,均在80%左右。該基因包含一個(gè)510 bp開放閱讀框,編碼具有170個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì),使用蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析軟件SMART對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析,結(jié)果顯示CtCEN具有4個(gè)鈣結(jié)合位點(diǎn)(EF-hand),這4個(gè)EF-hand分別位于第30～58、66～94、103～131和139～167氨基酸,由此可以推斷CtCEN基因?qū)儆贓F-hand超家族。

2.2CtCEN系統(tǒng)樹構(gòu)建

GenBank已公布centrin基因序列的物種主要包括蕨類植物蘋(M.vestita)和江南卷柏(Selaginellamoellendorffii);藻類植物衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)和團(tuán)藻(Volvoxcarterif.nagariensis);高等植物擬南芥(A.thaliana)、煙草(N.tabacum)和可可(Theobromacacao);人(Homosapiens);鼠(Musmusculus)等。從構(gòu)建的系統(tǒng)關(guān)系(圖3)可知,這10個(gè)物種的centrin基因分成兩大支,第一大支包括藻類植物的團(tuán)藻和衣藻,蕨類植物蘋、卷柏和水蕨,哺乳動(dòng)物人和鼠,其中水蕨、蘋和卷柏聚在一起,其自展支持率達(dá)到96%,體現(xiàn)了它們之間較近的親緣關(guān)系。這幾種蕨類又與2種藻類聚在一起,它們都屬于鞭毛類植物;這些鞭毛類植物的centrin基因又與哺乳動(dòng)物人和鼠的聚為一支,且自展支持率達(dá)到100%,從產(chǎn)生的精子特征上來看,該支物種的共同特征是都能夠產(chǎn)生具鞭毛的游動(dòng)精子,因此,centrin的功能可能與鞭毛發(fā)生有關(guān)。第二大支包括擬南芥、煙草和可可,這些物種屬于被子植物,在整個(gè)生活史過程中都不產(chǎn)生游動(dòng)細(xì)胞,因此,被子植物中centrin的功能可能發(fā)生了改變。

1.DL2000;2.陰性對(duì)照(無模板);3.CtCEN基因全長cDNA

粗體加下劃線ATG表示起始密碼子,粗體加下劃線

圖中分支點(diǎn)的數(shù)字表示基于1 000次重復(fù)該節(jié)點(diǎn)的自展支持率;標(biāo)尺代表遺傳距離

2.3CtCEN基因原核表達(dá)載體的鑒定

利用引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ和XhoⅠ的引物將CtCEN連入pET-32a表達(dá)載體,重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ酶切后獲得大小約6 kb的載體片段和500 bp左右的插入片段(圖4),對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明獲得克隆片段長度為510 bp，與CtCEN基因序列完全一致，即已成功克隆了CtCEN基因并構(gòu)建了表達(dá)載體。

2.4目的蛋白的原核表達(dá)與純化

將pET32a-CtCEN重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21空菌中,用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定,得到有明顯誘導(dǎo)趨勢(shì)的條帶(圖5,A),大小在38 kD左右,在線軟件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)的目的蛋白CtCEN大小約為19 kD,此結(jié)果與預(yù)測(cè)的結(jié)果相符。

2.5蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)鑒定

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白按常規(guī)方法純化后經(jīng)SDS-PAGE分析,用半干法移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封閉后,依次加入稀釋的人源centrin蛋白的鼠抗和羊抗鼠IgG二抗進(jìn)行孵育,最后使用顯色試劑盒顯色。結(jié)果如圖5,B所示,表明克隆并表達(dá)的CtCEN蛋白能夠與人源centrin蛋白抗體雜交,克隆出來基因是水蕨的centrin基因。

3討論

Centrin蛋白是中心體中的鈣調(diào)蛋白,在動(dòng)物、植物、微生物中均有廣泛的分布。我們從水蕨配子體中克隆到centrin 的cDNA片段,其大小占完整編碼框的50%,編碼的氨基酸序列基本覆蓋了4個(gè)鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Western blot分析顯示該Ct-CEN蛋白可與人源centrin蛋白的抗體結(jié)合,表明克隆到的基因確為centrin基因。同源性分析表明CtCEN基因與其他物種的centrin基因同源性較高,相對(duì)較為保守。從系統(tǒng)演化關(guān)系來看,CtCEN基因與蘋和卷柏聚在一起,其自展支持率達(dá)到96%,體現(xiàn)了它們之間較近的親緣關(guān)系,這幾種蕨類又與2種藻類聚為一支,它們都屬于鞭毛類植物,然而這些鞭毛類植物的centrin基因又與人和鼠的centrin-1,centrin-2聚為一支,而人和鼠都能產(chǎn)生具鞭毛的游動(dòng)精子,表明centrin在生物精細(xì)胞發(fā)生上具有重要的作用,特別是在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器和運(yùn)動(dòng)器官的發(fā)生上具有重要作用。

M1.DL2000;M2.λHind Ⅲ;1.CtCEN基因PCR產(chǎn)物;

A.重組質(zhì)粒pET32a-CtCEN的誘導(dǎo)表達(dá)分析:M.蛋白marker

本課題組在水蕨蛋白組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)centrin在水蕨雄配子體精子器發(fā)生階段特異表達(dá),是雄配子體內(nèi)新產(chǎn)生的一種蛋白[13],由此可推斷centrin蛋白參與了精子的發(fā)生過程,其功能與水蕨精細(xì)胞運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器的發(fā)生有關(guān)。盡管高等被子植物如擬南芥、煙草和可可也具有centrin基因,但系統(tǒng)分析表明被子植物的centrin基因聚為單獨(dú)一支,與鞭毛類生物centrin基因關(guān)系較遠(yuǎn),可能表明被子植物centrin基因在演化過程中發(fā)生了功能的改變,不再參與精細(xì)胞的發(fā)生,因?yàn)楸蛔又参镌谡麄€(gè)生活史過程中都不產(chǎn)生游動(dòng)細(xì)胞,centrin基因在進(jìn)化過程中的分化及功能的改變也值得深入研究。

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(編輯:宋亞珍)

Clone and Prokaryotic Expression of Centrin Gene from the FernCeratopteristhalictroides

CHEN Xufei1,WANG Yao1,QIN Zhaoyuan1,WANG Quanxi1,2,CAO Jianguo1*

(1 College of Life and Environment Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China;2 Shanghai Key Laboratory of Plant Functional Genomics and Resource,Shanghai Chenshan Botanical Garden,Shanghai 201602,China)

Abstract:In ferns,the spermatogenesis is a process of de novo formation of the motile apparatuses and the molecular mechanisms of the spermatogenesis were unclear.Centrin,a highly conservative calcium binding protein usually locating in the centrosome,was considered to be the protein that participates the formation of motile apparatuses.Cloning of the centrin gene has some significance for elucidating the molecular mechanism of spermatogenesis of ferns.The present investigation cloned the centrin gene (CtCEN) from the fern model plant,Ceratopteris thalictroides.The full length the cDNA sequence of the CtCEN gene is 1 077 bp,and the structural analysis showed that the gene belongs to be centrin gene of EF-hand protein superfamily.Phylogenetic analysis indicated that the CtCEN of the algae,ferns,animal and human,all of which produce sperms with flagella,is clustered in one branch.The CtCEN of angiosperm is clustered in another branch.It is suggested that the centrin may participate the genesis of flagellum.The prokaryotic expression and Western blot analysis showed that the expressed protein of CtCEN can hybridize with the centrin protein antibody of Human,which indicated that the CtCEN belongs to the centrin family.The present studies lay a foundation for the molecular mechanism of the centrin participating formation of motile apparatuses in fern spermatogenesis.

Key words:centrin;cloning;prokaryotic expression

中圖分類號(hào):Q785;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡(jiǎn)介:陳雪菲(1986-),女,在讀博士研究生,主要從事蕨類植物生物學(xué)研究。E-mail:cxf_227@163.com*通信作者:曹建國,教授,主要從事蕨類植物生殖發(fā)育和蕨類植物資源開發(fā)與利用的研究。E-mail:cao101@shnu.edu.cn

基金項(xiàng)目:上海市自然科學(xué)基金(13ZR1429700);上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)課題(14DZ2260400)

收稿日期:2015-12-18;修改稿收到日期:2016-01-29

文章編號(hào):1000-4025(2016)03-0444-05

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.03.0444