摘 要 實(shí)驗(yàn)研究了窄葉枇杷莖尖離體培養(yǎng)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比和環(huán)境條件。結(jié)果表明：在相對(duì)低溫18 ℃時(shí)，外植體涂凡士林有利于褐化抵制，提高成活率；在TDZ 0.5 mg/L+ BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基條件下，窄葉枇杷莖尖離體培養(yǎng)的褐化率均為0，萌動(dòng)率為100%，成苗率為100%。通過(guò)建立窄葉枇杷莖尖離體培養(yǎng)技術(shù)體系，為其他野生枇杷莖尖離體培養(yǎng)提供理論和技術(shù)參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 窄葉枇杷；莖尖；離體培養(yǎng)；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

中圖分類號(hào)：S667.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.23.047

枇杷屬植物（Eriobotrya），屬薔薇科（Rosaceae）蘋(píng)果亞科（Maloideae），主要分布在我國(guó)南部或東南亞等國(guó)。世界枇杷屬植物約有30個(gè)種或變種，而我國(guó)的枇杷屬植物種質(zhì)資源十分豐富，約占世界野生枇杷資源的2/3，廣泛分布于長(zhǎng)江流域及其以南的各個(gè)省區(qū)[1]。普通枇杷[Eriobotrya japonica （Thunb.）Lindl.]是唯一栽培種，遺傳多樣性相當(dāng)狹窄。野生枇杷種質(zhì)資源具有遺傳多樣性，有很高的利用價(jià)值。例如，野生枇杷具有栽培枇杷品種改良的稀缺性狀如抗病蟲(chóng)、抗逆、抗倒伏等[2]；同時(shí)，野生枇杷實(shí)生苗可作為栽培枇杷的嫁接砧木[3]，且野生枇杷葉片提取物熊果酸等對(duì)癌細(xì)胞有明顯的抑制作用[4，5]。但近幾年走訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由于人類活動(dòng)導(dǎo)致野生枇杷資源逐漸減少[6]，加強(qiáng)野生枇杷種質(zhì)資源的調(diào)查、保護(hù)和利用，是當(dāng)前和未來(lái)枇杷科學(xué)研究與產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要任務(wù)。

近年，對(duì)枇杷種質(zhì)資源的相關(guān)研究，有了新突破，一些研究已經(jīng)初步建立了野生與栽培枇杷莖尖離體培養(yǎng)體系[7-9]。窄葉枇杷（Eriobotrya henryi Nakai）是野生枇杷中的一種，本實(shí)驗(yàn)主要是以窄葉枇杷作為研究對(duì)象，系統(tǒng)地研究了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類與濃度的配比、培養(yǎng)環(huán)境等因素對(duì)窄葉莖尖離體培養(yǎng)和褐化的影響，目的是建立窄葉枇杷莖尖離體培養(yǎng)技術(shù)體系，為其他野生枇杷莖尖離體培養(yǎng)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

窄葉枇杷，保存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)枇杷屬植物種質(zhì)資源圃。

1.2 取材與接種方法

取剛抽梢萌發(fā)，長(zhǎng)約1.5 cm的莖尖，并及時(shí)置于25 mg/L的Vc水溶液中，帶回實(shí)驗(yàn)室，去掉葉片，自來(lái)水沖洗30 min。在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌水沖洗3遍；再用75%（v/v）酒精浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗3遍；再用0.1%（w/v）HgCl2浸泡

7 min，然后用無(wú)菌水沖洗4遍。用刀片切掉莖尖基部褐化部分，或切口涂上凡士林，接種在相應(yīng)培養(yǎng)基上，以上操作應(yīng)嚴(yán)格控制在2 h以內(nèi)完成。每個(gè)處理接種40個(gè)芽。

1.3 其他培養(yǎng)條件及統(tǒng)計(jì)方法

培養(yǎng)基主要成分：MS 4.43 g/L；瓊脂 5 g/L；蔗糖 30 g/L。培養(yǎng)條件：溫度18±1 ℃，濕度65%～70%，光照24 h/d。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法：統(tǒng)計(jì)時(shí)間為接種后第20天

褐化率（%）=褐化莖尖數(shù)/接種總數(shù)×100%

相對(duì)萌動(dòng)率（%）=芽萌動(dòng)數(shù)/（接種總數(shù)—褐化莖尖數(shù)）×100%

成苗率（%）=長(zhǎng)成植株數(shù)/芽萌動(dòng)數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度和外植體切口涂凡士林對(duì)窄葉枇杷莖尖培養(yǎng)的褐化影響

本試驗(yàn)在KT 1.0 mg/L和NAA 0.5 mg/L組合中，做了不同培養(yǎng)溫度和在同種溫度下莖尖切口涂與不涂凡士林對(duì)窄葉枇杷莖尖培養(yǎng)的褐化影響。

結(jié)果如表1所示，3個(gè)不同溫度下的處理對(duì)窄葉枇杷離體培養(yǎng)的褐化程度有很大的差異。實(shí)驗(yàn)表明，培養(yǎng)環(huán)境溫度越高褐化越嚴(yán)重，當(dāng)溫度達(dá)到29 ℃或超越該溫度時(shí)，無(wú)論是有涂凡士林的，還是沒(méi)涂的莖尖褐化率達(dá)到100%；而培養(yǎng)溫度越低，抗褐化效果越好，當(dāng)溫度降到18 ℃時(shí)，切口涂凡士林的莖尖褐化率降到9.38%，沒(méi)有涂凡士林的降到11.1%。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，溫度對(duì)窄葉枇杷莖尖離體培養(yǎng)成功與否是一個(gè)關(guān)鍵條件。

在莖尖切口涂凡士林的處理的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有涂凡士林的莖尖的褐化率比沒(méi)有涂的要低，如在18 ℃下，涂凡士林的處理褐化率為9.38%，未涂的為11.1%；25 ℃下涂凡士林的處理褐化率為27.78%，而未涂的達(dá)到40%，涂凡士林的處理效果差異明顯。

2.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合及濃度對(duì)窄葉枇杷莖尖離體培養(yǎng)的抗褐化影響

表2顯示，在窄葉枇杷離體培養(yǎng)中，使用KT和NAA組合的褐化率很低；但在生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為KT和NAA的條件下，都無(wú)法成苗。在6-BA和NAA組合中，褐化率比KT和NAA的組合要高達(dá)到25%，相對(duì)萌動(dòng)率為75%，但成苗率為0%。說(shuō)明KT與6-BA相比，對(duì)窄葉枇杷抗褐化效果要好些，但莖尖的啟動(dòng)萌發(fā)沒(méi)有6-BA的效果好。無(wú)論是KT或6-BA，當(dāng)它們單獨(dú)使用時(shí)，都難以讓萌發(fā)的莖尖繼續(xù)生長(zhǎng)。

在TDZ、KT、6-BA和NAA的組合中實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)TDZ和NAA的組合處理，褐化率為6.67%；而該組合當(dāng)分別添加0.5 mg/L KT和0.5 mg/L 6-BA 時(shí)均未見(jiàn)褐化，且相對(duì)萌動(dòng)率及成苗率均達(dá)到100%。

2.3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合及濃度對(duì)窄葉枇杷莖尖培養(yǎng)葉片生長(zhǎng)的影響

為了觀察TDZ與KT、6-BA、NAA的組合條件下，初代培養(yǎng)的生長(zhǎng)效果，對(duì)2.2的試驗(yàn)中，把編號(hào)為3～5處理的窄葉莖尖培養(yǎng)萌發(fā)葉片的長(zhǎng)勢(shì)在第20天進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)分析，隨機(jī)設(shè)計(jì)2次重復(fù)。如表3所示。

從表3統(tǒng)計(jì)得出，6-BA、TDZ和NAA的組合，萌發(fā)葉片數(shù)是最多，平均達(dá)到2.89片葉，且生長(zhǎng)勢(shì)最好。而不添加6-BA或KT的TDZ、NAA組合，葉片少，長(zhǎng)勢(shì)弱。但方差分析結(jié)果得出，各種組合之間的差異性不大。

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，基本上掌握了窄葉枇杷的莖尖離體培養(yǎng)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑條件，初步確定在6-BA

0.5 mg/L、TDZ0.5 mg/L和NAA 0.1 mg/L的組合下可以達(dá)到最佳離體培養(yǎng)效果。

3 討論

本研究通過(guò)枇杷屬植物離體培養(yǎng)的外部條件探索，得出野生枇杷種在相對(duì)低溫（18 ℃）下莖尖培養(yǎng)，對(duì)抑制褐化效果明顯。接種時(shí)，莖尖切口涂上凡士林，除了有效抵制褐化，也有利于提高萌動(dòng)率。窄葉枇杷莖尖離體培養(yǎng)的試驗(yàn)中，TDZ是一個(gè)不可或缺的激素，無(wú)論是莖尖的抗褐化、還是相對(duì)萌動(dòng)率和成苗率，效果都很顯著，而在沒(méi)有TDZ下，使用其他植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑只能降低褐化率和提高相對(duì)萌動(dòng)率，但卻無(wú)法成苗或隨后衰亡。通過(guò)對(duì)環(huán)境條件和接種技術(shù)的試驗(yàn)摸索，得到窄葉枇杷莖尖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合，為以后其他野生枇杷屬植物的莖尖離體培養(yǎng)提供有益參考。

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（責(zé)任編輯：劉昀）