李小冬，舒健虹，于二汝，吳佳海，蔡一鳴，王小利*

(1.貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006；2.貴州省油料研究所，貴州 貴陽 550006)

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高羊茅在低氮脅迫下的蛋白組學分析

李小冬1，舒健虹1，于二汝2，吳佳海1，蔡一鳴1，王小利1*

(1.貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006；2.貴州省油料研究所，貴州 貴陽 550006)

摘要：為了研究高羊茅在低氮脅迫條件下的蛋白水平變化，我們采用iTRAP技術分析了氮脅迫30 d的高羊茅葉片中蛋白組學的變化。一共檢測到595個差異蛋白(295個上調(diào)，300個下調(diào))，分別參與了多個不同的代謝途徑。在高嚴謹篩選標準下，氮代謝、氧化還原反應以及脅迫相關代謝等多個途徑的基因被明顯上調(diào)表達。通過生理生化測定發(fā)現(xiàn)，葉綠素、可溶性蛋白以及游離氨基酸的含量顯著下降，而過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽合成酶(GS)等活性氧清除酶活性顯著升高。采用熒光定量PCR的方法驗證蛋白組學數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)所有挑選的基因都具有相同的變化趨勢。分析顯著富集的14-3-3基因家族的表達，發(fā)現(xiàn)其都能被低氮脅迫誘導，因此脅迫相關的基因可能是調(diào)節(jié)高羊茅抵抗多種不同逆境的關鍵基因。本文首次在高羊茅中采用蛋白組學的方法分析低氮脅迫條件下基因的表達變化，獲得重要候選基因，并對其應用進行了討論。

關鍵詞：高羊茅；低氮脅迫；蛋白組學；表達分析

非生物脅迫限制植物的生長發(fā)育與作物產(chǎn)量，植物主要通過兩種方式來抵御這些傷害：一種是形成抵抗能力強生理活性弱的成熟種子等特殊形態(tài)以躲避不利環(huán)境；二是通過激活一些可逆的調(diào)節(jié)機制(如抗逆基因的表達)增強植物本身的抵抗力[1-2]。耐低氮脅迫新品種的培育是減少農(nóng)作物生產(chǎn)投入成本的一個主要方面。研究植物在低氮脅迫條件下的分子響應機制將大大加快抗逆育種的進程。

通過轉(zhuǎn)錄組、蛋白組以及代謝組學等高通量生物信息學分析方法已經(jīng)成功鑒定出許多參與逆境反應的功能基因，它們參與了碳、氮以及油脂代謝等多個過程，在模式植物以及農(nóng)作物中，已經(jīng)成功發(fā)現(xiàn)了逆境脅迫調(diào)節(jié)過程中許多關鍵酶的功能[3]。蛋白質(zhì)是植物功能的體現(xiàn)者與執(zhí)行者，其調(diào)節(jié)植物的抗逆性不僅體現(xiàn)在改變酶的催化活性，而且部分可以作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)其他基因的表達。作為大分子物質(zhì)，蛋白質(zhì)能夠調(diào)節(jié)胞內(nèi)物質(zhì)的組成與濃度，進而影響植物的滲透壓等。因此，蛋白組的數(shù)據(jù)往往比轉(zhuǎn)錄組或者芯片分析的結果更可靠[4-5]。

前人對氮代謝的研究主要集中在對植物根系的影響。根系發(fā)育和根吸收氮元素的能力是影響植物對氮元素吸收能力的兩個主要因素。氮元素對植物發(fā)育也有重要影響：隨著氮素水平的增加，根系生物量和根系活力呈增加的趨勢，根系總量增加主要表現(xiàn)在側(cè)根數(shù)目明顯增多[6]；而在低氮條件下，植物也傾向于根系生長，但是在增加相同生物量的情況下，根莖比重值增大，而且不利于側(cè)根生長[7-8]，對大部分收獲籽實和營養(yǎng)體的農(nóng)作物不利。植物氮元素的代謝主要存在兩種機制：一種叫HATS (high affinity transport system)，是在低氮條件下植物啟動組成型和誘導型表達的功能基因促進氮元素吸收；另一種是LATS (low affinity transport system)，是在高氮條件下減緩植物吸收氮元素的機制[9-10]，因此，這些不同機制導致了農(nóng)作物不同品種對氮的吸收和利用具有顯著的差異，相關的研究在玉米(Zeamays)、油菜(Brassicacampestris)和小麥(Triticumaestivum)等農(nóng)作物中都有報道[10-13]。

氮元素吸收的分子模式在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中已經(jīng)有很好的研究成果，氮不僅是一種重要的礦物質(zhì)元素，而且還作為一種重要的外部信號調(diào)節(jié)氮代謝基因的表達[14-17]。氮元素作為生物體主要元素之一，其代謝過程往往與其他信號途徑互作。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)是有機酸代謝途徑的關鍵酶，有報道稱PEPC在12 mmol/L硝酸鹽處理2 h后表達顯著下調(diào)，另外淀粉合成的關鍵基因腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPS2)的表達同樣受硝酸鹽的抑制[18]。

在牧草類作物中，關于蛋白組學的研究在苜蓿(Medicagosativa)已經(jīng)有開展，但是在禾本科牧草中的報道還很少。本研究通過蛋白組學的方法分析高羊茅(Festucaarundinacea)在低氮脅迫條件下表達譜的變化，共檢測到595個差異蛋白，這些蛋白參與氮代謝、細胞氧化還原和逆境相關等多個不同的代謝途徑。生理生化測定發(fā)現(xiàn)，葉綠素、可溶性蛋白以及游離氨基酸的含量顯著下降，而過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽合成酶(GS)等酶活性在脅迫條件下顯著升高，并采用熒光定量PCR的方法對隨機挑選的候選基因進行了表達水平的分析。本研究為在禾本科牧草中研究氮代謝以及通過轉(zhuǎn)基因技術培育抗性種質(zhì)資源提供候選基因與技術儲備。

1材料與方法

1.1材料

本研究采用2005年貴州省草業(yè)研究所育成的國家牧草新品種黔草1號高羊茅(登記號：299)為試驗材料。本實驗Hoagland水培液所用的無機鹽均購自上海國藥公司，RNA提取試劑盒購自Axygen公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Scientific公司，熒光定量PCR試劑盒購自Promega公司。

1.2方法

1.2.1試驗材料的準備和非生物脅迫處理從新鮮收獲的黔草1號高羊茅中選取300粒飽滿的種子，用50℃溫水浸泡過夜，加50 mL 75%酒精攪動、浸泡30 s進行表面消毒，用100 mL無菌水沖洗3次。在培養(yǎng)皿底鋪墊2～3張滅菌濾紙，加入4～5 mL無菌蒸餾水，然后將消毒好的種子均勻點播于濾紙上，放入光照培養(yǎng)箱中發(fā)芽7 d，每天補加3～4 mL無菌水使濾紙保持濕潤，萌發(fā)后將幼苗放置在裝有Hoagland營養(yǎng)液的水培裝置中培養(yǎng)30 d進行低氮脅迫處理：將幼苗分別轉(zhuǎn)移到無氮水培液(低氮脅迫，營養(yǎng)液中NO3-被Cl-取代)和正常水培液中(對照，標準Hoagland營養(yǎng)液)進行生長處理，低氮脅迫15 d，每3 d更換1次營養(yǎng)液，同時為了縮小溫室內(nèi)微環(huán)境的影響，栽植盆進行定期旋轉(zhuǎn)。剪取脅迫與對照的高羊茅葉片，用液氮速凍，保存在-80℃的冰箱中待用。植株培養(yǎng)條件參考文獻[19]，具體為光照16 h，黑暗8 h，生長溫度22℃。

1.2.2蛋白酶解與iTRAQ標記蛋白酶解采用FASP程序，參照文獻[20]，打斷后的多肽采用4-plex/8-plex iTRAQ (applied biosystems)試劑進行標記，實驗程序參照試劑盒說明書。操作過程如下：將200 μg蛋白樣品溶解到30 μL STD緩沖液中(4% SDS，100 mmol/L DTT，150 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)。采用UA緩沖液(8 mol/L Urea尿素，150 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)進行超濾透析去除DTT和小分子量蛋白(30 kD)。然后加入100 μL 0.05 mol/L 碘乙酰胺到UA緩沖液中，黑暗條件孵育20 min用來封閉多肽殘基的C端。用100 μL UA緩沖液潤洗3次，然后用100 μL DS緩沖液[50 mmol/L三乙基碳酸氫銨(triethylammonium bicarbonate)， pH 8.5]潤洗2次。用40 μL DS緩沖液溶解，加入2 μg胰蛋白酶(promega，美國)37℃暗光條件下酶解過夜后收集起來備用。采用紫外分光的方法在280 nm利用消光系數(shù)計算蛋白濃度。將iTRAQ試劑融入70 μL 乙醇，加入待標記的樣品組織，標記完成后冷凍真空抽干備用。

1.2.3蛋白分離與色譜分析將iTRAQ標記好的蛋白利用通用電氣醫(yī)療集團生命科學部(GE Healthcare，美國)的AKTA蛋白自動純化系統(tǒng)進行純化。將標記好的多肽沖洗溶解于2 mL A緩沖液中(25% ACN中加入10 mmol/L KH2PO4，pH 2.7)，加入到 4.6×100 mm多聚磺乙基的分離柱中(5 μm，200 ?)(PolyLC，美國)。洗脫采用0%～10% B緩沖液(25% ACN中加入500 mmol/L KCl和10 mmol/L KH2PO4，pH 2.7)以1 mL/min 的流速洗脫2 min，10%～20% B 緩沖液洗脫25 min，20%～45% B 緩沖液洗脫5 min，50%～100% B 緩沖液洗脫5 min。每min的樣品都單獨收集，通過在214 nm條件下監(jiān)測吸光值，將相似的樣品混合最終形成10個樣品池進行脫鹽處理，每個樣品通過濃縮再溶解到40 μL 0.1%(v/v)三氟乙酸中保存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4液相質(zhì)譜分析將制備好的樣品上樣到nanoLC-MS/MS液相質(zhì)譜聯(lián)用分析儀中分析。具體過程如下：取10 μL(約5 μg)樣品溶液注射到 C18反相色譜柱(15 cm長，內(nèi)徑75 μm),內(nèi)部填充5 μm RP-C18 樹脂混合液A(0.1%甲酸)，洗脫時采用線性濃度的B緩沖液 (80% 氰化甲烷和0.1% 甲酸溶液)，以流速250 mL/min分離超過140 min。質(zhì)譜數(shù)據(jù)是根據(jù)掃描300～1800 m/z 范圍豐度最高的高能誘導解離(HCD)片段。

1.2.5數(shù)據(jù)庫比對分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用MASCOT和Proteome Discoverer 1.3軟件進行分析，差異蛋白的序列根據(jù)UniProtKB數(shù)據(jù)庫獲得，通過NCBI BLAST與SwissProt數(shù)據(jù)庫比對與功能注釋，閾值小于10-3的序列進行Blast2GO與 GO分析，閾值設為10-6。BLAST無結果的未注釋基因通過InterProScan3搜索EBI 數(shù)據(jù)庫獲取已知蛋白的模體,通過InterProScan GO進行注釋。代謝途徑分析通過比對KEGG數(shù)據(jù)庫。

1.2.6生理生化指標的測定用0.8 cm打孔器取低氮脅迫處理組和對照組的高羊茅葉片各10片，稱重后，加入5 mL 80% 丙酮溶液進行萃取，分別測定663,646以及470 nm下的吸光值，葉綠素a(Chl a)與葉綠素b(Chl b)的計算方法分別為：Chl a=12.21 OD663-2.81 OD646; Chl b=20.13 OD646-5.03 OD663，總?cè)~綠素(T Chl)為Chl a+Chl b。取100 mg處理組和對照組新鮮葉片，加液氮磨碎，加入1 mL提取緩沖液(甲醇∶水=1∶1)超聲處理30 min，13200 r/min，4℃離心10 min，上清液用來進行可溶性蛋白和游離氨基酸含量的測定，測定分析是由北京艾米諾醫(yī)藥研究公司分析完成，詳細操作程序參考文獻[21]。氧化還原酶活性采用試劑盒測定，稱取100 mg新鮮處理組和對照組的葉片，加1 mL預冷的PBS提取緩沖液，4℃，用研缽磨碎，超氧化物歧化酶(SOD)和谷氨酰胺合成酶(GS)分別采用試劑盒S0102和S0055(碧云天，北京)測定，過氧化物酶(POD)活性采用試劑盒A084-3 (南京建成)測定，測定過程均按照試劑盒說明書進行。

1.2.7高羊茅總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄PCR熒光定量分析RNA提取與反轉(zhuǎn)錄PCR參考文獻[22]，RNA提取采用TaKaRa RNAiso Reagent試劑盒，具體操作過程參照試劑盒說明書。RNA的反轉(zhuǎn)錄應用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit完成，用1 μL DNase處理RNA，每樣品取5 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體程序參照試劑盒說明書。應用熒光定量PCR技術驗證篩選的候選基因的表達變化。具體方法如下，將合成的cDNA稀釋20倍作為熒光定量PCR的模板。PCR的程序為：95℃ 5 min，95℃ 10 s，58℃ 10 s，72℃ 30 s，45個循環(huán)，72℃ 10 min，從65℃緩慢升溫到95℃，每0.5℃收集一次熒光信號用于制作溶解曲線，熒光定量引物利用在線軟件http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest設計，引物序列參照表1。試驗方法和程序參照文獻[20]，采用2-ΔΔct算法，每個樣品3個生物學重復，每個生物學重復3個技術重復。

表1　本實驗中使用的引物

1.3數(shù)據(jù)分析

采用Excel與PowerPoint完成實驗數(shù)據(jù)作圖及統(tǒng)計分析。

2結果與分析

2.1高羊茅蛋白組數(shù)據(jù)總體描述

我們采用了iTRAQ技術分析了高羊茅葉片在低氮脅迫條件下蛋白組的變化，在差異基因閾值設為>1.2倍或者<0.83倍，并且P<0.05情況下，我們共檢測到595個蛋白表達有顯著變化，其中有295個蛋白上調(diào)表達，300個基因下調(diào)表達，對所有氮脅迫誘導差異表達基因進行GO功能聚類(Gene Ontology database，http://geneontology.org)。在細胞組分聚類分析中，蛋白主要定位于細胞質(zhì)(77)、細胞器(61)、質(zhì)膜(25)(圖1A)；在生物過程聚類中參與最多的依次為代謝過程(58)、細胞過程(40)、單有機體過程(18)、逆境反應(13)等過程(圖1B)；在分子功能聚類分析中發(fā)現(xiàn)具有結合功能(51)和催化功能(45)的基因占據(jù)大部分(圖1C)。

2.2差異基因代謝途徑分析

高羊茅在低氮脅迫條件下，有幾個代謝途徑的基因呈現(xiàn)明顯的變化。其中氮代謝途徑的基因，在高嚴謹篩選條件下(表達差異倍數(shù)>1.5，或者<0.67)，共有10個蛋白(CL10359.Contig4_All、CL5776.Contig1_All、Unigene12843_All、CL5527.Contig1_All、CL8689.Contig1_All、CL8708.Contig2_All、Unigene9083_All、Unigene23702_All、CL11136.Contig1_All和CL340.Contig11_All)被上調(diào)1.52～2.24倍，另外5個蛋白(Unigene6516_All、Unigene23474_All、Unigene21261_All、Unigene42040_All和CL7688.Contig1_All)被下調(diào)了0.48～0.63倍(表2)。這些基因參與氮元素的吸收、固定、同化、轉(zhuǎn)運等多個過程。

在低氮脅迫條件下，植株不僅會出現(xiàn)生長緩慢、葉片變黃、分蘗數(shù)減少等顯著的表型變化，同時在生理生化上也有顯著差異。在研究中發(fā)現(xiàn)，嚴格篩選條件下，共有5個蛋白(Unigene24111_All、Unigene39854_All、CL784.Contig2_All、CL6318.Contig1_All和Unigene16350_All)的表達上調(diào)，有一個蛋白CL224.Contig5_All下調(diào)表達，這6個基因都參與了細胞內(nèi)氧化還原調(diào)節(jié)(表3)。

表2　氮代謝途徑的基因表達變化

圖1　高羊茅底單處理條件下差異蛋白的生物信息預測

圖中數(shù)字表示每個類別中包含的蛋白數(shù)目。The figures stand for the number of proteins contained in each categories.

表3　氧化還原反應途徑的基因表達變化

除了氮代謝以及氧化還原反應途徑外，脅迫相關的基因也有明顯的變化，在高嚴謹篩選條件下，共有15個蛋白顯著被誘導，只有1個蛋白的表達被抑制(表4)。在這些上調(diào)表達的基因中，高羊茅14-3-3家族蛋白如CL210.Contig4_All、CL210.Contig7_All、CL210.Contig2_All、Unigene6925_All在低氮脅迫條件下，其表達呈現(xiàn)整體被誘導的趨勢。具有一致變化趨勢的除14-3-3蛋白外，還有3個谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(CL468.Contig2_All、CL468.Contig1_All 和CL4631.Contig2_All)以及2個脅迫相關蛋白(CL11641.Contig1_All和CL3913.Contig3_All)。這些關鍵基因的上調(diào)表達說明其在高羊茅氮代謝過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。

表4　脅迫相關途徑的基因表達變化

2.3高羊茅在脅迫條件下生理生化的改變

為了驗證蛋白組學的結果，我們測定了低氮脅迫條件下，高羊茅葉片中葉綠素、可溶性蛋白、氨基酸等的含量，以及POD、SOD、GS等酶的活性。氮脅迫顯著降低了葉片中葉綠素的含量，在對照材料鮮葉中，葉綠素a、葉綠素b以及總?cè)~綠素含量依次為(1.45±0.12)，(0.67±0.11)和(2.12±0.22) mg/g(圖2A)。低氮脅迫條件下其含量分別降低到(0.80±0.16)，(0.48±0.08)和(1.28±0.22) mg/g，暗示低氮脅迫能夠顯著降低光合作用的效率(圖2A)。

與葉綠素含量變化類似，在低氮脅迫下，可溶性蛋白的含量也顯著降低了47%(圖2B)。在檢測的19種游離氨基酸中，只有色氨酸的含量增加4倍，而其余氨基酸含量下降了20%～80%(圖2C)。另外，低氮脅迫打破了細胞內(nèi)的氧化還原平衡，POD、T-SOD 和GS的活性被分別上調(diào)了1.43，2.07和1.78倍(圖2D)。這些生理生化水平的變化與蛋白組學中檢測到調(diào)節(jié)氮代謝以及氧化還原反應蛋白水平的變化可能存在密切的聯(lián)系。

圖2　氮脅迫條件下高羊茅生理生化變化Fig.2　Physiological and biochemical changes in tall fescue under low nitrogen condition 　Chl a：葉綠素a Chlorophyll a；Chl b：葉綠素b Chlorophyll b；T Chl：總?cè)~綠素Total chlorophyll；POD：過氧化物酶Peroxidase；T-SOD：總超氧化物歧化酶Total superoxide dismutase；GS：谷胱甘肽合成酶Glutathione synthetase.

圖3　熒光定量PCR驗證蛋白組數(shù)據(jù)

2.4熒光定量驗證蛋白組學數(shù)據(jù)及14-3-3基因表達分析

為了驗證蛋白數(shù)據(jù)的可靠性，我們隨機挑選了12個基因，采用熒光定量PCR方法分析其在低氮脅迫條件下的表達變化。包括3個上調(diào)表達的基因(Unigene18806、CL163.Contig2和Unigene14042)和8個下調(diào)的基因(CL1564.Contig1、CL7119.Contig2、CL3787.Contig1、CL10900.Contig1、Unigene18786、CL4924.Contig1、CL7743.Contig1和Unigene11547)。所有挑選的基因的表達變化趨勢與蛋白組相同。然而，蛋白差異篩選標準為大于1.2或者小于0.8的前提下，有4個基因(Unigene18806、CL163.Contig2、Unigene14042和Unigene11547)的熒光定量變化倍數(shù)小于2。說明這些基因在低氮脅迫條件下的表達只受到輕微的激活或抑制，或者最終的蛋白含量受到了轉(zhuǎn)錄后翻譯的影響。

上述挑選的上調(diào)表達基因定量PCR驗證結果，雖然具有和蛋白組數(shù)據(jù)相同的變化趨勢，但是其誘導的幅度并不大(小于2)，為了檢驗上調(diào)表達數(shù)據(jù)的可靠性，我們對14-3-3基因家族在低氮脅迫條件下的表達變化也進行了驗證。4個被檢測的14-3-3基因CL210.Contig4_All、CL210.Contig7_All、CL210.Contig2_All和Unigene6925_All分別命名為14-3-3A、14-3-3B、14-3-3C和14-3-3D，在低氮脅迫后4個基因都顯著被誘導2.7～11.3倍，說明蛋白組的數(shù)據(jù)是可信的。

3討論與結論

氮元素是限制植物生長發(fā)育的關鍵因素之一，和20世紀70年代相比，植物的產(chǎn)量已經(jīng)增長了一倍，其中氮肥是主要貢獻因素之一。然而氮肥的大量使用直接導致了植物氮利用效率的下降[23]。通過改良氮利用效率是減少氮肥使用的主要方法之一，植物對氮元素的吸收利用受到其自身的精細調(diào)控，通過調(diào)節(jié)基因的表達、關鍵酶活性以及代謝物的含量，可以改變植物應對不同氮營養(yǎng)水平的能力[24-25]。牧草類作物相對于其他農(nóng)作物受貧瘠土壤脅迫的危害更加嚴重，然而相應的理論研究還比較滯后。本文采用iTRAQ的方法鑒定高羊茅葉片在低氮脅迫條件下蛋白水平的變化，獲得了氮高效利用的候選基因，該研究在禾本科牧草類植物中處于領先地位，為在其他牧草類作物中開展類似研究提供了很好的借鑒作用。

在高羊茅低氮處理的蛋白組數(shù)據(jù)中，氮代謝途徑蛋白發(fā)生了明顯變化(表1)，相應的生理生化測定結果也表明低氮脅迫顯著降低了葉綠素含量、可溶性蛋白和游離氨基酸的水平(圖2A～C)，說明在低氮脅迫條件下，光合作用速率、蛋白質(zhì)的翻譯與合成等都受到顯著的影響。類似的研究在水稻(Oryzasativa)中也有報道，在低氮脅迫條件下，水稻氣體交換、光合效率、光合色素的含量、可溶性蛋白等都不同程度受到抑制[26]。另外在小麥低氮誘導的蛋白譜中同樣也發(fā)現(xiàn)了光合作用、氮代謝相關蛋白表達的變化[27]。

光合中心Ⅱ(PSⅡ)的活性在低氮條件下被減弱，進而會導致植物細胞體內(nèi)的活性氧化物質(zhì)的積累，出于對不利環(huán)境的應激反應，植物細胞會激活活性氧清除系統(tǒng)以保護自身不受傷害[28]。我們的研究發(fā)現(xiàn)低氮處理下，高羊茅體內(nèi)氧化還原代謝途徑的關鍵蛋白都明顯上調(diào)(表3)，通過測定相應酶的活性發(fā)現(xiàn)POD、SOD與GS活性都顯著增強(圖2D)，說明低氮脅迫間接地導致了植物細胞受到活性氧傷害在植物界中具有一定的普遍性。與其他植物一樣，在高羊茅中，低氮脅迫能夠激活活性氧清除系統(tǒng)。

低氮條件下，脅迫相關蛋白明顯誘導，他們分別具有不同的功能，定位于不同的亞細胞器，參與不同的代謝途徑。因此，低氮脅迫可能與其他脅迫存在廣泛的互作，而這些基因則可能具有調(diào)節(jié)植物多種抗性的功能。其中最顯著的是14-3-3蛋白，在前人研究中，14-3-3能夠調(diào)控植物對非生物脅迫(干旱、高溫、高鹽等)和生物脅迫(病蟲害)的應答[29]。在本研究中，我們一共發(fā)現(xiàn)了4個高羊茅14-3-3蛋白受低氮脅迫條件誘導(表4)，并且其表達水平也得到熒光定量PCR的驗證(圖3C)，說明14-3-3蛋白在高羊茅應對低氮脅迫的反應中可能起到至關重要的作用，為我們創(chuàng)制氮高效高羊茅新品種提供了重要的基因資源。

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Proteomic analysis of nitrogen stress-responsive proteins in the leaves of tall fescue

LI Xiao-Dong1, SHU Jian-Hong1, YU Er-Ru2, WU Jia-Hai1, CAI Yi-Ming1, WANG Xiao-Li1*

1.GuizhouInstituteofPrataculture,Guiyang550006,China; 2.GuizhouInstituteofOilCrops,Guiyang550006,China

Abstract:In order to thoroughly investigate the protein level changes of tall fescue in low-nitrogen conditions, we analyzed the proteome of the leaves from 30 day old plants exposed to low-nitrogen stress using the iTRAP technique. In total, 595 proteins were differentially accumulated (295 up-regulated and 300 down-regulated), which participated in diverse metabolic pathways. According to a strict selection standard, we discovered that the genes related to redox reactions and stresses significantly increased. Physiological and biochemical analysis revealed that the contents of chlorophyll, soluble proteins and free amino acid dramatically decreased, while reactive oxygen-scavenging enzymes such as POD, SOD and GS were highly active. The expression pattern of affected genes, detected by real-time fluorescence quantitative RT-PCR, coincided with the proteomic data. Notably, most of the 14-3-3 family of proteins were enriched by nitrogen shortage, suggesting that these involve the key genes that take part in diverse stresses in tall fescue. In this study, we provide proteomic information for tall fescue subjected to low-nitrogen availability. We also highlight some of the key genes involved and discuss their potential uses.

Key words:tall fescue; nitrogen stress; proteomic; gene expression

*通信作者

Corresponding author. E-mail: wangxiaolizhenyuan@126.com

作者簡介：李小冬(1984-)，男，湖南邵陽人，副研究員，博士。 E-mail: lixiaodongzl@163.com

基金項目：國家自然基金項目“高羊茅光周期調(diào)控基因FaCONSTANS特異性表達與生物學功能分析”(31360576)資助。

收稿日期：2015-09-29；改回日期：2015-11-16

DOI：10.11686/cyxb2015470

http://cyxb.lzu.edu.cn

李小冬,舒健虹,于二汝,吳佳海,蔡一鳴,王小利. 高羊茅在低氮脅迫下的蛋白組學分析. 草業(yè)學報, 2016, 25(3): 67-76.

LI Xiao-Dong, SHU Jian-Hong, YU Er-Ru, WU Jia-Hai, CAI Yi-Ming, WANG Xiao-Li. Proteomic analysis of nitrogen stress-responsive proteins in the leaves of tall fescue. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(3): 67-76.