秦賢杰，彭燕一，秦 程

靶向 PDGF受體-α的 RNA干擾對 RPE細胞增殖和凋亡的影響

秦賢杰，彭燕一，秦 程

目的探討針對血小板源性生長因子受體-α（PDGFR-α）的 RNA干 擾 對 體 外 培 養(yǎng) 的 人 視 網 膜 色 素 上 皮（hRPE）細胞增殖和凋亡的影響，為臨床治療增殖性玻璃體視網膜病變（PVR）提供實驗依據。方法利用脂質體將合成的 shRNA轉染體外培養(yǎng)的 hRPE細胞，MTT法檢測 hRPE細胞增殖活性；RT-PCR法檢測細胞中 PDGFR-αmRNA的表達；Western blot法 檢 測 PDGFR-α蛋 白 表 達 水 平；Hoechst 33258熒光染料核染分析細胞凋亡；流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡率。結果PDGFR-αshRNA作用 hRPE細胞 24～72 h后，細胞增 殖 明 顯 受 到 抑 制，呈 時 間 劑 量 效 應 （P＜0.05）；PDGFR-αshRNA作 用 hRPE細 胞 48 h后，實 驗 組PDGFR-α基因 mRNA和蛋白的表達水平較空白對照組及陰性對照組明顯降低（P＜0.05）；實驗組細胞的凋亡率分別為（37.10±0.55）%、（50.8±1.41）%，與空白對照組（11.7± 1.11）%及陰性對照組（13.5±1.05）%相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；實驗組 G1期細胞百分比分別為（64.76± 1.16）%、（75.64±0.93）%，與 空 白 對 照 組 （54.51± 1.40）%及陰性對照組（56.04±2.19）%相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論PDGFR-αshRNA能抑制 hRPE細胞的增殖并誘導其凋亡。

血小板源性生長因子受體-α；RNA干擾；視網膜色素上皮細胞；增殖；凋亡

增殖性玻璃體視網膜 病 變 （proliferative vitreoretinopathy，PVR）是指增生的纖維膜對視網膜神經上皮層前后面的收縮、牽拉所導致視網膜脫離、失明的一種疾病，視網膜色素上皮 （retinal pigment epithelium，RPE）細胞在纖維膜的形成、收縮過程中起著重要的作用［1］。血 小板 源 性 生 長 因 子 （platelet derived growth factor，PDGF）是機體內一種重要的促使細胞生長、分化的生長因子。研究［2］表明，PDGF對誘發(fā) RPE細胞的增殖、移行，最終導致 PVR的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用。玻璃體內許多非 PDGF家族的因子均可激活 PDGF受體（PDGFR），采用中和 PDGF的方法來治療 PVR所取得的效果并不理想。因此，阻斷 PDGFR通路是預防 PVR發(fā)生的基本路徑；PDGFR由亞單位 α和 β構成，而 PDGFR-α與 PVR的產生有著更強的相關性［3］。該實驗通過將 PDGFR-α shRNA 轉 染 至 hRPE細 胞 內，研 究PDGFR-αshRNA對 hRPE細胞增殖、凋亡的影響，為 PVR的臨床防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人視網膜色素上皮（human retinal pigment epithelium，hRPE）細胞（中山大學細胞庫）；澳洲胎牛血清、低糖型 DMEM 培養(yǎng)基（美國 Gibco公司）；脂質體 Lipofectamine 2000（美國 Invitrogen公司）；RT-PCR試劑盒 （北京天根生化科技有限公司）；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）；兔抗人 PDGFR-α多克隆抗體（美國圣克魯斯生物技術公司）；辣根酶標記山羊抗兔 lgG親合 純化（北 京中杉金橋 生 物 技術有限 公司）。本實驗所用質粒由武漢賽晶技術有限公司提供，其 正 義 鏈：5′-CTACTACTGTTATCAGTAATG-3′，反義鏈：5′-CATTACTGATAACAGTAGTAG-3′。

1.2 方法

1.2.1細胞的培養(yǎng) hRPE細胞采用含 10%胎牛血清的低糖 DMEM培養(yǎng)基在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 2～3 d用 0.25%的胰蛋白酶消化、傳代，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，取對數(shù)生長期細胞用于試驗。

1.2.2細胞轉染與試驗分組 0.25%胰酶消化處于對數(shù)生長期的細胞，用不含抗素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞 24 h后，細胞融合率達 60% ～70%時轉染，操作嚴格按照轉染試劑說明進行，轉染 6 h后換成無抗生素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞。通過預實驗優(yōu)化轉染條件得出：PDGFR-αshRNA質粒表達載體與脂質體的比例為1μg∶2.5μl時為最佳轉染比例，PDGFR-αshRNA作用細胞的最佳濃度為 2.0μg／m l。試驗分組：空白對照組（不含 shRNA和脂質體）、與靶細胞基因無同源性的陰性對照組（含 NC-shRNA和脂質體）、1.0μg／ml PDGFR-αshRNA組（含 1.0μg／m l shRNA和脂質體）、2.0μg／ml PDGFR-αshRNA組（含 2.0μg／ml shRNA和脂質體）。

1.2.3MTT法檢測細胞增殖活性 hRPE細胞經胰酶消化后計數(shù)，以 5×103個／孔的密度接種于 96孔板，每組 6孔；在 37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng) 24 h，細胞融合度達 60% ～70%時進行轉染；轉染后繼續(xù)分別培養(yǎng) 24、48、72 h，每孔加 5 g／L MTT溶液各20μl，放入培養(yǎng)箱中作用 4 h，吸棄孔內培養(yǎng)液。每孔加入 DMSO 150μl，搖床上輕搖 10 min后用酶標儀進行測試，在 490 nm波長處檢測吸光度（absorbance，A）值，計算細胞生長抑制率。

1.2.4RT-PCR法檢測 PDGFR-αmRNA的表達將對數(shù)生長期的細胞以 5×105個／孔的密度接種于6孔板，24 h后進行轉染，轉染后繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，采用 TRIzol法提取相應各組的總 RNA，按照試劑盒說明書進行逆轉錄反應，所得 cDNA用作 PCR反應模板。PDGFR-αF：5′-GCTCAAAATGAAGATGCTGTG-3′，R：5′-CCTCCACGGTACTCCTGTCT-3′，擴 增 產 物長度為 270 bp，PCR反應條件為 94℃預變性 5 min；94℃，30 s，52℃，30 s；72℃，1 min，共 35個循環(huán)，72℃延伸 5min；產物經 15 g／L瓊脂糖電泳檢測，拍照，結果用圖像處理儀分析處理，測定目的基因及內參的灰度值。

1.2.5Western blot檢測細胞中 PDGFR-α蛋白的表達 取轉染48 h的 hRPE細胞，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入細胞裂解液刮取細胞，并超聲裂解，蛋白定量，10%SDS-PAGE蛋白電泳、轉膜、牛奶封閉；加入一抗，4℃孵育過夜；加入二抗，室溫搖床孵育 2 h，ECL發(fā)光、曝片。

1.2.6Hoechst33258熒光核染分析細胞凋亡 采用胰酶消化 hRPE細胞，以每孔 5×105的密度接種至 6孔板，24 h后轉染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用 Hoechst33258熒光染料染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察、分析。

1.2.7流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡 取對數(shù)生長期細胞以每孔 5×105的密度接種至 6孔板，至60% ～70%融合時換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h，使細胞周期同步化，轉染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，消化、2 000 r／min離心 5 min并收集細胞，以預冷的 70%乙醇固定，4℃過夜，2 000 r／min離心 5 min后洗滌以PI染液重懸，用流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡。

1.3 統(tǒng)計學處理采用 SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行分析。本實驗測量的數(shù)據資料經W檢驗呈正態(tài)分布，計量資料以 ˉx±s表示；多組間的均數(shù)比較采用方差分析和 SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組hRPE細胞的形態(tài)學變化轉染 48 h后，空白對照組和陰性對照組細胞均生長狀態(tài)良好，細胞形態(tài)正常，胞質均勻，貼壁好，細胞數(shù)目多；1.0 μg／ml shRNA組細胞數(shù)量減少、間隙增大，出現(xiàn)脫壁、皺縮，甚至碎裂現(xiàn)象。與 1.0μg／m l shRNA組相比，2.0μg／ml shRNA組細胞數(shù)量明顯減少，死亡、漂浮、碎裂細胞明顯增多。見圖1。

2.2 PDGFR-αshRNA對hRPE細胞增殖的影響

圖1 倒置顯微鏡下各組 hRPE細胞的生長狀態(tài) ×200A：空白對照組；B：陰性對照組；C：1.0μg／m l shRNA組；D：2.0 μg／ml shRNA組

PDGFR-αshRNA分別作用于 hRPE細胞 24、48、 72 h，hRPE細胞的增殖均受到抑制，隨時間和劑量的增加而呈正相關性，差異有統(tǒng)計學意義（F= 238.95、224.38、1 228.75，P＜0.05）。見表 1。

表1 轉染 PDGFR-αshRNA后對 hRPE細胞生長抑制率的影響（n=3，ˉx±s）

2.3 hRPE細胞中PDGFR-αmRNA和蛋白的表達變化PDGFR-αshRNA作用 hRPE細胞 48 h后，PDGFR-αmRNA和蛋白在 RPE細胞中的表達隨shRNA作用濃度的增強呈降低趨勢，差異有統(tǒng)計學意義 （F=74.20、125.94，P＜0.05）。見 圖2、3，表2。

圖2 PDGFR-αmRNA表達

圖3 PDGFR-α蛋白表達1：空白對照組；2：陰性對照組；3：1.0μg／ml shRNA組；4：2.0 μg／ml shRNA組

表2 細胞內 PDGFR-α蛋白和 mRNA的表達（n=3，ˉx±s）

2.4 hRPE細胞凋亡的變化PDGFR-αshRNA處理 hRPE細胞 48 h，Hoechst33258染色后在倒置熒光顯微鏡下觀察，細胞核處出現(xiàn)致密濃染顆粒狀或團塊狀熒光的凋亡細胞隨用藥濃度的升高而增加，空白對照組及陰性對照組則出現(xiàn)較少。見圖4。

圖4 Hoechst33258染色觀察細胞凋亡 ×400A：空白對照組；B：陰性對照組；C：1.0μg／m l shRNA組；D：2.0 μg／ml shRNA組

2.5 PDGFR-αshRNA對細胞周期及凋亡的影響

PDGFR-αshRNA作用 hRPE細胞 48 h后，細胞周期各時相比例及總體凋亡率發(fā)生了顯著的變化，G1期細胞比例及凋亡率顯著增加，呈劑量效應，差異有統(tǒng)計學意義（F=125.49、927.55，P＜0.05）。見表3。

表3 不同濃度的 PDGFR-αshRNA對 hRPE細胞周期和凋亡率的影響（n=3，ˉx±s）

3 討論

PDGF是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的促有絲分裂生長因子，其可由多種細胞產生并分泌，可刺激特定細胞群的分裂與增殖。研究［4］證實，PDGF是 PVR形成過程中最重要的生長因子之一，PDGF能夠刺激 RPE細胞增生和遷移，還可以促進 RPE細胞表達 α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），α-SMA的表達又可刺激 RPE細胞的轉型，對 PVR的發(fā)生和發(fā)展起到重要作用［5］。

PVR的發(fā)生發(fā)展是多種細胞、體液因素之間相互作用的結果，RPE細胞不但是增殖膜形成和收縮的主要細胞，而且還可以產生趨化因子，吸引膠質細胞和成纖維細胞等參與增殖膜的形成［6］。Cassidy etal［7］發(fā)現(xiàn)，與單純患有 DR的患者比較，伴有 PVR患者 的 成 纖 維 生 長 因 子 （fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）和 PDGF水平均升高。梁勇 等［8］采用免疫電鏡雙標記法證實了 PVR增殖膜中 RPE細胞和神經膠質細胞是 PDGF的分泌細胞。RPE細胞可分泌PDGF，同時又含有 PDGF受體，在增生膜中 PDGF的自分泌及旁分泌作用機制對 PVR的發(fā)展起到重要作用［9］，因此，通過阻斷 PDGF受體通路來抑制RPE細胞的增殖對防治 PVR有著重要的意義。李林林 等［10］發(fā)現(xiàn)，抗 PDGFR-α抗體可以抑制鐵銹誘導的 hRPE細胞的增殖活性。在基因治療領域，有學者［11］利用反義寡核苷酸技術沉默 PDGFR-α的基因表達，發(fā)現(xiàn) PDGFR-αASODN可以顯著抑制 RPE細胞的增生，并能誘導其凋亡。蔣姣姣 等［12］通過動物實驗證實了 PDGFR-αASODN可以降低 PVR的發(fā)展程度，推測其可能與下調視網膜細胞中 PDGFR-α有關。

RNA干擾是近幾年發(fā)展起來的新興的基因阻斷技術，因其高特異性、高效性、低毒等優(yōu)點，已被廣泛應用 于 多 種 疾 病 的 治 療。 研 究［13］表 明 靶 向PDGF-A mRNA的 shRNA可以有效抑制 RPE細胞的增殖和移行，并能夠抑制 PVR的發(fā)生、發(fā)展。本研究首次將 PDGFR-αshRNA轉染至 hRPE，RT-PCR和 Westem blot檢測結果顯示 PDGFR-αshRNA能有效沉默 hRPE細胞中靶基因的表達，并且呈劑量效應。MTT檢測顯示細胞生長受到抑制，呈時間濃度依賴性，可能與本實驗沉默了 hRPE細胞中 PDGFR-α基因的表達，使靶細胞膜上相應的受體生成減少，阻斷了 PDGF的生物學作用，導致細胞增殖活性降低有關。本實驗應用 PDGFR-αshRNA沉默人 RPE細胞后，細胞周期發(fā)生了改變，S期、G2／M期比例顯著降低，G1期的比列顯著增加，細胞周期表現(xiàn)出 G1期阻滯，說明 PDGFR-αshRNA可將細胞阻滯于 G1期。G1期為細胞的 DNA合成前期，細胞阻滯于 G1期，其增殖受到抑制。本研究流式細胞儀及熒光核染結果觀察到，細胞凋亡率隨著藥物濃度的增加而升高，推測其凋亡機制可能為沉默 PDGFR-α基因表達阻斷了一系列細胞信號的激活，啟動了細胞的凋亡程序從而誘導了細胞的凋亡。

綜上所述，PDGFR-αshRNA轉染于 hRPE細胞后，可以有效的抑制 RPE細胞的增殖，促進細胞凋亡并將 RPE細胞阻滯于 G1期，為進一步應用 shRNA防治 PVR提供了實驗依據，PDGFR-αshRNA作用細胞的具體調控機制還有待于進一步深入的研究和探討。

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Effects of RNA interference targeting PDGF receptor-αon RPE cells proliferation and apoptosis

Qin Xianjie，Peng Yanyi，Qin Cheng
（Dept of Ophthalmology，Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541000）

Objective To investigate the effect of RNA interference targeting platelet-derived growth factor receptor-α（PDGFR-α）on hRPE cell proliferation and apoptosis in vitro，so thatexperimental evidence was provided for the clinical treatmentof proliferative vitreoretinopathy.Methods Retinal pigmentepithelium cellswere cultured in vitro，and shRNA which was chemically synthesized was transfected into hRPE cellmediated by cationic liposomes，the cell proliferation ability was detected by MTT；the expression of PDGFR-αmRNA of hRPE cells was detected by Reverse Transcription Polymerase Chain Response；the expression of PDGFR-αprotein was detected by Western blot；cell apoptosiswas analyzed by Hochest33258；the Flow Cytometrywas used to analyze the effectof cycle and apoptosis.Results PDGFR-αshRNA had effect on hRPE cells24～72 h，the proliferation of hRPE cellswere inhibited，and showed a time-dose response（P＜0.05）；after treated with PDGFR-αshRNA 48 h，the expression of mRNA and protein of PDGFR-αgene was significantly reduced compared with the control group and negative control group（P＜0.05）；the apoptosis rate of experimental group was（37.10±0.55）%，（50.8±1.41）%，compared with the blank control group（11.7±1.11）%and the negative control group（13.5±1.05）%，the difference was statistically significant（P＜0.05）；the percentage of G1 phase of experimental group was（64.76± 1.16）%，（75.64±0.93）%，compared with the blank control group（54.51±1.40）%and the negative control group（56.04±2.19）%，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion PDGFR-αshRNA can inhibit hRPE cells proliferation and induce apoptosis.

PDGF-αreceptor；RNA interference；retinal pigment epithelial cells；proliferation；apoptosis

R 774.1

A

1000-1492（2016）02-0180-05

時間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.014.htm l

2015-11-06接收

廣西自然科學基金項目（編號：KY2012021）；廣西科學實

驗中心開放課題項目（編號：KFJJ2011-11）

桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院眼科，桂林 541000

秦賢杰，男，碩士研究生；

彭燕一，女，主 任 醫(yī) 師，碩 士 生 導 師，責 任 作 者，E-mail：yypeng-7＠hotmail.com