劉 杰，杜怡斌，張 輝，李小波，王少斌，尹宗生

胸腺素 β4對大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞功能的影響

劉 杰1，杜怡斌1，張 輝1，李小波1，王少斌2，尹宗生1

目的觀察梯度濃度胸腺素 β4（Tβ4）對大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞（EPCs）生物學行為的影響。方法設置梯度濃度的 Tβ4分別處理 EPCs，同時在統(tǒng)一濃度下干預不同時間后進行細胞功能學實驗。采用 CCK-8細胞增殖試劑盒檢測靶細胞的增殖能力，Transwell細胞遷移檢測靶細胞遷移能力以及黏附能力。結(jié)果Tβ4能夠顯著增強體外培養(yǎng) EPCs的增殖、遷移和黏附能力，并且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，與對照組相比，在 1 000 ng／m l時其增殖、遷移及黏附能力均顯著增強（P＜0.05）。在 1 000 ng／m l時隨著干預時間的推移，各時間點的 EPCs增殖能力均顯著增強且優(yōu)于對照組（P＜0.05）；與對照組相比，黏附能力在 48 h達到最大效應（P＜0.05）。結(jié)論Tβ4可增強體外培養(yǎng)的 EPCs的功能，并且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，1 000 ng／m l Tβ4預處理 48 h可獲得最優(yōu)效應。

內(nèi)皮祖細胞；胸腺素 β4；增殖；遷移；黏附

內(nèi)皮 祖細胞 （endothelial progenitor cells，EPCs）是一種能夠分化為成熟內(nèi)皮細胞，有自我增殖、向缺血區(qū)域“歸巢”、促進內(nèi)皮修復及新生的潛能［1］。神經(jīng)損傷研究［1-2］顯示 EPCs能夠分泌多種細胞因子促進神經(jīng)生發(fā)，減輕炎癥反應。研究［3］表明 EPCs移植治療腦損傷能夠顯著減少神經(jīng)膠質(zhì)細胞生成，減輕炎癥反應，促進神經(jīng)功能恢復。然而 EPCs功能的不完整和數(shù)量的缺乏等問題嚴重制約著這一策略在脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）治療中的應用。胸腺素 β4（thymosin beta4，Tβ4）系由 43個氨基酸組成的高度保守的多肽［4］，能夠與 G肌動蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)其聚合反應，介導血管及神經(jīng)軸突再生、抑制炎癥反應等功能。研究［5］表明，Tβ4可增強多種干細胞的增殖、遷移及黏附、分化等功能。該實驗擬觀察 Tβ4對大鼠骨髓源性 EPCs增殖、遷移及黏附能力的影響，為后續(xù)實驗性的 EPCs移植治療 SCI提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級 SD大鼠 90～100 g，雌雄不限，購自安徽省實驗動物中心。

1.2 主要儀器及試劑CD133抗體、VEGFR-2抗體購自美國 Biorbyt公司；Dil標記的乙?；兔芏戎鞍祝―il-ac-LDL）購自美國 Invitrogen公司；異硫氰酸熒光素荊豆凝集素-1（FITC-UEA-1）購自美國Sigma公司；Transwell（孔徑為 8μm）購自美國 Corning公司；重組胸腺肽 β-4（Recombinant）購自美國Peprotech公司；EGM-2完全培養(yǎng)基購自瑞士 Lonza公司；鼠纖維連接蛋白（Rat FN）購自瑞士 Gene Operation公司；大鼠淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司；免疫熒光二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；CCK-8細胞增殖試劑盒（Cell Counting Kit）購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1EPCs的分離、培養(yǎng)及鑒定

1.3.1.1EPCs的分離及 培養(yǎng) 參照 文獻［1，6］方法，脫頸椎處死大鼠，無菌條件下取出完整的雙下肢股骨及脛骨，暴露骨髓腔并用 F液反復沖洗，收集后以 1 800 r／min離心 20 min，棄上清液，5 m l F液 1 800 r／min離心 20 min。另取一無菌離心管量取 C液 5 ml，將上述離心所得液體棄上清液，以 5 m l全血組織稀釋液重懸后逐滴緩慢滴加于上述C液之上，1 500 r／min，離心 25 min（第 20 min時關(guān)閉電源待其自然靜止）。小心吸取單個核細胞層，細胞洗滌液洗滌 2次，EGM-2完全培養(yǎng)基重懸并計數(shù)，接種于預先以 FN（10μg／ml）包被的 24孔板中，37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)，48 h后首次換液棄上清液祛除未貼壁細胞，隔3 d換液1次，細胞融合達90%以上即可傳代。

1.3.1.2EPCs免疫細胞化學 CD133及 VEGFR-2雙抗體熒光檢測 參考文獻［1，6］方法，取細胞融合達到 90%以上的 EPCs，PBS漂洗 3遍，免疫染色固定液固定 20 min；PBS漂洗，0.3%TritonX-100破膜10 min；PBS漂洗，10%山羊血清封閉 1 h；PBS漂洗，加入 CD133（1∶100）及 VEGFR-2（1∶100）一抗，4℃冰箱過夜；PBS漂洗，滴加相對應二抗（1∶100），37℃避光孵育 1 h；PBS漂洗，加入終濃度 10 μg／ml Hoechst33342核染 5 min；PBS漂洗，抗熒光淬滅液封片，免疫熒光倒置顯微鏡觀察。

1.3.1.3EPCs的 FITC-UEA-1和 Dil-ac-LDL熒光檢測 參考文獻［1，6］方法，取細胞融合達到 90%以上的 EPCs，PBS漂洗，加入 10μg／m l的 Dil-ac-LDL，37℃避光孵育 4 h；PBS漂洗，免疫染色固定液固定20 min；PBS漂洗，加入 10μg／ml的 FITC-UEA-1，37℃避光孵育 1 h；PBS漂洗，抗熒光淬滅液封片，免疫熒光倒置顯微鏡觀察。

1.3.2EPCs體外細胞功能學實驗分組 Tβ4梯度濃度組：終濃度分別為 1 000 ng／ml（T1000）、100 ng／m l（T100）、10 ng／m l（T10）、1 ng／m l（T1）的條件培養(yǎng)基；對照組：含 10%胎牛血清的 EGM-2完全培養(yǎng)基（T0）。

1.3.3CCK-8法測定 EPCs增殖能力 參考文獻［7］方法，取原代培養(yǎng) 7 d的細胞，0.25%胰蛋白酶消化收集貼壁細胞，EGM-2完全培養(yǎng)基重懸并計數(shù)，以 1×105個／m l的密度接種于預先以 FN包被的 96孔板，每孔 100μl，37℃溫箱過夜使細胞貼壁。加入梯度濃度的 Tβ4條件培養(yǎng)基（分組見前述）干預 24 h，每組設 6個復孔，并設置對照組（完全培養(yǎng)基和細胞）和空白組（完全培養(yǎng)基）。溫箱孵育 24 h，每孔加入 10μl CCK-8繼續(xù)孵育 4 h后肉眼觀察顯色程度，并用酶標儀檢測450 nm處的光密度（optical delnsity，OD）值。參考文獻［7-8］方法，消化收集細胞同上，1×105個／ml的密度接種于預先以FN包被的 96孔板，每孔 100μl，37℃溫箱過夜使細胞貼壁。加入含 1 000 ng／ml Tβ4條件培養(yǎng)基分別干預 24、48、72 h，每組設 6個復孔，并設置對照組和空白組。溫箱孵育，每孔加入 10μl CCK-8繼續(xù)孵育4 h后肉眼觀察顯色程度，并用酶標儀檢測450 nm處的 OD值。

1.3.4EPCs遷移實驗 參考文獻［9］方法，消化收集細胞并調(diào)整濃度 5×105個／ml備用，將梯度濃度的 Tβ4條件培養(yǎng)基加入 Transwell的下室（600μl／孔），100μl細胞懸液加入 Transwell的上室，然后將上室小心地掛入已加培養(yǎng)液的下室，溫箱培育 6 h。小心刮除濾膜內(nèi)面未遷移的細胞，免疫染色固定液固定 20 min，加入終濃度 10μg／ml Hoechst33342核染 5 min，PBS漂洗，免疫熒光倒置顯微鏡觀察并計數(shù)遷移到濾膜外面的細胞。

1.3.5EPCs黏附能力 參考文獻［8］方法，培養(yǎng)第7天時加入梯度濃度的 Tβ4條件培養(yǎng)基繼續(xù)干預24 h，消化收集貼壁細胞并計數(shù)。接種相同數(shù)目的EPCs于預先包被的培養(yǎng)板中，溫箱培育 30 min，洗去未貼壁細胞，倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)。參考文獻［8］方法，于末次換液時加入含 1 000 ng／ml Tβ4條件培養(yǎng)基分別干預 24、48、72 h，消化收集貼壁細胞并計數(shù)。接種相同數(shù)目的 EPCs于預先包被的培養(yǎng)板中，溫箱培育 30 min，洗去未貼壁細胞，倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學處理采用 SPSS 13.0軟件進行分析，計量資料以 ˉx±s表示，各組間比較采用 ANOVA檢驗，兩兩比較采用 SNK法檢驗，檢驗水準 α=0.05。各組實驗重復3～5次。

2 結(jié)果

2.1 EPCs的培養(yǎng)及鑒定原代分離的單個核細胞呈圓形，體積較小，約 7 d呈紡錘樣，條索狀排列生長的內(nèi)皮樣細胞形態(tài)特征；收集生長良好的第2代 EPCs行 CD133和 VEGFR-2雙抗體熒光染色以及結(jié)合 FITC-UEA-1和攝取 Dil-ac-LDL熒 光檢測，可見目的細胞 CD133和 VEGFR-2抗原表達陽性，結(jié)合 FITC-UEA-1和攝取 Dil-ac-LDL表達陽性（圖1），表明目的細胞為典型的 EPCs。

2.2 Tβ4對骨髓源性EPCs增殖活性的影響

2.2.1CCK-8法檢測梯度 Tβ4對骨髓源性 EPCs增殖活性的影響 方差分析結(jié)果顯示，與對照組相比，Tβ4能夠顯著增強骨髓源性 EPCs的活性（F= 49.96，P＜0.01），呈一定的劑量效應關(guān)系，兩兩比較結(jié)果顯示在 1 ng／ml Tβ4作用時與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義［（0.31±0.14）vs（0.30±0.12）］；與對照組相比，在 1 000 ng／ml Tβ4時作用最為顯著（0.40±0.13 vs0.30±0.12，P＜0.05）。見圖2。

2.2.2CCK-8法檢測不同時間點 Tβ4（1 000 ng／m l）對骨髓源性 EPCs增殖活性的影響 結(jié)果顯示在 1 000 ng／ml Tβ4條件培養(yǎng)基下隨著培養(yǎng)時間的延長，實驗組與對照組 EPCs增殖能力均增強，且各時間點實驗組均明顯優(yōu)于對照組。與對照組相比，在 72 h達到最大效應（0.53±0.19 vs0.39±0.23，P＜0.05）。見圖3。

圖1 EPCs形態(tài)學鑒定A：原代培養(yǎng) EPCs7 d紡錘形分化貼于孔底 ×100；B：Hoechst33342細胞核染，陽性 ×100；C：TRITC標記的 CD133染色，陽性 ×100；D：FITC標記的 VEGFR-2染色，陽性 ×100；E：結(jié)合 FITC-UEA-1能力，陽性 ×200；F：攝取 Dil-ac-LDL能力，陽性 ×200

圖2 梯度濃度 Tβ4處理 EPCs與對照組比較：*P＜0.05

圖3 Tβ4（1 000 ng／m l）不同時 長處 理 EPCs與對照組比較：*P＜0.05

2.3 Transwell法檢測Tβ4對骨髓源性EPCs遷移能力的影響方差分析結(jié)果顯示，與對照組相比，Tβ4能夠顯著增強骨髓源性 EPCs的遷移活性（F= 156.42，P＜0.05），且呈一定的劑量效應關(guān)系，兩兩比較結(jié)果顯示各組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義，且在 1 000 ng／ml Tβ4時作用最為顯著［（74.44 ±9.32）vs（13.11±4.01），P＜0.01］。見圖4、5。

圖4 Hoechst33342核染 ×100A：對照組隨機選取一個視野下的遷移細胞；B：T1000組隨機選取一個視野下的遷移細胞

圖5 梯度濃度 Tβ4處理下 EPCs遷移能力與對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

2.4 梯度濃度Tβ4干預24 h對骨髓源性EPCs黏附能力的影響方差分析結(jié)果顯，與對照組相比，Tβ-4能夠顯著增強骨髓源性 EPCs的黏附活性（F =111.74，P＜0.05），且呈一定的劑量效應關(guān)系，兩兩比較結(jié)果顯示各組與對照組相比均有統(tǒng)計學差異，與對照組相比，在 1 000 ng／ml Tβ-4時作用最為顯著（42.00±6.64 vs17.38±2.89，P＜0.01）。見圖6、7。

圖6 Hoechst33342核染 ×100A：對照組隨機選取一個視野下的黏附細胞；B：T1000組隨機選取一個視野下的黏附細胞

圖7 梯度濃度 Tβ4處理下 EPCs黏附能力對比 ×100與對照組比較：*P＜0.05

2.5 不同時間點Tβ4（1 000 ng／m l）對骨髓源性EPCs黏附能力的影響在1 000 ng／ml Tβ4條件培養(yǎng)基下隨著干預時間的增加，EPCs的黏附能力表現(xiàn)為先增高后減低，48 h作用最為顯著，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義［（50.04±5.38）vs（29.92± 4.37），P＜0.05］。見圖8。

3 討論

圖8 不同 時間 點 Tβ4（1 000 ng／m l）對骨髓源性EPCs黏附能力的影響 ×100與對照組比較：*P＜0.05

NSC移植治療 SCI一直以來都是研究的熱點，然而，大量實踐表明移植的 NSC大部分分化為星形膠質(zhì)細胞參與瘢痕形成，神經(jīng)元生發(fā)的比例很低［10］。隨著研究的深入，有學者［11］發(fā)現(xiàn)，脊髓本身含有一定數(shù)目的 NSC（內(nèi)源性 NSC）。它規(guī)避了外源性NSC所面臨的諸如來源受限、倫理學問題及免疫排異反應等多種應用難題，成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復天然“原材料”的最佳來源，其重要性正被越來越多的專家學者所正視。最新研究［12］表明 NSC移植治療 SCI是通過改變局部微環(huán)境，通過對內(nèi)源性 NSC的“移植性誘導神經(jīng)生發(fā)”作用，促進損傷部位神經(jīng)功能的重建。就本質(zhì)而言即移植的外源性NSC通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子及發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)等作用，創(chuàng)造無數(shù)個“熱點區(qū)域”，富集周圍的內(nèi)源性NSC并使之活化，協(xié)同增強神經(jīng)組織的再生修復能力?？梢?，這種“內(nèi)生外源性微環(huán)境”的改變對 NSC的定向分化至關(guān)重要。

EPCs系一群能夠增殖分化為幼稚內(nèi)皮細胞的前體細胞，它能夠向缺血區(qū)域定向“歸巢”，有明顯促進血管內(nèi)皮新生及修復的作用。研究［13］表明在急性心梗等實驗模型中，通過輸注 EPCs可促進缺血部位血運重建、改善左室功能和延緩動脈粥樣硬化進程。腦損傷的研究［5，14］表明神經(jīng)生發(fā)往往于血管生發(fā)之后，血管生發(fā)為神經(jīng)生發(fā)提供了良好的支持與輔助，二者相輔相成，它們所處的環(huán)境稱為神經(jīng)血管微環(huán)境。EPCs經(jīng)靜脈輸注后在損傷部位聚集并分化為血管內(nèi)皮細胞，參與構(gòu)建新生血管，大大改善了受損部位的局部微環(huán)境，不僅稀釋了炎癥反應所產(chǎn)生的大量抑制神經(jīng)干細胞分化的炎性介質(zhì)，減輕炎癥反應，同時 EPCs能夠分泌諸如血管內(nèi)皮生長因子等細胞因子協(xié)同 NSC的增殖和分化，表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)保護作用。然而上述功能的執(zhí)行，有賴于 EPCs功能的完整和數(shù)目的完備，因而，增強EPCs的生物學效應顯得尤為重要。

目前發(fā)現(xiàn)，諸多細胞因子、激素及藥物等［14］都能夠參與動員 EPCs、增強其生物學效應的。Tβ4作為一種多功能多肽，介導多種生物學效應諸如血管及神經(jīng)軸突再生、傷口愈合和抑制炎癥反應等功能。Morrisetal［15］報道了 Tβ4能夠通過動員少突膠質(zhì)細胞生成髓鞘的方式促進腦卒中大鼠神經(jīng)功能的恢復，同時伴隨著微血管密度的增加。

本研究顯示外源性 Tβ4能夠增強骨髓源性EPCs的多種生物學活性。目前，在 EPCs移植中所面臨的一個突出的問題即是數(shù)目的不足，因而移植到損傷局部的 EPCs無法發(fā)揮應有的生物學效應，本研究表明梯度濃度的 Tβ4對 EPCs的增殖能力有明顯的促進作用，且與作用濃度及作用時間呈正相關(guān)，1 000 ng／ml作用時間 72 h取得最大效應，這與EPCs傳代的初期 1～2 d表現(xiàn)為明顯的“潛伏抑制”狀態(tài)，而3～4 d進入指數(shù)增長期的生長曲線相符。此外 EPCs有向缺血區(qū)域遷移“歸巢”的能力，其功能的行使有賴于黏附和遷移能力，本實驗表明梯度濃度的 Tβ4對 EPCs的黏附及遷移有明顯的促進作用，與作用濃度呈正相關(guān)。黏附能力的實驗顯示，隨著作用時間的推移，Tβ4對其黏附能力表現(xiàn)為先促進后抑制的效應，1 000 ng／ml作用 48 h達到最大效應。

綜上所述，Tβ4能夠增強骨髓源性 EPCs的多種生物學活性諸如增殖、黏附和遷移的能力，而這些功能直接影響 EPCs向損傷部位 “歸巢”、促進血管新生、改善局部微環(huán)境及協(xié)同促進神經(jīng)功能恢復的作用。因此，本研究進一步認識了 Tβ4的生物學效應，并通過 Tβ4干預增強 EPCs的功能，從而改善EPCs移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷這一策略的有效性，為推動 EPCs移植為主體的治療手段在臨床中的應用提供更為廣泛的思路。

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Effects of thymosin beta4 on activity of bonemarrow-derived endothelial progenitor cells

Liu Jie，Du Yibin，Zhang Hui，et al
（Dept of Orthopedics，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230032）

Objective To investigate the effects of thymosin beta4（Tβ4）on biological behaviors of bonemarrow-derived endothelial progenitor cells（EPCs）.Methods First，EPCswere stimulated by Tβ4 with different concentration gradients，then processed by Tβ4 with the same concentration for gradient time.The capacities of proliferation，migration and adhesion were determined by CCK-8 assay，Transwellmigration assay and adhesion assay respectively.Results We found Tβ4 could significantly enhance the proliferative，migratory and adhesive capacities of EPCs，the effects of experimentgroup were significantwith the concentration of1 000 ng／m lwhen compared with the control group（P＜0.05）.As time went by，the proliferative capacity of experiment group was better than the control group ateach time point（P＜0.05）；the adhesive capacity was themost significantat the time pointof48 h when compared with the control group（P＜0.05）.Conclusion These results suggest that Tβ4 can increase the proliferative，migratory and adhesive capacities of EPCs，preprocessing with Tβ4（1 000 ng／ml）for 48 h can obtain the optimal effect.

endothelial progenitor cells；thymosinβ4；proliferation；migration；adhesion

R 681.54

A

1000-1492（2016）02-0166-06

時間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.008.htm l

2015-11-11接收

國家自然科學基金（編號：81171173）；安徽省自然科學基金（編號：11040606Q25）

1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)與骨腫瘤科，合肥230032

2安徽醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院骨科，合肥 230032

劉 杰，男，碩士研究生；

尹宗生，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：yinzongsheng1961＠126.com