郭玉娟，謝園園，儲(chǔ)德勇，徐元宏，沈繼龍，

Ⅱ型弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)重疊感染對(duì)小鼠肝纖維化作用的實(shí)驗(yàn)研究

郭玉娟1，2，謝園園1，儲(chǔ)德勇1，徐元宏3，沈繼龍1，3

目的觀察Ⅱ型弓形蟲(chóng)和日本血吸蟲(chóng)重疊感染對(duì)小鼠肝纖維化的影響，探討弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的抗感染免疫對(duì)血吸蟲(chóng)感染致小鼠肝臟纖維化的免疫調(diào)節(jié)作用。方法BALB／c小鼠建立重疊感染模型：預(yù)先感染血吸蟲(chóng)（模型Ⅰ組）；預(yù)先感染 PRU株弓形蟲(chóng)（模型Ⅱ組）；對(duì)照：只感染尾蚴組和正常對(duì)照組。取上述小鼠血液及肝臟，HE和 Masson膠原纖維染色法觀察肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫大小和肝纖維化面積；檢測(cè)纖維化指標(biāo)透明質(zhì)酸（HA）和肝臟羥脯氨酸（HYP）含量。結(jié)果模型Ⅰ組小鼠肝臟病理及纖維化指標(biāo)檢測(cè)與相應(yīng)對(duì)照組未見(jiàn)顯著差異；模型Ⅱ組動(dòng)物血清 HA和肝臟 HYP顯著低于相應(yīng)對(duì)照組（P＜0.001），肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫大小和纖維化面積均顯著減?。≒＜0.001）。結(jié)論預(yù)先感染Ⅱ型弓形蟲(chóng)可能誘導(dǎo)機(jī)體的 Th1型應(yīng)答的偏移，在此微環(huán)境下可負(fù)向調(diào)控血吸蟲(chóng)肝臟纖維化狀態(tài)的 Th2應(yīng)答，從而延緩和減弱肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。

Ⅱ型弓形蟲(chóng)；日本血吸蟲(chóng)；雙重感染；肝纖維化

日本血吸蟲(chóng)病主要由沉積于組織的蟲(chóng)卵內(nèi)活毛蚴分泌 的 可 溶 性 蟲(chóng) 卵 抗 原 （soluble egg antigens，SEAs）引起的免疫性疾?。?］。在血吸蟲(chóng)感染感染后4～6周，機(jī)體以 Th1免疫反應(yīng)為主；在感染后 6～8周蟲(chóng)卵成熟后，其分泌的 SEA抗原促使 Th2免疫反應(yīng)加強(qiáng)［1］。最終因促纖維生成和溶解因素不平衡而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）大量沉積［2］，從而繼發(fā)肝纖維化和肝硬化。剛地弓形蟲(chóng)是一種專性有核細(xì)胞內(nèi)寄生的機(jī)會(huì)致病性的原蟲(chóng)，血清學(xué)調(diào)查顯示，全球約 30%的人口均有不同程度感染，歐美國(guó)家感染率更高［3］。弓形蟲(chóng)感染后，在機(jī)體的固有免疫后，機(jī)體以持續(xù)的 Th1免疫反應(yīng)為主［4］。感染血吸蟲(chóng)和弓形蟲(chóng)可以介導(dǎo)宿主產(chǎn)生不同的免疫反應(yīng)，建立重疊感染的小鼠模型，觀察先感染血吸蟲(chóng)再感染弓形蟲(chóng)以及先感染弓形蟲(chóng)再感染血吸蟲(chóng)，是否可以導(dǎo)致宿主免疫調(diào)節(jié)狀態(tài)發(fā)生改變，并觀察能否最終減弱日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化程度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及釘螺SPF級(jí) BALB／c小鼠，雌性6～8周齡，18～20 g，室溫 20～22℃，標(biāo)準(zhǔn)飼料及普通自來(lái)水喂養(yǎng)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴的陽(yáng)性釘螺，購(gòu)自江蘇省血吸蟲(chóng)病防治研究所。

1.2Ⅱ型弓形蟲(chóng)包囊本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期在小鼠內(nèi)傳代保存的 typeⅡ 型 PRU株 弓 形蟲(chóng)。取口服感 染PRU包囊30 d以上的小鼠，麻醉后無(wú)痛處死，酒精消毒后，取出腦組織；將腦組織勻漿，涂片計(jì)數(shù)包囊備用。

1.3 試劑羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；Masson染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；甲醛和無(wú)水乙醇（上海化學(xué)試劑公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器Minispin小型離心機(jī)和臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó) Eppendorf）；電子天平（上海天平儀器廠）；隔水式電熱培養(yǎng)箱（江蘇東臺(tái)縣電器廠）；超聲細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波科聲儀器廠）；光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組取小鼠84只，隨機(jī)分成 7組，建立模型Ⅰ和模型Ⅱ重疊感染模型，并設(shè)置對(duì)照。模型Ⅰ組：預(yù)先感染血吸蟲(chóng)，感染血吸蟲(chóng)尾蚴后 16周處死，1%水合氯醛麻醉小鼠后固定，腹部剃毛。尾蚴置玻片計(jì)數(shù)（15±2）條，貼于小鼠腹部 15 min。分為Ⅰ1組（預(yù)先感染尾蚴后 42 d灌胃包囊）、Ⅰ2組（預(yù)先感染尾蚴后 56 d灌胃包囊）、Ⅰ3組（尾蚴感染組）、Ⅰ4組（正常鼠對(duì)照）。模型Ⅱ組：預(yù)先感染弓形蟲(chóng)，感染血吸蟲(chóng)尾蚴后 8周處死，小鼠預(yù)先灌胃PRU包囊10個(gè)，再感染血吸蟲(chóng)尾蚴（15±2）條。分為Ⅱ1組（口服包囊后35 d感染尾蚴）；Ⅱ2組（僅感染尾蚴組）、Ⅱ3組（正常小鼠對(duì)照）。

1.6 HA水平測(cè)定摘取眼球法收集血液于 1.5 m l EP管，37℃ 孵育 30 min，4 000 r／min離 心 10 min，收集血清。ELISA法檢測(cè)血清 HA水平，按試劑盒說(shuō)明操作。

1.7 HYP含量測(cè)定稱取小鼠肝臟組織 0.1 g，按HYP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)量肝組織中 HYP含量。

1.8 病理學(xué)檢查

1.8.1病理組織學(xué)觀察 取每只小鼠相同部位的肝臟組織，4%中性甲醛固定后石蠟包埋，3μm連續(xù)切片，貼附于經(jīng)10%多聚賴氨酸防脫片劑預(yù)處理的載玻片上。常規(guī)脫蠟，HE染色，脫水、透明、封固。光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理變化及測(cè)量肉芽腫大小。同等設(shè)置條件下拍照，并利用 Image-Pro Plus軟件計(jì)算肉芽腫面積，統(tǒng)計(jì)分析。

1.8.2膠原纖維染色分析 Masson膠原纖維染色石蠟切片常規(guī)脫蠟，Masson復(fù)合液 5 min，0.2%醋酸水溶液輕輕洗；5%磷鎢酸 5～10 min，0.2%醋酸水溶液洗兩次；苯胺藍(lán)染色液 5 min，0.2%醋酸水溶液洗 2次。脫水、透明、中性樹(shù)脂封固。觀察膠原沉積情況并判斷肝纖維化程度，同等設(shè)置條件下拍照，并利用 Image-Pro Plus軟件計(jì)算每張圖片纖維化面積，統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用 ˉx±s表示；兩兩比較采用 t檢驗(yàn)，多組之間兩兩比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的存活率統(tǒng)計(jì)與對(duì)照組相比，模型Ⅰ的3個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠存活率有差異。重疊感染提高了小鼠的死亡率，后期存活的動(dòng)物出現(xiàn)豎毛、怠動(dòng)、發(fā)抖、厭食和消瘦等現(xiàn)象明顯；模型Ⅱ的2個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠存活率無(wú)顯著差異，后期存活的小鼠精神狀態(tài)和飲食情況一般。各組小鼠的存活率分別為Ⅰ1組33.3%；Ⅰ2組 41.7%；Ⅰ3組 66.7%；Ⅱ1組 41.7%；Ⅱ2組 50%；正常對(duì)照組Ⅰ4組和Ⅱ3組 100%。見(jiàn)圖1。

2.2 肝組織病理學(xué)變化模型Ⅰ的 3組實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟表面布滿大量大小不一的肉芽腫結(jié)節(jié)，質(zhì)地較硬，肝臟顏色呈深黑褐色，相比于正常肝臟體積縮小。鏡下見(jiàn)大量蟲(chóng)卵肉芽腫。肉芽腫周圍及匯管區(qū)有明顯橋樣結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)大量結(jié)節(jié)形成，出現(xiàn)肝硬化表現(xiàn)。HE染色結(jié)果顯示3組小鼠之間肉芽腫大小差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Levene=0.911，F(xiàn)=0.012），Masson染色結(jié)果顯示 3組小鼠之間纖維化面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Levene=0.206，F(xiàn)=0.192），見(jiàn)圖2、3。模型Ⅱ的2組實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟表面布滿大量大小不一的顆粒，質(zhì)地相對(duì)于模型Ⅰ要軟，肝臟顏色灰褐色，相比于正常肝臟體積增大。鏡下見(jiàn)大量蟲(chóng)卵肉芽腫，肉芽腫及匯管區(qū)纖維增生明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。但鏡下觀察可明顯發(fā)現(xiàn)模型Ⅱ的組Ⅱ1小鼠相比于組Ⅱ2蟲(chóng)卵肉芽腫減少，纖維化程度降低，見(jiàn)圖4、5。模型Ⅱ兩組小鼠 HE染色顯示，Ⅱ1組相比于Ⅱ2組小鼠蟲(chóng)卵肉芽腫減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.065，P＜0.001）；Masson染色顯示Ⅱ1組相比于Ⅱ2小鼠纖維化面積減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（F =5.110，P＜0.001）。

2.3 血清HA水平、肝HYP含量模型Ⅱ各組血清 HA水平、肝 HYP含量見(jiàn)圖6。模型Ⅱ?qū)嶒?yàn)組小鼠Ⅱ1血清 HA水平（F=3.217，P＜0.001）、肝HYP（F=0.451，P＜0.001）含量均顯著低于Ⅱ2。

圖1 各組小鼠存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果A：模型Ⅰ組；B：模型Ⅱ組

圖2 模型Ⅰ組小鼠肝臟肉芽腫病理圖 HE×100A：Ⅰ1組；B：Ⅰ2組；C：Ⅰ3組；D：Ⅰ4組

圖3 模型Ⅰ組小鼠肝臟纖維化病理圖 Masson×100A：Ⅰ1組；B：Ⅰ2組；C：Ⅰ3組；D：Ⅰ4組

圖4 模型Ⅱ組小鼠肝臟肉芽腫病理圖 HE×100A：Ⅱ1組；B：Ⅱ2組；C：Ⅱ3組；與Ⅱ2組比較：***P＜0.001

3 討論

血吸蟲(chóng)病肝纖維化是蟲(chóng)卵肉芽腫所致膠原合成與降解失衡而使膠原過(guò)度沉積的結(jié)果。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）的活化是血吸蟲(chóng)肝纖維化的關(guān)鍵事件［5］。HYP是肝臟膠原蛋白的特征性成分之一，其含量高低可以直接反映肝臟纖維化的嚴(yán)重程度。另外，HA在肝內(nèi)由 HSCs合成并釋放入血液，血中的 HA由肝細(xì)胞代謝，肝纖維化時(shí) HSCs增多，而肝細(xì)胞代謝能力下降，因此引起外周血中HA水平上升。所以血清 HA水平也是反映肝纖維化的一項(xiàng)敏感指標(biāo)［6］。

圖5 模型Ⅱ小鼠肝臟纖維化病理圖 Masson×100A：Ⅱ1組；B：Ⅱ2組；C：Ⅱ3組；與Ⅱ2組比較：***P＜0.001

圖6 模型Ⅱ小鼠肝臟纖維化指標(biāo) HA和 HYP濃度A：血清 HA；B：肝 HYP；與Ⅱ2組比較：***P＜0.001

血吸蟲(chóng)感染早期，機(jī)體的免疫應(yīng)答以 Th1型應(yīng)答為主。而 Th1型細(xì)胞因子如 IFN-γ和 IL-2等可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)而抑制膠原沉積［7-8］。隨著病程進(jìn)展，發(fā)生 Th1／Th2偏移，因而在血吸蟲(chóng)感染慢性期和晚期以 Th2型應(yīng)答為主［9］。而 Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答則通常伴隨 IL-4、IL-5、IL-13、TGF-β1等細(xì)胞因子的高表達(dá)。IL-4和 IL-13是有效 促膠原 形成的 細(xì)胞因子［9］，后者還可通過(guò) TGF-β1依賴和非依賴方式，活化 HSCs，促進(jìn)膠原產(chǎn)生以及纖維化的形成。因此，以蟲(chóng)卵肉芽腫作為始動(dòng)因子的 Th2應(yīng)答及其細(xì)胞因子參與的膠原合成以及 ECM的形成，是肝臟纖維化的主要病理過(guò)程。

弓形蟲(chóng)是一種有核細(xì)胞內(nèi)專性寄生的原蟲(chóng)。雖然弓形蟲(chóng)屬內(nèi)只有剛地弓形蟲(chóng)一個(gè)物種，但是近年來(lái)對(duì)世界各地人畜分離株的種群結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，弓形蟲(chóng)具有豐富的遺傳多樣性，歐洲和北美流行的弓形蟲(chóng)以Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型為主［10］。對(duì)不同基因型的多態(tài)性效應(yīng)分子誘導(dǎo)的宿主免疫應(yīng)答發(fā)現(xiàn)，在感染早期的宿主固有免疫應(yīng)答中，Ⅱ型弓形蟲(chóng)株（弱毒株）的 GRA15Ⅱ可誘導(dǎo)宿主巨噬細(xì)胞出現(xiàn)顯著的偏移，驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞向經(jīng)典途徑活化的巨噬細(xì)胞（M1）極化［11］。即使在弓形蟲(chóng)感染宿主的適應(yīng)性免疫應(yīng)答中，同樣是以 M1／Th1優(yōu)勢(shì)應(yīng)答為主［12］?；谘x(chóng)病肝臟纖維化病理進(jìn)程中的 Th2應(yīng)答機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以弓形蟲(chóng) PRU包囊預(yù)先感染小鼠后不同時(shí)間，血吸蟲(chóng)尾蚴再行感染，結(jié)果表明，小鼠預(yù)先經(jīng)口感染Ⅱ型弓形蟲(chóng) PRU包囊 35 d后，給予血吸蟲(chóng)尾蚴經(jīng)皮膚感染，小鼠存活率不僅沒(méi)有受到影響，而且其肝臟纖維化各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均顯著下降。表現(xiàn)為小鼠肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫減少，HE染色和 Masson染色顯示纖維化面積縮小；血清HA水平和肝組織 HYP含量均顯著低于對(duì)照組。以上結(jié)果提示，Ⅱ型弓形蟲(chóng)誘導(dǎo)的宿主Th1型免疫應(yīng)答可顯著抑制小鼠血吸蟲(chóng)病肝臟纖維化的病理進(jìn)程和嚴(yán)重程度。其機(jī)制可能與PRU株弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的 M1／Th1應(yīng)答對(duì)肝臟纖維化發(fā)生發(fā)展起重要作用的 TGF-β的抑制作用有關(guān)。弓形蟲(chóng)誘導(dǎo)的 M1／Th1的偏移與Ⅱ型蟲(chóng)株的致密顆粒蛋白 15（GRA15Ⅱ）有關(guān)［13］。用 GRA15Ⅱ重組慢病毒誘導(dǎo)肝臟 kupffer細(xì)胞的 M1偏移進(jìn)行早期肝臟纖維化的預(yù)防和治療研究正在進(jìn)行中。

本研究提示，預(yù)先感染弓形蟲(chóng) PRU株建立的宿主的 Th1的微環(huán)境，可能導(dǎo)致機(jī)體 Th2應(yīng)答減弱或遲滯，或者可增強(qiáng) Th1應(yīng)答中某些促纖維溶解分子的表達(dá)。例如 Wynn et al［14］發(fā)現(xiàn)在感染血吸蟲(chóng)之前給與小鼠 IL-12（M1／Th1型應(yīng)答的重要細(xì)胞因子），預(yù)先建立 Th1應(yīng)答免疫環(huán)境，可以顯著減輕小鼠慢性期纖維化，其肝臟肉芽腫和膠原沉積明顯減少。值得關(guān)注的是，小鼠感染血吸蟲(chóng)42 d或56 d后再給予弓形蟲(chóng)感染，不但未見(jiàn)肝臟纖維化的明顯緩解，反而升高了小鼠的死亡率，其機(jī)制尚待深入研究。

參考文獻(xiàn)

［1］Colley D G，SecorW E.Immunology of human schistosomiasis［J］. Parasite Immunol，2014，36（8）：347-57.

［2］Ramachandran P，Iredale JP.Liver fibrosis：a bidirectionalmodel of fibrogenesis and resolution［J］.QJM，2012，105（9）：813-7.

［3］Montoya JG，Liesenfeld O.Toxoplasmosis［J］.Lancet，2004，363（9425）：1965-76.

［4］Dupont C D，Christian D A，Hunter C A.Immune response and immunopathology during toxoplasmosis［J］.Semin Immunopathol，2012，34（6）：793-813.

［5］Anthony B，Allen J T，Li Y S，et al.Hepatic stellate cells and parasite-induced liver fibrosis［J］.Parasit Vectors，2010，3（1）：60.

［6］Kopke-Aguiar L A，Martins JR，Passerotti CC，et al.Serum hyaluronic acid as a comprehensivemarker to assess severity of liver disease in schistosomiasis［J］.Acta Trop，2002，84（92）：117-26.

［7］Tao F F，Yang Y F，Wang H，et al.Th1-type epitopes-based cocktail PDDV attenuates hepatic fibrosis in C57BL／6 mice with chronic Schistosoma japonicum infection［J］.Vaccine，2009，27（31）：4110-7.

［8］EIRidi R，Salem R，Wagih A，et al.Influence of interleukin-2 and interferon-gamma in murine schistosomiasis［J］.Cytokine，2006，33（5）：281-8.

［9］Ramalingam T R，Pesce JT，Mentink-Kane M M，et al.Regulation of helminth-induced Th2 responses by thymic stromal lymphopoietin［J］.J Immunol，2009，182（10）：6452-9.

［10］Boothroyd JC，Grigg M E.Population biology of Toxoplasma gondii and its relevance to human infection：do different strains cause different disease？［J］.Curr Opin Microbiol，2002，5（4）：438-42.

［11］Yarovinsky F.Innate immunity to Toxoplasma gondii infection［J］. Nat Rev Immunol，2014，14（2）：109-21.

［12］K?nkováS，Holán V，Zajicova A，et al.Modulation of immunity in mice with latent toxoplasmosis-the experimental support for the immunosuppression hypothesis of Toxoplasma-induced changes in reproduction ofmice and humans［J］.Parasitol Res，2010，107（6）：1421-7.

［13］Rosowski E E，Lu D，Julien L，et al.Strain-specific activation of the NF-kappaB pathway by GRA15，a novel Toxoplasma gondii dense granule protein［J］.JExp Med，2010，208（1）：195-212.

［14］Wynn T A，Cheever AW，Jankovic D，et al.An IL-12-based vaccinationmethod for preventing fibrosis induced by schistosome infection［J］.Nature，1995，376（6541）：594-6.

Experimental study on the effects of Toxoplasma gondii and Schistosoma japonicum overlapping infection on the liver fibrosis in m ice

Guo Yujuan1，2，Xie Yuanyuan2，Chu Deyong1，et al
（1Dept of Parasitology and Microbiology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Laboratory，The People’s Hospital of Lujiang County，Hefei 231500）

Objective To explore the positive effect of overlapping infection of Toxoplasma gondii and Schistosomiasis japonica on the hepatic fibrosis ofmice.Methods BALB／c mice（specific pathogen free）were transcutaneously infected with（15±2）larvae of Schistosoma japonicum to generate amodel of chronic infection after 42～56 days of larval infection，followed by an intragastric infection of 10 cysts Toxoplasma gondii PRU strain（group I）.Simultaneously，mice received 10 cysts infection of Toxoplasma gondii to establish a chronic infection with 35 days，followed by（15±2）larvae infection of Schistosoma japonicum（groupⅡ）.Equal number of normal animals were taken as control.Blood and liver tissue sampleswere collected for HE and Masson staining respectively.The size of liver egg granulomas and fibrosis areasweremeasured.Additionally，hyaluronic acid（HA）and hydroxyproline（HYP）in sera were tested.Results Pre-infection of PRU strain of Toxoplasma before Schistosoma japonicum infection resulted in a remarkable amelioration of hepatic fibrosis in mice，presenting the reduced size of egg granulomas and tissue fibrosis（P＜0.001）.And HA and HYP levelswere significantly decreased in themice with Toxoplasma pre-infection（P＜0.001）.In contrast，the established chronic infection of schistosomiasis ofmice，followed by oral reinfection with 10 cysts of Toxoplasma，did not show any inhibitory effects on hepatic fibrotic procession.Conclusion Pre-establishment of Th1 immune response induced by Toxoplasmamay help the animalswhich were infected with Schistosoma japonicum to ameliorate the procession of hepatic fibrosis.

Toxoplasma gondii；Schistosoma japonicum；overlapping infection；liver fibrosis

R 382.33；R 383.2+4

A

1000-1492（2016）02-0161-05

時(shí)間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.006.htm l

2015-11-17接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81471983、81171606）；安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2014A106）

1安徽醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室，合肥 230032

2安徽省廬江縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 231500

3安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 230032

郭玉娟，女，碩士研究生；

沈繼龍，男，教 授，博 士 生 導(dǎo) 師，責(zé) 任 作 者，E-mail：shenjilong53＠126.com