王 璐，何琳燕，盛下放

(農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物實驗室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210095)

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耐銅蘇丹草根內(nèi)生細菌的分離篩選及其生物學(xué)特性研究①

王 璐，何琳燕，盛下放*

(農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物實驗室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210095)

摘 要：從生長在銅礦廢棄地土壤中的Cu耐性蘇丹草根中分離篩選到二株產(chǎn)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶內(nèi)生細菌K1-6和K3-9菌株，并對菌株生物學(xué)特性進行了研究。菌株K1-6和K3-9具有較強的Cu抗性和多種抗生素抗性，菌株K1-6和K3-9能夠溶磷和分泌吲哚乙酸(IAA)，另外，菌株K3-9還能夠產(chǎn)生鐵載體和精氨酸脫羧酶，菌株K1-6和K3-9對溫度、pH和鹽濃度具有一定的耐受性，經(jīng)16S rDNA序列分析，菌株K1-6和K3-9分別被鑒定為根瘤菌屬(Rhizobium sp.K1-6)和腸桿菌屬(Enterobacter aerogenes K3-9)。采用平皿培養(yǎng)試驗研究了菌株K1-6和K3-9對生長在不同濃度Cu(0、4 mg/L)環(huán)境中的蘇丹草的生長和吸收Cu的影響。結(jié)果表明，接菌處理蘇丹草根部和地上部干重分別比對照增加了10.6%～45.5% 和13%～40%，差異達顯著水平(P ＜ 0.05)；接菌株K1-6處理蘇丹草根部和地上部Cu含量比對照增加了46% 和85%(P ＜ 0.05)，而接菌株K3-9處理蘇丹草根部和地上部Cu含量與對照相比沒有顯著差異。另外，接菌株K1-6處理蘇丹草根部和地上部總Cu吸收量比對照增加了88% 和114%(P ＜ 0.05)，接菌株K3-9處理蘇丹草根部總Cu吸收量比對照增加了44%(P ＜ 0.05)。另外，接菌株K1-6和K3-9處理的蘇丹草根部吸收的Cu是地上部吸收Cu的16～23倍。研究表明，分離自耐銅蘇丹草根部的內(nèi)生細菌具有多種植物促生特性，能夠顯著促進蘇丹草的生長、提高蘇丹草對Cu的耐受性，并強化蘇丹草根部對Cu的富集能力。另外，不同的內(nèi)生細菌對蘇丹草的生長、富集和耐受Cu的影響不同。

關(guān)鍵詞：銅礦廢棄地；蘇丹草；植物內(nèi)生促生細菌；Rhizobium sp.K1-6；Enterobacter aerogenes K3-9

由于銅礦開采和提煉而產(chǎn)生的銅礦廢棄地，不僅占用了土地資源，而且對相鄰的生態(tài)系統(tǒng)和人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重的影響[1-4]，而銅礦廢棄地因其營養(yǎng)狀況差和重金屬的毒害導(dǎo)致植被自然恢復(fù)困難[5-6]。為了礦區(qū)廢棄地土壤資源的利用和生態(tài)環(huán)境的保護，人們開展了大量的礦區(qū)廢棄地植被恢復(fù)和修復(fù)等研究工作[4,7]。植物修復(fù)因其成本低、環(huán)境友好以及可大規(guī)模原位修復(fù)等優(yōu)點備受關(guān)注[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)一些能源植物對重金屬具有一定的耐受性[5-6]，利用能源植物對重金屬污染礦區(qū)廢棄地進行生態(tài)重建，能將土壤修復(fù)與生物能源生產(chǎn)有機結(jié)合，具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。其中蘇丹草作為一年生禾本科高粱屬能源植物，適應(yīng)性廣、植株根系發(fā)達、生物量大、生長周期短、可多次刈割，有望用于礦區(qū)廢棄地的生態(tài)重建。然而由于礦區(qū)廢棄地土壤的水肥條件惡劣、重金屬等有害物質(zhì)含量高，能源植物很難定居或生長不良[4]，從而限制了能源植物蘇丹草對銅礦廢棄地的植物修復(fù)效率。

植物內(nèi)生細菌(endophytic bacteria)是指能在健康植物組織內(nèi)棲居而對植物不造成實質(zhì)性危害并與植物建立了和諧聯(lián)合關(guān)系的微生物[11]。植物內(nèi)生細菌可以通過產(chǎn)生的ACC脫氨酶、IAA、鐵載體以及精氨酸脫羧酶等促進植物生長，提高植物對重金屬的耐受性和富集能力[8,12-16]。雖然有關(guān)重金屬污染土壤和植物體內(nèi)重金屬抗性細菌的篩選、菌株對植物生長和富集重金屬的影響等研究已有不少報道[14,17-19]，但有關(guān)從耐受重金屬的蘇丹草根內(nèi)分離Cu抗性植物促生細菌并研究其生物學(xué)特性及其對蘇丹草生長和富集Cu的影響的研究至今未見報道。本項目的開展有望為植物-微生物聯(lián)合修復(fù)體系的建立和銅礦廢棄地生態(tài)修復(fù)以及能源植物的生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 土壤采集和分析

供試土壤采自南京湯山銅礦廢棄地(31°14′～32°07′N，118°22′～119°14′E)0～20 cm表層土，土壤類型為黃棕壤，自然風(fēng)干過20目篩，土壤pH、有機質(zhì)、速效性氮、磷和鉀等測定按土壤農(nóng)化常規(guī)分析法[20]。土壤Cu、Pb、Zn、Mn總量測定采用硝酸-鹽酸-高氯酸消煮土壤樣品，5% HNO3定容后用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP-OES)測定；土壤水溶態(tài)、醋酸銨提取態(tài)和二乙基三胺五乙酸(DTPA)提取態(tài)Cu含量的測定：準(zhǔn)確稱取自然風(fēng)干土壤3.00 g于50 ml離心管中，以1︰2的土水比分別加入6 ml去離子水、1 mol/L NH4OAC和0.05 mol/L DTPA，分別振蕩提取2 h，12 000 r/min離心10 min后，取上清液用ICP-OES分別測定溶液中的土壤水溶態(tài)、NH4OAC提取態(tài)和DTPA提取態(tài)Cu含量。

1.2 供試植物

供試植物為禾本科能源植物蘇丹草(Sorghum sudanense(Piper)Stapf.)，種子購自于江蘇省南京市明達種子經(jīng)營部。

1.3 蘇丹草根內(nèi)生細菌的分離篩選和蘇丹草生物量及銅含量分析

盆栽試驗在溫室中進行，所用土壤為上述銅礦廢棄地土壤，每公斤土壤拌入滅菌有機肥(含有機質(zhì)310 g/kg，氮20 g/kg，磷8.7 g/kg，鉀7.1 g/kg)2 g，土壤充分混勻后裝入塑料盆，每盆6.0 kg土壤，每盆播入經(jīng)2% 次氯酸鈉表面消毒的蘇丹草種子15顆，播種兩周后間苗，每盆留苗8株，培養(yǎng)溫度：白天25～32℃，夜間21～25℃，相對濕度75%～79%，蘇丹草生長期間適時澆水，蘇丹草生長80 天后用于細菌的分離篩選。

取出蘇丹草植株，用滅菌剪刀取植株根部和地上部，先用自來水將根部清洗干凈，然后用無菌水再清洗一遍，接著用75% 乙醇浸泡3 min后，用無菌水沖洗一遍，2.5% 次氯酸鈉再浸泡2 min，無菌去離子水沖洗3次。將表面消毒的根置于無菌研缽內(nèi)研磨后取勻漿液涂布在含有10 mg/L Cu2+的1/5 LB平板上，同時取最后一次浸洗的無菌水100 μl涂布于1/5 LB平板上，以檢測樣品表面消毒是否徹底。從平板上隨機挑取細菌單菌落，純化后保存待用。

用去離子水充分漂洗植株根部和地上部后置于105℃ 烘箱殺青30 min，55℃ 條件下烘干至恒重，稱取植物組織干重；烘干的植物組織用研磨機粉碎，并準(zhǔn)確稱取200 mg樣品于微波消煮管中，加入2 ml的HNO3消煮至澄清透明，消煮后的樣品加5% HNO3冷卻后定容至10 ml，用ICP-OES測定溶液中的Cu濃度。

1.4 細菌生物學(xué)特性研究

1.4.1 菌株產(chǎn)ACC脫氨酶能力測定 參考Belimov等[12]方法，將供試菌株接入SMN培養(yǎng)基在28℃ 的搖床中培養(yǎng)18 h，離心收集菌體，用SM培養(yǎng)基將菌體洗滌2次后分別等量接入SM(無氮培養(yǎng)基)、SMC(ACC為唯一氮源)、SMN((NH4)2SO4為唯一氮源)液體培養(yǎng)基。28℃ 搖床振蕩培養(yǎng)48 h，比色法測定不同培養(yǎng)基中菌懸液的OD600值。在SMC和SMN培養(yǎng)基中生長良好，而在SM培養(yǎng)基中不能生長的菌株具有ACC脫氨酶活性。

1.4.2 菌株產(chǎn)鐵載體能力測定 將供試菌株接入1/5 LB液體培養(yǎng)基，在30℃ 搖床中振蕩培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液6 000 r/min離心10 min，取1.0 ml上清液加入1.0 ml CAS檢測液，混勻，以去離子水作對照，1 h后測定630 nm波長處的吸光值；取1.0 ml未接菌的1/5 LB液體培養(yǎng)基與1.0 ml CAS檢測液混勻，同法測定為參比值[21-22]。

1.4.3 菌株產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)能力測定 將色氨酸配成2.5 mg/ml的溶液，過濾除菌。準(zhǔn)備LB液體培養(yǎng)基試管(2 ml)，滅菌后加入過濾除菌的色氨酸溶液0.5 ml，使培養(yǎng)基中色氨酸的最終濃度為0.5 mg/ml。將供試菌株接入上述培養(yǎng)液中，在30℃ 搖床中振蕩培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液6 000 r/min離心10 min，取1.0 ml上清液，加50 μl 10 mmol/L 的正磷酸和2 ml Sackowski’s顯色劑，混勻，黑暗下25℃ 顯色，30 min后測定530 nm波長處吸光值。以雙蒸水代替培養(yǎng)液作為對照。以濃度為5、10、20、40、60 mg/L的IAA標(biāo)準(zhǔn)液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算發(fā)酵液中IAA的濃度[23-24]。

1.4.4 菌株產(chǎn)精氨酸脫羧酶(ADC)能力測定 參考Sun等[14]的方法，培養(yǎng)基配方為：蛋白胨5.0 g，牛肉膏5.0 g，D-葡萄糖0.5 g，維生素B6(吡哆醛)5 mg，溴甲酚紫(1.6%)0.625 ml，酚紅0.02 g，蒸餾水1 L，瓊脂18 g，pH 6.0。以上培養(yǎng)基分為兩份，一份不加L-精氨酸鹽酸鹽作為空白對照，一份加入L-精氨酸鹽酸鹽，使最終濃度為1%，再調(diào)pH 6.0～6.3，分別分裝試管中，121℃ 滅菌10 min。將供試菌株分別接入上述兩種培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3～5 天，若對照管不變色，而測試管變?yōu)樽霞t色則為陽性，菌株產(chǎn)精氨酸脫羧酶(arginine decarboxylase)，不變色則為陰性。

1.4.5 菌株溶解難溶性磷酸鹽能力測定 采用溶磷圈法對細菌的溶磷特性進行測定。用牙簽將供試菌株分別點接種于NBRIP培養(yǎng)基上[25]，置于30℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 天，觀察有無透明溶磷圈產(chǎn)生。

1.5 菌株對環(huán)境條件的抗性

1.5.1 Cu和抗生素抗性 供試菌株劃線接種于含CuSO4的1/5 LB培養(yǎng)基，使Cu2+的終濃度為20，50，100，200，500 mg/L，30℃ 培養(yǎng)3 天，觀察其能否生長。

將供試菌株點接于含不同濃度抗生素的固體培養(yǎng)基，使抗生素終濃度如下：氨芐青霉素50，100，200 mg/L；卡那霉素20，50，100 mg/L；鏈霉素20，50，100 mg/L；氯霉素50，100，200 mg/L，28℃ 培養(yǎng)48 h，觀察其能否生長。

1.5.2 溫度、初始pH和鹽濃度對菌體生長的影響將供試菌株點接于1/5 LB固體平板，分別在7℃、15℃、28℃、37℃、42℃ 的溫度下培養(yǎng)72 h，觀察其能否生長及生長情況。

用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH將1/5 LB培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。將活化的供試菌株分別點接于上述不同pH的培養(yǎng)基中，28℃ 培養(yǎng)72 h，觀察其能否生長及生長情況。

按質(zhì)量百分比濃度分別配制NaCl濃度為0.5%，1.0%，2.0%，3.0%，5.0% 的1/5 LB培養(yǎng)基。將供試菌株分別點接于上述培養(yǎng)基上，28℃ 培養(yǎng)72 h，觀察其能否生長。

1.6 菌株的分子鑒定

參考薩姆布魯克[26]的《分子克隆實驗指南》提取細菌基因組DNA。用16S rRNA基因通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，以分離菌株的總DNA為模板進行PCR擴增。擴增體系(25 μl)為：10×Taq DNA polymerase buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，引物27F和1492R(10 mmol/L)各0.5 μl，2.5 mmol/L dNTP 2 μl，5 U/μl Taq酶0.15 μl，適量DNA模板，將ddH2O補足至25 μl。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，循環(huán)30次；72℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物用0.8% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將擴增產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。將所獲得序列用BLAST軟件與GenBank中已知的16S rRNA基因序列進行比對分析，鑒定菌株。

1.7 菌株對蘇丹草幼苗生長和Cu含量的影響

選擇大小均勻的蘇丹草種子經(jīng)75% 無水乙醇溶液消毒5 min，用無菌去離子水漂洗種子，置于25℃恒溫箱中催芽18 h。將菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃ 搖床180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，8 000 r/min離心5 min收集菌體，用無菌生理鹽水清洗2次，最終制備成108cfu/ml菌懸液。待種子萌芽后，選取萌芽一致的種子用細菌懸液浸泡4 h，并以無菌生理鹽水浸泡處理作為對照。將蘇丹草種子播種于含滅菌水瓊脂(0.6%)的平皿中進行培養(yǎng)，每皿種植10株蘇丹草。Cu處理濃度為0和4.0 mg/L，設(shè)3個重復(fù)。平皿置于光照培養(yǎng)架上培養(yǎng)，每天光照12 h，培養(yǎng)溫度為15～25℃，每天定量澆Hoagland營養(yǎng)液，培養(yǎng)15 天后分析。蘇丹草生物量和Cu吸收量的測定同1.3節(jié)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)均采用Microsoft Office Excel 2007處理，Originpro 8.0作圖，采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 銅礦廢棄地土壤理化分析

銅礦廢棄地土壤理化特性：pH 6.29，有機質(zhì)8.0 g/kg，速效氮58.6 mg/kg，速效磷8.5 mg/kg，速效鉀50.2 mg/kg，總銅2 297 mg/kg，水溶性銅4.06 mg/kg，醋酸銨提取態(tài)銅 32.2 mg/kg，DTPA提取態(tài)銅171 mg/kg，總鉛13.4 mg/kg，總鋅91.5 mg/kg，總錳652 mg/kg。該銅礦廢棄地土壤營養(yǎng)比較貧乏，土壤主要重金屬污染元素為Cu，土壤Cu含量明顯高于國家土壤環(huán)境質(zhì)量三級標(biāo)準(zhǔn)(Cu質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)≤400 mg/kg)。由此可見，Cu的毒性和營養(yǎng)貧乏是礦區(qū)廢棄地中限制植物生長的重要因素[4]。

2.2 菌株的篩選和鑒定

雖然銅礦廢棄地中高含量的Cu對植物的生長會產(chǎn)生重要的影響，供試能源植物蘇丹草在供試銅礦廢棄地上能夠正常生長，每盆蘇丹草根和地上部干重分別達4.2 g和10.5 g。另外，蘇丹草根和地上部Cu含量分別達673 mg/kg和40 mg/kg。蘇丹草根表面消毒后用無菌去離子水沖洗3次并將最后一次沖洗的無菌水涂布于1/5 LB平板上，培養(yǎng)3 天后在平板上沒有菌落出現(xiàn)，證明蘇丹草根表面消毒徹底，從蘇丹草根中分離到的細菌可以認為是根內(nèi)生細菌[14]。雖然重金屬的毒害對微生物的生長產(chǎn)生重要的影響，但是微生物可以通過多種機制提高其對重金屬的耐受能力[8]，本試驗從蘇丹草根中分離到15株Cu抗性植物內(nèi)生細菌，說明這些菌株已經(jīng)適應(yīng)了蘇丹草根部環(huán)境，經(jīng)過對分離菌株ACC脫氨酶活性的測定，菌株K1-6和K3-9具有ACC脫氨酶活性，因此，選擇K1-6 和K3-9菌株作為進一步研究的功能菌株。根據(jù)16S rRNA基因序列分析，菌株K1-6和K3-9分別被鑒定為根瘤菌屬(Rhizobium sp.K1-6)和腸桿菌屬(Enterobacteraerogenes K3-9)，Genbank登錄號分別為KJ631290 和KJ631293，同源性分別為100% 和99%。

2.3 菌株的生物學(xué)特性

2.3.1 菌株對Cu和抗生素的抗性 菌株K1-6和K3-9 分別能在Cu含量500 mg/L和100 mg/L的條件下正常生長，其中菌株K1-6比菌株K3-9具有更強的Cu抗性。由表1可知，菌株K1-6和K3-9對抗生素的抗性存在一定的差異。菌株K1-6對4種抗生素均具有一定的抗性，而菌株K3-9對鏈霉素敏感，對氨芐青霉素和氯霉素有較強的抗性。菌株K1-6和K3-9抗生素抗性的差異可能與菌株本身攜帶的抗性質(zhì)粒有關(guān)。

表1　菌株對抗生素的抗性Table 1 Antibiotics-resistances of bacterial strains

2.3.2 菌株的植物促生特性 由表2可以看出，分離自蘇丹草根部的Cu抗性和ACC脫氨酶活性菌株具有不同的植物促生特性。菌株K1-6和K3-9均具有產(chǎn)生IAA的能力，產(chǎn)量為21.8～54.9 mg/L。菌株K1-6不產(chǎn)鐵載體和精氨酸脫羧酶，而菌株K3-9能夠產(chǎn)生鐵載體和精氨酸脫羧酶，菌株K1-6和K3-9均能夠溶解難溶性磷酸鹽，在NBRIP培養(yǎng)基上有透明的溶磷圈產(chǎn)生。從Cu耐性植物海州香薷和鴨趾草植株體內(nèi)分離到的一些細菌菌株也具有產(chǎn)生ACC脫氨酶、IAA、鐵載體和精氨酸脫羧酶的能力[14]。

表2　菌株的植物促生特性Table 2 Plant growth-promoting characteristics of bacterial strains

2.3.3 溫度、pH和鹽濃度對菌株生長的影響 由表3可以看出，菌株K1-6和K3-9為中溫菌，在15～37℃下能較好生長，最適生長溫度為30℃左右；菌株K1-6和K3-9生長的pH范圍是5～10，菌株K1-6耐酸，在pH 4的條件下能生長；菌株K1-6和K3-9均可在0.5%～3% 的NaCl中良好生長，菌株K1-6也能夠在5% NaCl中生長。由此可見，與菌株K3-9相比，菌株K1-6有較強的耐酸和耐受高滲的能力。

表3　培養(yǎng)溫度、初始pH和鹽濃度對菌株生長的影響Table 3 Effects of culture temperature,initial pH and NaCl concentration on strain growths

2.4 菌株K1-6和K3-9對蘇丹草生長的影響

研究表明，能夠產(chǎn)生ACC脫氨酶、IAA、鐵載體和精氨酸脫羧酶的植物內(nèi)生細菌能夠顯著促進植物的生長和對重金屬的耐受性[14-15,27-28]。菌株K1-6 和K3-9能夠產(chǎn)生ACC脫氨酶、IAA、鐵載體和精氨酸脫羧酶，能夠顯著促進蘇丹草的生長(圖1)。另外，由圖1可以看出，菌株K1-6和K3-9對蘇丹草生長的影響存在明顯差異，在不添加Cu2+的條件下，接菌株K1-6處理的蘇丹草根和地上部干重分別比對照增加46% 和40%，差異達顯著水平(P＜0.05)，而接菌株K3-9處理的蘇丹草根和地上部干重分別比對照增加11% 和18%，但差異未達顯著水平(P＞0.05)；在添加Cu2+的條件下，接菌株K1-6處理的蘇丹草根和地上部干重分別比對照增加27% 和13%，差異達顯著水平(P＜0.05)，接菌株K3-9處理的蘇丹草根和地上部干重分別比對照增加41% 和37%，差異達顯著水平(P＜0.05)。由此可見，在Cu2+脅迫條件下，菌株K3-9比菌株K1-6能夠更好地促進蘇丹草的生長。

圖1　菌株K1-6和K3-9對蘇丹草生長的影響Fig.1 Effects of strains K1-6 and K3-9 on growths of Sorghum sudanense

圖2　菌株K1-6和K3-9對蘇丹草組織Cu含量的影響Fig.2 Effects of strains K1-6 and K3-9 on Cu contents of Sorghum sudanense

圖3　菌株K1-6和K3-9對蘇丹草吸收Cu的影響Fig.3 Effects of strains K1-6 and K3-9 on total Cu uptakes of Sorghum sudanense

2.5 菌株K1-6和K3-9對蘇丹草富集銅的影響

菌株K1-6和K3-9對蘇丹草根和地上部Cu含量的影響見圖2。由圖2可以看出，接菌株K1-6處理的蘇丹草根和地上部Cu含量分別比對照增加46% 和85%，差異達顯著水平(P＜0.05)，而接菌株K3-9處理的蘇丹草根和地上部Cu含量與對照相比沒有顯著差異(P＞0.05)。另外，與對照相比，接菌株K1-6處理的蘇丹草根和地上部吸收的總Cu分別比對照增加88% 和114%，差異達顯著水平(P＜0.05)，接菌株K3-9處理的蘇丹草根和地上部吸收的總Cu分別比對照增加44% 和16%。值得注意的是，蘇丹草富集的Cu主要分布在根部組織，接菌處理根中Cu含量是地上部Cu含量的17～25倍，而根中吸收的總Cu含量是地上部吸收的總Cu含量的16～23倍。研究表明，能夠產(chǎn)生ACC脫氨酶、IAA、鐵載體和精氨酸脫羧酶的植物內(nèi)生細菌不僅能夠顯著促進植物的生長而且能夠顯著促進植物對重金屬的富集能力[14-15,27]。劉莉華等[29]在龍葵的根際土壤分別接入Cd抗性植物內(nèi)生細菌，結(jié)果表明，接菌處理龍葵地上部和根部Cd的吸收量比對照增加50%；Zhang 等[8]發(fā)現(xiàn)，重金屬抗性和ACC脫氨酶產(chǎn)生細菌能夠顯著增加油菜對Pb的吸收。本試驗也表明，Cu抗性植物促生內(nèi)生細菌K1-6和K3-9菌株能夠顯著促進蘇丹草根和地上部對Cu的富集能力。雖然菌株K3-9沒有顯著影響蘇丹草根和地上部Cu含量，但菌株K3-9顯著促進了蘇丹草根的生長，從而增加了蘇丹草根對Cu的總吸收量(圖3)。Dell’Amico等[30]也發(fā)現(xiàn)Cd抗性根際細菌沒有影響油菜根和莖中Cd的含量，但提高了油菜生物量，從而顯著提高了油菜對Cd的總吸收量。另外，在培養(yǎng)15 天后在添加Cu2+(100 mg/L)和鏈霉素(100 mg/L，檢測菌株K1-6)或氯霉素(100 mg/L，檢測菌株K3-9)的1/5 LB平板上可以在蘇丹草根中檢測到菌株K1-6和K3-9，其細胞數(shù)量達104CFU/g根，而對照處理的根中未檢測到細菌菌落，說明菌株K1-6和K3-9可以在蘇丹草根中成功定殖。雖然菌株K1-6和K3-9在平皿培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出了對蘇丹草生長和耐受Cu的促進作用，但有關(guān)菌株K1-6和K3-9對生長在銅礦廢棄地中的蘇丹草的生長、耐受和富集Cu的效應(yīng)及其機制等值得進一步研究。

3 結(jié)論

1)供試蘇丹草能夠在銅礦廢棄地土壤中生長，并能夠在蘇丹草根中分離篩選到Cu抗性植物促生內(nèi)生細菌K1-6和K3-9菌株，16S rDNA序列分析表明，菌株K1-6和K3-9分別屬于根瘤菌屬(Rhizobium sp.K1-6)和腸桿菌屬(Enterobacter aerogenes K3-9)。

2)菌株K1-6和K3-9具有多種植物促生特性，菌株K1-6和K3-9產(chǎn)生植物促生物質(zhì)的能力不同。另外，菌株K1-6和K3-9對溫度、pH和鹽濃度具有一定的耐受性。

3)研究表明，K1-6和K3-9菌株能夠顯著促進蘇丹草的生長，提高蘇丹草對Cu的耐受性，并強化蘇丹草根部對Cu的富集能力。另外，菌株K1-6和K3-9對蘇丹草的生長、富集和耐受Cu的影響不同。

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Isolation of Endophytic Bacteria from Roots of Cu-tolerant Sorghum sudanense and Their Biological Characteristics

WANG Lu,HE Linyan,SHENG Xiafang*
(Key Laboratory of Agricultural and Environmental Microbiology,Ministry of Agriculture,College of Life Science,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

Abstract:Two ACC deaminase-producing endophytic bacteria(K1-6 and K3-9)were obtained from the roots of Cu-tolerant Sorghum sudanense grown in Cu mine wasteland.The biological characteristics of the two endophytic bacterial strains were characterized.Strains K1-6 and K3-9 showed resistance to high levels of Cu and antibiotics,solubilized inorganic phosphate,and produced indole acetic acid(IAA).Strain K3-9 could also produce siderophores and arginine decarboxylase.Strains K1-6 and K3-9 had also the characteristics of acid or alkali and salt tolerance and temperature resistance.Strains K1-6 and K3-9 were identified as Rhizobium sp.K1-6 and Enterobacter aerogenes K3-9 based on the analyses of their 16S rDNA gene sequences,respectively.Plate culture experiment was used to investigate the effects of the two endophytic bacterial strains on the growth and Cu accumulation of Sorghum sudanense grown in 0 and 4 mg/L of Cu added as CuSO4.The results showed that significant(P＜0.05)increase was observed in the root(ranging from 10.6% to 45.5%)and above-ground tissue(ranging from 13% to 40%)dry weight of the bacteria-inoculated Sorghum sudanense compared with the control.Inoculation with strain K1-6 was found to significantly increase Cu contents of the roots and above-ground tissues of Sorghum sudanense compared with the control,however,no significant difference was observed in Cu contents of the roots and above-ground tissues between the strain K3-9-inoculated and control plants.Furthermore,total Cu uptakes of the roots and above-ground tissues of the plants inoculated with strain K1-6 were increased by 88% and 114%(P＜0.05)respectively compared with the control,while total Cu uptakes of the roots was increased by 44% in the presence of strain K3-9 compared with the control.Notably,Cu content of the roots was 16-23-fold higher than that of the above-ground tissues of the plants inoculated with the two strains.The above results showed that the endophytic bacterial strains K1-6 and K3-9 from the roots of Cu-tolerant Sorghum sudanense have the innate multiple plant growth-promoting traits,can increase the growth and Cu tolerance of Sorghum sudanense,and enhance Cu accumulation in the roots.In addition,the increases in the growth,Cu accumulation and tolerance of Sorghum sudanense are dependent on the strains.

Key words:Cu mine wasteland; Sorghum sudanens; Plant growth-promoting endophytic bacteria; Rhizobium sp.K1-6; Enterobacter aerogenes K3-9

作者簡介：王璐(1988—)，女，安徽宣城人，碩士研究生，主要從事重金屬污染土壤植物-微生物聯(lián)合修復(fù)研究。E-mail:wanglu813126@ 126.com

* 通訊作者(xfsheng@njau.edu.cn)

基金項目：①國家自然科學(xué)基金項目(40871127，41171257)資助。

DOI:10.13758/j.cnki.tr.2016.01.015

中圖分類號：X53