薛　彬，張　晴，鄭占偉，祝仕清，孟雅娟

(華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司 微生物藥物國(guó)家工程研究中心

河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050015)

?

HPLC法同時(shí)測(cè)定環(huán)孢素A和其衍生物的含量

薛彬，張晴，鄭占偉，祝仕清，孟雅娟

(華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司 微生物藥物國(guó)家工程研究中心

河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050015)

摘要：采用Diamonsil-C(18)色譜柱，柱溫60 ℃下，以磷酸水-乙腈為流動(dòng)相，流速1.0 mL·min(-1),檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，建立了同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中環(huán)孢素A和其衍生物的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法。結(jié)果表明，在10～2 000 μg·mL(-1)濃度范圍內(nèi)，環(huán)孢素A和其衍生物的峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為1.0000和0.9999；按標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算回收率,環(huán)孢素A和其衍生物平均回收率分別為100.07%和100.06%；精密度實(shí)驗(yàn)的RSD值分別為0.97%和1.14%。該方法具有分析時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：環(huán)孢素A；環(huán)孢素A衍生物；液相色譜法；發(fā)酵液

環(huán)孢素A是一種環(huán)狀的具有親脂性的含8個(gè)氨基酸的多肽化合物，主要由雪白白僵菌、茄病鐮刀菌和柱孢霉菌等霉菌經(jīng)發(fā)酵得到[1]，被廣泛用于治療器官移植術(shù)后的排異反應(yīng)、免疫系統(tǒng)特別是自身免疫系統(tǒng)疾病。近年來(lái)，也被用來(lái)治療再生不良性貧血癥和各類皮膚病[2]，并發(fā)揮了重大作用。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)在環(huán)孢素A發(fā)酵過(guò)程中有時(shí)會(huì)伴有環(huán)孢素A衍生物的產(chǎn)生，而這種衍生物經(jīng)過(guò)一系列修飾后能夠成為一種具有抑制HCV活性的抗病毒藥物，同樣具有極大的研究?jī)r(jià)值[3]。此外，由于環(huán)孢素A發(fā)酵液成分復(fù)雜，除了環(huán)孢素A和其衍生物外，還會(huì)伴有很多其它復(fù)雜成分存在，且樣品數(shù)量多，因此，使用《中國(guó)藥典》和其它文獻(xiàn)方法[4-5]不能很好地對(duì)環(huán)孢素A、環(huán)孢素A衍生物和其它雜質(zhì)進(jìn)行分離，且分析時(shí)間較長(zhǎng)。而高效液相色譜法(HPLC)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)能對(duì)各種成分很好地分離，且操作簡(jiǎn)便快捷。作者在此建立了一種能夠同時(shí)測(cè)定環(huán)孢素A和其衍生物含量的HPLC法，擬為環(huán)孢素A和其衍生物的含量測(cè)定提供參考。

1實(shí)驗(yàn)

1．1試劑與儀器

環(huán)孢素A對(duì)照品(含量98.8%，批號(hào)：080523)、環(huán)孢素A衍生物對(duì)照品(含量98.3%，批號(hào)：081017)，自制。

乙腈，色譜純，Honeywell公司；磷酸，分析純，天津永大化學(xué)試劑有限公司；水為二次蒸餾水。

LC-2010A型高效液相色譜系統(tǒng)、SPD-MZOA型二級(jí)管陣列檢測(cè)器，日本島津公司；Heraeuspico21型離心機(jī)，Thermo公司；CP225D型電子天平(十萬(wàn)分之一)，Sartorius公司。

1．2方法

1．2.1色譜條件

采用二級(jí)管陣列檢測(cè)器掃描環(huán)孢素A和其衍生物的紫外光譜，發(fā)現(xiàn)在210nm處環(huán)孢素A和其衍生物均有較大吸收，故檢測(cè)波長(zhǎng)選取210nm。實(shí)驗(yàn)表明，WatersSymmetry-C18色譜柱和Diamonsil-C18色譜柱均能對(duì)環(huán)孢素A、環(huán)孢素A衍生物和其它雜質(zhì)進(jìn)行很好的分離，綜合考慮成本因素，選用Diamonsil-C18色譜柱。

Diamonsil-C18色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)；

流動(dòng)相：0.5‰磷酸水-乙腈(20∶80)；流速：1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；柱溫：60 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

在上述色譜條件下，環(huán)孢素A和其衍生物能夠很好地分離，且雜質(zhì)不干擾測(cè)定。

1．2.2溶液的配制

對(duì)照品溶液：稱取環(huán)孢素A和其衍生物對(duì)照品各10mg，置于同一100mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并定容，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取環(huán)孢素A發(fā)酵液原液，用無(wú)水乙醇稀釋4倍，3 000r·min-1下離心20min，取上清液作為供試品溶液。

1．2.3樣品含量的測(cè)定

分別取3批發(fā)酵液樣品(批號(hào)分別為：0627、0628和0629)，按1.2.2方法配制成3批供試品溶液，并取對(duì)照品溶液1份，按1.2.1的色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中環(huán)孢素A和其衍生物的含量。

2結(jié)果與討論

2.1環(huán)孢素A和其衍生物對(duì)照品、環(huán)孢素A發(fā)酵液的HPLC圖譜(圖1)

圖1　環(huán)孢素A和其衍生物對(duì)照品(a)、環(huán)孢素A發(fā)酵液(b)的HPLC圖譜

2．2供試品的檢測(cè)結(jié)果(表1)

表1

供試品的檢測(cè)結(jié)果/(μg·mL-1)

Tab.1

Test results of samples/(μg·mL-1)

2.3線性關(guān)系考察

將環(huán)孢素A和其衍生物對(duì)照品分別配制成濃度(μg·mL-1)為2 000、1 000、300、200、100、50、10的溶液，按1.2.1的色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，濃度(x)為橫坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合得回歸方程為：環(huán)孢素A：y=10 623x+803.68，R2=1.0000；環(huán)孢素A衍生物：y=11 740x+2 581.4，R2=0.9999。表明，在10～2 000 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，環(huán)孢素A和其衍生物的峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.4回收率實(shí)驗(yàn)

取12份已知濃度的供試品，其中6份精密加入環(huán)孢素A濃度為101.4 μg·mL-1的對(duì)照品溶液1 mL，另外6份精密加入環(huán)孢素A衍生物濃度為108.7μg·mL-1的對(duì)照品溶液1 mL，分別混勻后按1.2.1的色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表2

環(huán)孢素A回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2

Recovery test results of cyclosporine A

表3

環(huán)孢素A衍生物回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.3

Recovery test results of cyclosporine A derivatives

由表2、表3可知，環(huán)孢素A和其衍生物平均回收率分別為100.07%和100.06%。

2.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取1份供試品溶液，在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h分別進(jìn)樣，測(cè)得環(huán)孢素A和其衍生物峰面積RSD分別為1.92%和1.87%。表明環(huán)孢素A發(fā)酵液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.6精密度實(shí)驗(yàn)

取環(huán)孢素A和其衍生物對(duì)照品分別配制成濃度約為100 μg·mL-1的溶液，再分別按1.2.1的色譜條件平行測(cè)定6次，測(cè)得環(huán)孢素A對(duì)照品峰面積的RSD為0.97%，環(huán)孢素A衍生物對(duì)照品峰面積的RSD為1.14%。表明方法的精密度較高。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批供試品(批號(hào)：0627)6份，按1.2.1的色譜條件分析，測(cè)得環(huán)孢素A和其衍生物平均含量分別為142.3 μg·mL-1和100.8 μg·mL-1，RSD分別為1.21%和1.02%。表明方法的重復(fù)性良好。

3結(jié)論

采用Diamonsil-C18色譜柱，柱溫60 ℃下，以磷酸水-乙腈為流動(dòng)相，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，建立了同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中環(huán)孢素A和環(huán)孢素A衍生物的HPLC法。結(jié)果表明，在10～2 000 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，環(huán)孢素A和其衍生物的峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為1.0000和0.9999；按標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算回收率，環(huán)孢素A和其衍生物平均回收率分別為100.07%和100.06%；精密度實(shí)驗(yàn)的RSD值分別為0.97%和1.14%。該方法具有分析時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，特別適用于對(duì)環(huán)孢素A菌種的大量篩選。

參考文獻(xiàn)：

[1]鄭孝賢,邱觀榮,唐信東,等.環(huán)孢菌素A高產(chǎn)菌株搖瓶發(fā)酵及菌絲體的形態(tài)變化[J].中國(guó)抗生素雜志,2009,34(2):97-99.

[2]郭平,李芚,廖工鐵.環(huán)孢菌素臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,1995,30(10):585-588.

[3]任鳳芝,張雪霞,陳書(shū)紅,等.環(huán)孢素衍生物(γ-hydroxylmethylleucine4)-cyclosporin A的分離純化與鑒定[J].中國(guó)抗生素雜志,2013,38(7):512-515.

[4]耿艷輝,劉素彥,王素卿,等.高效液相色譜法測(cè)定環(huán)孢素A含量[J].理化檢驗(yàn)：化學(xué)分冊(cè),2013,49(4):408-410.

[5]廖蕓,沈友軒.高效液相色譜法測(cè)定環(huán)孢素A血藥濃度[J].江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,49(5):54-58.

Simultaneous Determination of Cyclosporine A and Its Derivatives by HPLC

XUE Bin,ZHANG Qing,ZHENG Zhan-wei，ZHU Shi-qing，MENG Ya-juan

(HebeiIndustryMicrobialMetabolicEngineering&TechnologyResearchCenter,NationalEngineeringResearchCenterofMicrobialMedicine,NCPCNewDrugR&DCo.,Ltd.,Shijiazhuang050015,China)

Abstract：A simultaneous determination method of cyclosporine A and its derivatives in fermentation broth by HPLC was developed using Diamonsil-C(18) column at temperature of 60 ℃,phosphoric acid solution-acetonitrile as mobile phase with a flow rate of 1.0 mL·min(-1),and the detection wavelength of 210 nm.Results showed that,there was a good linear relationship between peak areas of cyclosporine A and its derivatives in the concentrations range of 10～2 000 μg·mL(-1),and the correlation coefficients were 1.0000 and 0.9999,respectively.The average recoveries for cyclosporine A and its derivatives were 100.07% and 100.06%，respectively,which were calculated by a standard addition method.The RSD values of precision experiment were 0.97% and 1.14%,respectively.This method is time-saving,convenient,accurate and reproducible.

Keywords：cyclosporine A;cyclosporine A derivatives;HPLC;fermentation broth

中圖分類號(hào)：O 657.72

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2016)03-0068-03

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.03.018

作者簡(jiǎn)介：薛彬(1978-)，女，河北承德人，工程師，主要從事藥物研發(fā)工作，E-mail：binbin197809@163.com；通訊作者：孟雅娟，高級(jí)工程師，E-mail：mengyajuan@163.com。

收稿日期：2015-11-25