王　燕，高　潔，崔建強(qiáng)，王飛娟，張　爽，楊亞婷

(陜西國際商貿(mào)學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

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陜產(chǎn)貫葉連翹揮發(fā)油的提取工藝優(yōu)化及GC-MS分析

王燕，高潔，崔建強(qiáng)，王飛娟，張爽，楊亞婷

(陜西國際商貿(mào)學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

摘要：以陜產(chǎn)中藥貫葉連翹為原料，采用水蒸氣蒸餾法對其揮發(fā)油進(jìn)行提取和成分分析。以揮發(fā)油提取率為考核指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)曲面法相結(jié)合對揮發(fā)油的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用GC-MS對揮發(fā)油成分進(jìn)行分析鑒定，并通過面積歸一化法比較各組分的相對含量。確定了貫葉連翹揮發(fā)油的最佳提取工藝條件為：浸泡時(shí)間21 h、提取時(shí)間11 h、液固比5∶1(mL∶g)，在此條件下?lián)]發(fā)油提取率為0.342 mL·(100 g)(-1)；經(jīng)GC-MS分析鑒定出34種化合物，占總成分的94.01%。響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的貫葉連翹揮發(fā)油提取工藝穩(wěn)定可靠，適用于陜產(chǎn)貫葉連翹揮發(fā)油的提取。

關(guān)鍵詞：貫葉連翹；揮發(fā)油；響應(yīng)曲面法；成分分析；GC-MS

貫葉連翹(Hypericum perforatumL.)，又名貫葉金絲桃，為藤黃科、金絲桃屬多年生草本植物，是傳統(tǒng)的藥用植物，主要分布于陜西、甘肅、河北等地[1]。其藥用歷史達(dá)兩千年之久，具有清熱利濕、抑菌止血、疏肝解郁[2-3]、鎮(zhèn)痛和治療皮膚創(chuàng)傷等功效[4]。

貫葉連翹富含多種有效成分，關(guān)于其揮發(fā)油的提取、成分分析及應(yīng)用已成為研究熱點(diǎn)，其方法和藥源的不同也影響揮發(fā)油的提取效率、化學(xué)組成及含量[5]。目前已有關(guān)于不同產(chǎn)地貫葉連翹中揮發(fā)油的研究[6]，然而對陜產(chǎn)貫葉連翹揮發(fā)油的提取工藝優(yōu)化和化學(xué)組成分析的研究尚未見報(bào)道。

水蒸氣蒸餾法具有得率較高、能耗較低、操作簡單、無有機(jī)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)[7]。目前，關(guān)于陜產(chǎn)貫葉連翹揮發(fā)油的水蒸氣蒸餾提取研究較少，尤其是結(jié)合響應(yīng)曲面法在連續(xù)范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化分析的研究還未見報(bào)道。作者在此采用水蒸氣蒸餾法結(jié)合響應(yīng)曲面法對陜產(chǎn)貫葉連翹揮發(fā)油的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對揮發(fā)油成分進(jìn)行分析和鑒定，擬為貫葉連翹的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1實(shí)驗(yàn)

1.1材料、試劑與儀器

貫葉連翹全草藥材，陜西漢中，購自西安藥材市場，粉碎備用。

無水乙醚、無水硫酸鈉等，均為分析純。

R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；恒溫水浴鍋；QP2010型氣質(zhì)聯(lián)用儀，日本島津。

1．2方法

1．2.1揮發(fā)油的提取

準(zhǔn)確稱量80g貫葉連翹藥材于揮發(fā)油提取器的圓底燒瓶中，再加入一定量的蒸餾水浸泡一定時(shí)間，用水蒸氣蒸餾法加熱回流提取揮發(fā)油，收集餾出液。用乙醚將餾出液反復(fù)溶出萃取3次，并用無水硫酸鈉脫水干燥，按下式計(jì)算揮發(fā)油提取率Y[mL·(100g)-1]：

Y=V/m

式中：V為揮發(fā)油體積，mL；m為藥材質(zhì)量，g。

1.2.2揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化

1)單因素實(shí)驗(yàn)

按照1.2.1的方法，以揮發(fā)油提取率為考核指標(biāo)，考察浸泡時(shí)間(8h、12h、16h、20h、24h)、提取時(shí)間(8h、11h、14h、17h、20h)、液固比(mL∶g，下同，4∶1、5.5∶1、7∶1、8.5∶1、10∶1)等3個因素對揮發(fā)油提取率的影響。

2)響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)曲面法對貫葉連翹揮發(fā)油的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以揮發(fā)油提取率為響應(yīng)值，對影響揮發(fā)油提取率的因素浸泡時(shí)間(A)、提取時(shí)間(B)和液固比(C)進(jìn)行3水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，Box-Behnken設(shè)計(jì)的因素與水平見表1。

表1

Box-Behnken設(shè)計(jì)的因素與水平

Tab.1

Factors and levels of Box-Behnken design

按5個中心點(diǎn)設(shè)計(jì)安排實(shí)驗(yàn)，共進(jìn)行17組實(shí)驗(yàn)。

1.2.3揮發(fā)油的GC-MS分析

氣相色譜條件：載氣為高純氦氣(純度≥99.999%)；進(jìn)樣量1.0 μL；柱流量1.00 mL·min-1；柱前壓57.4 kPa；分流比1∶50；WDB-5彈性石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)，極性弱。

質(zhì)譜條件：EI離子源，離子源溫度200 ℃；GC-MS接口溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍(m/z)29～450；質(zhì)譜檢測起測時(shí)間2.5 min。應(yīng)用SHIMADZU GC/MS Solution Release 2.10軟件分析，NIST 147數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，確定每一個組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2結(jié)果與討論

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1浸泡時(shí)間對揮發(fā)油提取率的影響

在提取時(shí)間14 h、液固比7∶1的條件下，考察浸泡時(shí)間對貫葉連翹揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1　浸泡時(shí)間對揮發(fā)油提取率的影響

由圖1可知，隨著浸泡時(shí)間的延長，揮發(fā)油提取率逐漸上升；當(dāng)浸泡時(shí)間為16 h時(shí)揮發(fā)油提取率最高，原因是浸泡可使藥材組織細(xì)胞充分膨脹，細(xì)胞間隙變大，會加速細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)交換，促進(jìn)揮發(fā)油的提取；但當(dāng)浸泡時(shí)間超過16 h后，揮發(fā)油提取率變化不大，可能與實(shí)驗(yàn)季節(jié)環(huán)境溫度偏高、藥材質(zhì)量變異有關(guān)。因此，初步選擇浸泡時(shí)間為16 h。

2.1.2提取時(shí)間對揮發(fā)油提取率的影響

在浸泡時(shí)間16 h、液固比7∶1的條件下，考察提取時(shí)間對貫葉連翹揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長，揮發(fā)油提取率明顯升高；當(dāng)提取時(shí)間為14 h時(shí)，揮發(fā)油提取率達(dá)到最高，之后隨著提取時(shí)間的延長呈下降趨勢，即油類組分減少。表明提取14 h時(shí)，揮發(fā)油基本提取完全。因此，初步選擇提取時(shí)間為14 h。

2.1.3液固比對揮發(fā)油提取率的影響

在提取時(shí)間14 h、浸泡時(shí)間16 h的條件下，考察液固比對貫葉連翹揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖2　提取時(shí)間對揮發(fā)油提取率的影響

圖3　液固比對揮發(fā)油提取率的影響

由圖3可知，當(dāng)液固比小于5.5∶1時(shí)，揮發(fā)油提取率變化不明顯；當(dāng)液固比大于5.5∶1時(shí)，揮發(fā)油提取率明顯上升；當(dāng)液固比為7∶1時(shí)，揮發(fā)油提取率達(dá)到最高；隨后揮發(fā)油提取率變化相對穩(wěn)定。原因可能為液固比小時(shí)不能充分浸泡藥材原料；液固比過大，加熱時(shí)溶液沸騰導(dǎo)致原料和揮發(fā)油沾壁，影響提取效果。綜合考慮，初步選擇液固比為7∶1。

2.2響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)

2.2.1回歸模型方程的建立及其顯著性檢驗(yàn)

采用Design-Expert 8.0軟件分析數(shù)據(jù)，得到的二元二次回歸方程為：

Y=-0.054069+0.013245A+0.027903B+0.034875C+1.34896×10-3AB-4.58333×10-4AC+2.12500×10-3BC-8.98437×10-4A2-2.17361×10-3B2-4.66667×10-3C2。

表2

Box-Behnken設(shè)計(jì)揮發(fā)油提取率的預(yù)測值和實(shí)測值

Tab.2

Predicted and measured values of extraction

表3

方差分析

Tab.3

Variance analysis

2.2.2揮發(fā)油的響應(yīng)曲面分析

水蒸氣蒸餾法提取貫葉連翹揮發(fā)油的各個因素之間的響應(yīng)曲面圖見圖4。

圖4　各因素交互作用對揮發(fā)油提取率的影響

由圖4a可知，保持液固比不變，隨著浸泡時(shí)間和提取時(shí)間的延長，揮發(fā)油提取率先升高后降低，與擬合方程中浸泡時(shí)間的二次項(xiàng)和提取時(shí)間的二次項(xiàng)對響應(yīng)值的影響程度一致，因此，浸泡時(shí)間的最佳水平范圍為16～22 h，提取時(shí)間的最佳水平范圍為10～16 h。

由圖4b可知，揮發(fā)油提取率隨浸泡時(shí)間的延長和液固比的增大出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，浸泡時(shí)間和液固比之間的交互作用對響應(yīng)值有顯著的影響，因此，浸泡時(shí)間的最佳水平范圍為16～22 h，液固比的最佳水平范圍為(5～9)∶1。

由圖4c可知，提取時(shí)間和液固比之間的交互作用顯著，可以確定提取時(shí)間的最佳水平范圍為10～16 h，液固比的最佳水平范圍為(5～9)∶1。

通過模型計(jì)算獲得貫葉連翹揮發(fā)油的最佳提取工藝條件為：浸泡時(shí)間21.02 h，提取時(shí)間11.45 h，液固比5.45∶1。根據(jù)實(shí)際操作的需求，修正工藝條件為：浸泡時(shí)間21 h，提取時(shí)間11 h，液固比5∶1，該條件下平行實(shí)驗(yàn)3次得到貫葉連翹揮發(fā)油的提取率為0.342 mL·(100 g)-1，與揮發(fā)油提取率的預(yù)測值0.368 mL·(100 g)-1比較接近，表明該工藝是最優(yōu)的。

2.3揮發(fā)油GC-MS分析

對揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS分析，按峰面積歸一化法得到各成分相對含量，共分離出貫葉連翹揮發(fā)油的36種成分，鑒定出34種化合物(94.01%)，結(jié)果見表4。

由表4可知，貫葉連翹揮發(fā)油成分中正十六碳酸(16.39%)、4(14),11-桉葉二烯(9.20%)、十九醇(6.20%)、植醇(5.22%)、十二醇(5.14%)、二十一烷(3.79%)、α-柏木烯(3.72%)等成分相對含量較高。實(shí)驗(yàn)所得的陜產(chǎn)貫葉連翹揮發(fā)油成分與文獻(xiàn)報(bào)道的湖南產(chǎn)和國產(chǎn)的貫葉連翹原藥材粗粉的揮發(fā)油成分差異較大，與山東產(chǎn)的貫葉連翹揮發(fā)油成分較為接近[8-9]。原因可能與貫葉連翹揮發(fā)油的提取方法、部位、色譜條件和產(chǎn)地等不同有關(guān)[10-12]。

3結(jié)論

采用水蒸氣蒸餾法對陜產(chǎn)貫葉連翹揮發(fā)油進(jìn)行提取，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)曲面法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲取的最佳工藝條件下貫葉連翹揮發(fā)油提取率為0.342 mL·(100 g)-1。通過GC-MS對貫葉連翹揮發(fā)油成分進(jìn)行分析，共鑒定出34種化合物，可為陜產(chǎn)貫葉連翹的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

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貫葉連翹揮發(fā)油的GC-MS分析結(jié)果

Tab.4

GC-MS Analysis results of volatile oil from Hypericum perforatum L.

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Optimization of Extraction Process of Volatile Oil from ShaanxiHypericumPerforatumL. and GC-MS Analysis of Its Chemical Compositions

WANG Yan,GAO Jie,CUI Jian-qiang,WANG Fei-juan,ZHANG Shuang,YANG Ya-ting

(ShaanxiInstituteofInternationalTrade&Commerce,Xianyang712046,China)

Abstract：The volatile oil from Shaanxi Hypericum perforatum L. was extracted by steam distillation,and its chemical compositions were analyzed by GC-MS.The extraction process was optimized by single factor experiment combined with response surface methodology.The contents of each component were compared based on peak area normalization.Results showed that the optimum extraction conditions were soaking time 21 h,extraction time 11 h and liquid-solid ratio 5∶1(mL∶g),respectively.Under optimized conditions,the extraction rate of volatile oil was 0.342 mL·(100 g)(-1),and 34 compounds were identified by GC-MS,accounting for 94.01% of the total amount of extracted compounds.This extraction process obtained by response surface methodology is stable and reliable.It is a feasible method to extract volatile oil from Shaanxi Hypericum perforatum L..

Keywords：Hypericum perforatum L.;volatile oil;response surface methodology;composition analysis;GC-MS

中圖分類號：R 284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)03-0028-05

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.03.008

作者簡介：王燕(1982-)，女，陜西西安人，講師，主要從事天然藥物有效成分研究，E-mail：370749824@qq.com。

收稿日期：2015-12-03

基金項(xiàng)目：陜西省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(15ZY034)，陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(12JK1044)，咸陽市科技成果推廣計(jì)劃項(xiàng)目(2015KT-26)