李天芝，于新友，沈志強(qiáng)(.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 56600；.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 56600)

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一步法RT-PCR快速檢測(cè)豬瘟活疫苗中BVDV外源病毒方法的建立

李天芝1，于新友1，沈志強(qiáng)2
(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

摘 要：為檢測(cè)商品化豬瘟細(xì)胞毒活疫苗中牛病毒性腹瀉病毒污染，根據(jù)牛病毒性腹瀉病毒5′端非編碼區(qū)基因保守序列設(shè)計(jì)引物，建立了檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒一步法反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈(RT-PCR)方法，并對(duì)其特異性、敏感性進(jìn)行了研究。該一步法RT-PCR對(duì)牛病毒性腹瀉病毒擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性，對(duì)照毒株擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，對(duì)牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)的靈敏性為1pg總RNA量，應(yīng)用該方法，檢測(cè)了32批豬瘟細(xì)胞毒活疫苗樣品，以上結(jié)果表明該一步法RT-PCR方法檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)、敏感性高，可用于豬瘟細(xì)胞毒活疫苗中污染的牛病毒性腹瀉病毒外源病毒檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：豬瘟；牛病毒性腹瀉病毒；檢測(cè)

豬瘟(CSF)由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種豬高度傳染、致死性疾病，我國(guó)將豬瘟列為一類動(dòng)物疫病[1]。牛病毒性腹瀉病(BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)引起的以發(fā)熱、黏膜糜爛潰瘍、腹瀉、咳嗽、持續(xù)性感染與免疫耐受以及懷孕母牛流產(chǎn)、畸胎甚至死胎等為主要特征的牛傳染病[2]，我國(guó)將牛病毒性腹瀉病列為禁止入境的二類檢疫對(duì)象。BVDV和CSFV同屬于黃病毒科瘟病毒屬中的成員，BVDV還可引起豬、駱駝、羊、鹿等多種動(dòng)物感染發(fā)病[3]，給各國(guó)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。豬感染BVDV后可產(chǎn)生類似慢性豬瘟的臨床癥狀和病理變化，懷孕母豬可致發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)出畸形胎兒，免疫BVDV污染的豬瘟細(xì)胞毒活疫苗是豬感染BVDV一種重要途徑。BVDV主要通過(guò)生產(chǎn)過(guò)程中使用的牛血清、胰酶、牛睪丸等材料以及容器、設(shè)備污染豬瘟細(xì)胞活疫苗。對(duì)豬感染BVDV的現(xiàn)狀必須有清醒的認(rèn)識(shí)和必要的防控措施。本研究根據(jù)GenBank公布BVDV基因序列，針對(duì)具有很高保守性的5′端非編碼區(qū)基因設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，建立了一種特異、敏感的BVDV檢測(cè)方法，以確保疫苗的安全、有效，為商品化豬瘟細(xì)胞毒活疫苗中BVDV污染提供一種有效的分子生物學(xué)檢測(cè)方法。

1　?材料和方法

1.1病毒株與病料

牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型等均由本實(shí)驗(yàn)室保存，32批豬瘟細(xì)胞毒活疫苗樣品購(gòu)買自不同廠家。

1.2工具酶及試劑盒

AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司、DNA Marker、PCR相關(guān)試劑、限制性內(nèi)切酶、MD18-T載體、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司。

1.3RT-PCR引物設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank中登錄的BVDV 5′端非編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，上游引物：5′-AGGCTAG CCATGCCCTTAGT-3′，下游引物：5′-TCTGCAGCACCCTAT CAGG-3′，擴(kuò)增BVDV 5′端非編碼區(qū)序列244 bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4病毒基因組RNA的提取

按AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取BVDV的RNA，并提取其他幾種病毒的RNA。

1.5一步法 RT-PCR擴(kuò)增及條件優(yōu)化

以RNA為模板進(jìn)行一步法RTPCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL。各參數(shù)為50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，95℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)入95 ℃ 20 S、56 ℃20 S、72 ℃ 20 S，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min。取5 μL產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。同時(shí)對(duì)各擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，包括退火溫度(50～60 ℃梯度溫度，每2 ℃為1個(gè)梯度)、引物濃度(0.1～1.1μmol/L，每0.2μmol/L為1個(gè)梯度)等，反應(yīng)體系均為20μL。

1.6擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)及鑒定

首先取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將目的片段與pMD18-T克隆載體在16 ℃恒溫金屬浴中過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌株DH5α。挑取單個(gè)的轉(zhuǎn)化菌落，加LB溶液培養(yǎng)18 h后用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，用PCR方法進(jìn)行鑒定，將陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，將測(cè)序結(jié)果與參照的BVDV序列同源性比較。

1.7特異性試驗(yàn)

分別提取牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型的RNA，用已建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增。

1.8敏感性試驗(yàn)

BVDV 病毒提取RNA后定量，然后10倍梯度稀釋提取的病毒基因組RNA，使其分別相當(dāng)于含有10 ng RNA、1 ng RNA、100 pg RNA、10 pg RNA、1 pg RNA、0.1 pg RNA的含量，分別進(jìn)行一步法RT-PCR檢測(cè)，確定其敏感性。

1.9重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的一步法RT-PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)3份牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型，重復(fù)檢測(cè)3次，以驗(yàn)證本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.10豬瘟細(xì)胞毒活疫苗中BVDV外源病毒的檢測(cè)

將購(gòu)買的32批豬瘟細(xì)胞毒活疫苗樣品稀釋為含有1頭份/200μL作為檢測(cè)樣品進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增BVDV，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。并同時(shí)參照相關(guān)規(guī)程用細(xì)胞培養(yǎng)法檢驗(yàn)并比較二者的符合性。

2　?結(jié)果與分析

2.1擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)及鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在244 bp處可見(jiàn)特異性擴(kuò)增帶，與預(yù)期大小相符(圖1)。挑取PCR鑒定陽(yáng)性的菌液送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，插入到T載體的基因片段的核苷酸序列與BVDV(登錄號(hào)：KJ620017)的序列相似性為100%。

圖1　牛病毒性腹瀉病毒擴(kuò)增結(jié)果

2.2特異性試驗(yàn)

利用設(shè)計(jì)的引物和確定的最佳擴(kuò)增條件分別對(duì)牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型的核酸進(jìn)行一步法RT-PCR。結(jié)果6個(gè)樣品中只有BVDV能擴(kuò)增出大小為244 bp目的片段，而其他均未擴(kuò)增出相應(yīng)的片段(圖2)，表明本試驗(yàn)建立的方法有很好的特異性。

圖2　特異性試驗(yàn)

2.3敏感性試驗(yàn)

取5μ L PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在約244 bp附近出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符。從結(jié)果可以看出，引物的一步法RT-PCR檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1 pg RNA(圖3)。

圖3　敏感性試驗(yàn)

2.4重復(fù)性試驗(yàn)經(jīng)過(guò)3次重復(fù)操作，結(jié)果一致，說(shuō)明建立的方法是穩(wěn)定、可靠的。

2.5豬瘟細(xì)胞毒活疫苗中BVDV外源病毒的檢測(cè)

用建立的BVDV 一步法 RT-PCR檢測(cè)方法，共檢測(cè)了32批商品化豬瘟細(xì)胞毒活疫苗樣品，其中有2批有BVDV污染。細(xì)胞培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果與一步法 RT-PCR檢測(cè)方法的結(jié)果相同。

3　討論

范學(xué)政等[4]用RT-PCR方法對(duì)23批次的豬瘟疫苗進(jìn)行BVDV檢測(cè)，結(jié)果顯示，5批次豬瘟疫苗被BVDV污染，污染率達(dá)21.74%。范仲鑫等[5]用RTPCR方法對(duì)湖南省內(nèi)銷售的10個(gè)廠家48個(gè)批次的豬瘟細(xì)胞苗進(jìn)行BVDV病毒核酸檢測(cè)，結(jié)果：10個(gè)廠家的豬瘟細(xì)胞苗中有5個(gè)廠家檢出BVDV核酸陽(yáng)性，48個(gè)批次中有9批次檢出BVDV核酸陽(yáng)性，陽(yáng)性率為18.75%。因此，必須對(duì)豬瘟活疫苗中的BVDV進(jìn)行嚴(yán)格檢驗(yàn)，禁止接種BVDV污染的豬瘟活疫苗，按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2010年版3部)外源病毒檢驗(yàn)方法，對(duì)豬瘟細(xì)胞毒活疫苗中BVDV外源病毒的檢驗(yàn)主要采取細(xì)胞培養(yǎng)法，該法操作復(fù)雜，耗時(shí)間長(zhǎng)，傳統(tǒng)的兩部法RT-PCR檢測(cè)方法時(shí)間長(zhǎng)，操作繁瑣，需要先反轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，本試驗(yàn)建立的BVDV一步法RTPCR檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，不需要單獨(dú)做反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增一步完成，能在3 h內(nèi)檢出BVDV，不僅節(jié)省了時(shí)間，而且減少了操作步驟，可方便快捷地?cái)U(kuò)增出目的片段，適合于大規(guī)模推廣應(yīng)用。本試驗(yàn)建立的BVDV一步法RT-PCR檢測(cè)方法，共檢測(cè)了32批商品化豬瘟細(xì)胞毒活疫苗樣品，其中有2批有BVDV污染，與細(xì)胞培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果一致。本試驗(yàn)所建立的方法為豬場(chǎng)基層獸醫(yī)工作者開(kāi)展豬瘟細(xì)胞毒活疫苗樣品BVDV污染的檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單、有效的分子生物學(xué)檢測(cè)方法。

參考文獻(xiàn)

[1]國(guó)際獸疫局.哺乳動(dòng)物，禽和蜜蜂A和B類疾病診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)[M].3版.農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局，譯.1996：128-135.

[2]殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京：科學(xué)出版社，1997：538-548.

[3]王新平，周緒斌.豬感染牛病毒性腹瀉病毒的研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，1998，19(1)：1-3.

[4]范學(xué)政，寧宜寶，王琴，等.用RTPCR方法檢測(cè)豬瘟細(xì)胞苗中污染牛病毒性腹瀉病毒[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2010，46(1)：8-10.

[5]范仲鑫，張朝陽(yáng)，劉道新，等.豬瘟細(xì)胞苗污染牛病毒性腹瀉病毒情況調(diào)查[J].畜牧與獸醫(yī)，2011，43(7)：84-86.

(收稿日期：2015-11-09)

作者簡(jiǎn)介：李天芝(1985-)，女，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病診斷技術(shù)研究.

基金項(xiàng)目：山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-06-011-14)；濱州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013GG0304)