馮 笑，楊 陽，熊紅燕，范崇熙，狄守印，胡 偉，段維勛，梁洪亮，金振曉，俞世強

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SIRT1信號通路介導(dǎo)紫檀芪抗內(nèi)皮細胞抗缺血再灌注損傷的機制研究

馮 笑，楊 陽，熊紅燕，范崇熙，狄守印，胡 偉，段維勛，梁洪亮，金振曉，俞世強

［摘要］：目的 研究不同濃度紫檀芪(PTE)對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)缺血再灌注損傷的保護作用及其可能的機制。方法 HUVECs經(jīng)1 μM/L和2 μM/L的PTE處理后,接受模擬缺氧復(fù)氧(SIR)損傷(缺氧70 min,復(fù)氧4 h),采用CCK-8法檢測細胞活力,使用酶活性測定法檢測細胞培養(yǎng)液中丙二醛(MDA)的釋放量和超氧化物歧化酶(SOD)的水平,使用western blot法檢測SIRT1、Ac-FOXO1、Bax和Bcl-2的表達情況,使用SIRT1阻斷劑EX527觀察SIRT信號通路在這一過程中發(fā)揮的作用。結(jié)果 SIR處理可以抑制HUVECs活性,抑制SIRT1表達,上調(diào)Ac-FOXO1表達,下調(diào)Bcl-2/Bax比例(與Control組比較,P＜0.05)。細胞培養(yǎng)基中MDA含量上升,SOD水平下降(與Control組比較,P＜0.05)。1 μM/L和2 μM/L的PTE處理均可以發(fā)揮細胞保護作用,提高細胞活力,降低了MDA水平,提高了SOD水平(與SIR組比較,P＜0.05)。此外,PTE處理上調(diào)了SIRT1表達,抑制了Ac-FOXO1表達,并且提高Bcl-2/Bax比例(與SIR組比較,P＜0.05)。EX527處理后細胞活力下降,凋亡增加(與SIR＋PTE組比較,P＜0.05)。結(jié)論 PTE可以保護HUVECs抵抗缺血再灌注損傷,其機制是激活SIRT1/FOXO1保護性信號通路,抑制HUVECs凋亡。

［關(guān)鍵詞］：紫檀芪；人臍靜脈內(nèi)皮細胞；缺血再灌注損傷；沉默信息調(diào)控因子1

Pterostilbene alleviates HUVECs ischemia reperfusion injury via activating SIRT1 and suppressing cell apoptosis

Feng Xiao,Yang-Yang,Xiong Hong-yan,Fan Chong-xi,Di Shou-yin,Hu Wei,Duan Wei-xun,Liang Hong-liang,Jin Zhen-xiao,Yu Shi-qiang
Department of Cardiovascular Surgery,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Shaan＇xi Xi＇an 710032,China
Corresponding author:Jin Zhen-xiao,Email:13571921011@ 163.com

［Abstract］：Objective To explore the effect of pterostilbene on simulated ischemia reperfusion(SIR) injury of HUVECs and the roles of SIRT1 in this process.Methods The cultured HUVECs,pretreated with PTE(1 or 2 μM/L) for 2h,were subjected to SIR.Then cell counting kit-8 was used to detect cell viability,and specialized kits were used to detect the concentration of malondialdehyde(MDA) and superoxide dismutase(SOD) in the cell culture medium.The expression of Silent information regulator 1(SIRT1),Acetylated fork head transcription factor 1(Ac-FOXO1),Bcl-2 and Bax were quantified using western blotting.The specific inhibitor of SIRT1 EX527 was used to investigate the roles of SIRT1 in this process.Results SIR treatment reduced cell viability significantly(from 1.219±0.021 to 0.593±0.036),down-regulated SIRT1 expression,up-regulated Ac-FOXO1 expression and reduced the Bcl-2/Bax ratio(vs the control group,P＜0.05).Both 1μM/Land 2 μM/L PTE increased the cell viability(to 0.762±0.029和0.860±0.019),down-regulated the MDA level(to 14.16±1.62 and 11.23±1.35) and up-regulated the SOD level(to 64.16±3.97 and 86.06±5.48 )(vs the SIR group,P＜0.05).Western blot analysis showed that SIRT1 expression increased and Ac-FOXO1 expression decreased.The Bcl-2/Bax ratio was increased(vs the SIR group,P＜0.05).EX527 treatment reduced the cell viability(from 0.743±0.031 to 0.6140±0.025)(vs the SIR＋PTE group,P＜0.05).Conclusion PTE treatment may activate SIR injury through activating SIRT1-Ac-FOXO1 pathway and suppressing cell apoptosis.

［Key words］： Pterostilbene；HUVECs；Ischemia reperfusion injury；Silent information regulation 1

心血管疾病是當今社會危害人類生命健康的首要殺手,心肌缺血再灌注損傷是重要的損傷類型,內(nèi)皮細胞損傷在這個病理過程中發(fā)揮著重要的作用[1-3]。內(nèi)皮細胞構(gòu)成了血管和周圍組織的屏障,心肌缺血再灌注損傷可以促使內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡,最終損傷向心肌重構(gòu)和心衰的方向發(fā)展[3-4]。因而,如何保護血管內(nèi)皮細胞成為減弱心肌缺血再灌注損傷的重要著眼點。

紫檀芪( pterostilbene,PTE)是廣泛存在于藍莓、黑莓等漿果中非黃酮類多酚化合物,同白藜蘆醇互為同系衍生物,但其生物活性要較白藜蘆醇強[5]。紫檀芪可以通過抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗增殖等多種機制[1,5-8],對多種疾病具有治療或預(yù)防作用,包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝性疾病、退行性疾病以及腫瘤等[5-7]。值得注意的是它在心血管系統(tǒng)發(fā)揮保護作用[7],并且抵抗缺血再灌注過程中發(fā)生的氧化應(yīng)激損傷[6]。以往的研究表明紫檀芪可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的凋亡和自噬,發(fā)揮一定的保護作用[9-11],但是它是否可以保護內(nèi)皮細胞抵抗心肌缺血再灌注損傷尚未報道。

1 材料與方法

1.1 試劑 模擬缺氧復(fù)氧(simulated ischemia reperfusion,SIR)T1特異性阻斷劑EX527、脫氧葡萄糖、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、羥乙基哌嗪乙硫磺酸、連二亞硫酸鈉均購自Sigma公司。PTE購自aladdin公司。胎牛血清購自杭州四季青公司。DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶購自Hyclone公司。CCK-8細胞毒性檢測試劑盒購自七海生物公司。超氧化物岐化酶( SOD)檢測試劑盒和丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所?？筍IRT1抗體購自CST公司,抗Ac-FOXO1抗體購自Santa Cruz公司,抗Bcl-2和抗Bax抗體購自CST公司。抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體購自CMCTAG公司,辣根過氧化物酶標記的IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器 超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備儀器廠。CO2細胞培養(yǎng)箱購自Thermo公司。倒置顯微鏡購自O(shè)lympus公司。細胞用低速離心機購自Saitexiangyi公司。細胞培養(yǎng)瓶、96孔板購自Corning公司。Western blot電泳、轉(zhuǎn)膜及發(fā)光成像設(shè)備均購自Bio-Rad公司。酶標儀購自SpectraMax公司。

1.3 方法

1.3.1 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的培養(yǎng)及SIR模型的建立 常規(guī)HUVEC細胞,臍靜脈內(nèi)皮SIR損傷通過模擬缺血液及氮氣環(huán)境實現(xiàn)。缺血液配方為NaCl 137 mM/L、KCl 12 mM/L、MgCl20.49 mM/L、CaCl2·2H2O 0.9 mM/L、HEPES 4 mM/L、脫氧葡萄糖10 mM/L、連二亞硫酸鈉0.75 mM/L、乳酸鈉20 mM/L,pH值調(diào)至6.5。加入缺血液的細胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶置于含95%N2和5%CO2的密閉容器中缺氧70 min(該容器密閉且持續(xù)通氣),更換正常DMEM后在含95%O2和5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中復(fù)氧孵育4 h。

1.3.2 實驗分組及CCK-8法細檢測各組HUVEC細胞活力 首先,本實驗分為4組,分別為對照組、SIR組、PTE 1 μM/L＋SIR組、PTE 2 μM/L＋SIR 組,每組10個復(fù)孔,PTE預(yù)處理時間為4 h。隨后,PTE(2 μM/L)處理前用SIRT1阻斷劑EX527預(yù)處理2 h阻斷SIRT1,EX527濃度為10 μM/L(已證實該濃度本身對SIR后細胞活力無影響),將細胞分組為SIR組、PTE＋SIR組、PTE＋EX527＋SIR組、EX527＋SIR組,觀察EX527對PTE抗HUVEC細胞SIR損傷的影響。各組處理后將培養(yǎng)液棄掉,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞培養(yǎng)板3次,再加入100 μl DMEM培養(yǎng)液和10 μl CCK-8檢測液,置于37℃細胞培養(yǎng)箱孵育2 h,用酶標儀檢測各孔OD值(450 nm波長下吸光度值),本實驗重復(fù)3次。

1.3.3 細胞培養(yǎng)液中MDA含量及SOD活力含量檢測 各組處理結(jié)束后,取培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)液,嚴格按照試劑盒說明書檢測細胞培養(yǎng)液中MDA及SOD含量。每組重復(fù)3次。

1.3.4 Western blot法檢測細胞SIRT1通路及凋亡指標水平變化 各組細胞處理結(jié)束后,用PBS清洗后置于冰上,用細胞刮刮下并收集細胞,用添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細胞裂解液于冰上裂解20min,隨后以12000r/min離心20min。收集細胞裂解產(chǎn)物,采用二辛可寧酸BCA法測定蛋白濃度并調(diào)整其至一致。取30 μg總蛋白,加入相應(yīng)體積的5×上樣緩沖液,煮沸7 min。將該樣品用于十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜(NC膜)上。NC膜用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉4 h后分別孵育在SIRT1(1∶5 000)、Ac-FOXO1(1∶500)、Bax、Bcl-2和β-actin(1∶1 000)中,4℃孵育過夜。然后用TBST洗滌并于常溫用1∶5 000的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或鼠IgG孵育2 h。然后用TBST洗滌,最后在Bio-Rad照相系統(tǒng)采集照片,并用Image Lab軟件對其進行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件包分析實驗數(shù)據(jù),所有結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用t檢驗,P＜0.05有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 PTE對SIR損傷后HUVEC細胞活力的影響如表1和圖1所示,SIR處理顯著降低了HUVEC細胞活力(與對照組相比,P＜0.05),梯度濃度PTE預(yù)處理顯著提高了細胞活力(與SIR組相比,P＜0.05),其中2 μM/L的PTE保護效果更為明顯。倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)SIR組細胞受損皺縮,大量細胞死亡。PTE預(yù)處理后細胞死亡減少,細胞形態(tài)顯著改善。

表1　PTE對SIR損傷后HUVEC細胞活力的影響(n＝10,±s)

表1　PTE對SIR損傷后HUVEC細胞活力的影響(n＝10,±s)

注：a與對照組比較P＜0.05；b與SIR組比較P＜0.05；c與PTE1 μM/L＋SIR組相比P＜0.05。

組別　OD值對照組　1.219±0.021 SIR組　0.593±0.036aPTE 1μM/L＋SIR組　0.762±0.029bPTE 2 μM/L＋SIR組　0.860±0.019bc

2.2 PTE對SIR損傷后HUVEC細胞培養(yǎng)液中MDA和SOD含量的影響 如表2所示,缺血再灌注損傷后HUVEC釋放的MDA顯著上升,而SOD的活性顯著下降(與對照組相比,P＜0.05)。給予PTE預(yù)處理后,一定程度上減少了MDA釋放,提高了SOD活性(與SIR組相比,P＜0.05)。且該作用呈一定的劑量依賴性(與PTE 1μM/L＋SIR相比,P＜0.05)。

表2　PTE對SIR損傷后HUVEC細胞培養(yǎng)液中MDA和SOD含量的影響(n＝6,±s)

表2　PTE對SIR損傷后HUVEC細胞培養(yǎng)液中MDA和SOD含量的影響(n＝6,±s)

注：a與對照組比較P＜0.05；b與SIR組比較P＜0.05；c與PTE1 μM/L＋SIR組相比P＜0.05。

組別　MDA(μM/L)　 SOD(U/L)對照組　3.12±0.58　 120.59±6.28 SIR組　18.63±2.07a　40.25±3.75aPTE 1μM/L＋SIR組　14.16±1.62b　64.16±3.97bPTE 2 μM/L＋SIR組　11.23±1.35bc　86.06±5.48bc

圖1　PTE對SIR損傷后HUVEC細胞形態(tài)的影響(倒置顯微鏡,200倍)

2.3 PTE對SIR損傷后HUVEC細胞SIRT1和Ac-FOXO1蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 圖2所示為各組Western blot典型結(jié)果,并用圖像分析軟件進行統(tǒng)計分析。可見:與對照組相比,SIR處理顯著降低了SIRT1的表達水平,同時上調(diào)了Ac-FOXO-1的表達( P＜0.05)；降低了抗凋亡蛋白Bcl-2表達,上調(diào)了凋亡蛋白Bax表達( P＜0.05)。與SIR組相比,PTE預(yù)處理顯著提高了SIRT1表達,同時下調(diào)了Ac-FOXO1表達( P＜0.05)；增加了抗凋亡蛋白Bcl-2表達,下調(diào)了凋亡蛋白Bax表達( P＜0.05)。該作用有劑量依賴性,2 μM/L PTE保護效果更為明顯( P＜0.05)。

2.4 PTE與EX527共處理對SIR損傷后HUVEC細胞的影響 前期結(jié)果顯示2 μM/L的PTE具有較好的保護效果,給予SIRT1阻斷劑后檢測細胞活力值發(fā)現(xiàn),與PTE＋SIR組相比,PTE＋SIR＋EX527組細胞活力顯著下降( P＜0.05)。與SIR組相比,EX527 ＋SIR組對HUVEC細胞活力沒有影響( P＞0.05)。見表3。

表3　PTE與EX527共處理對SIR損傷后HUVEC細胞活力的影響(n＝10,±s)

表3　PTE與EX527共處理對SIR損傷后HUVEC細胞活力的影響(n＝10,±s)

注：a與SIR比較P＜0.05；b與PTE＋SIR組比較P＜0.05；c與PTE＋SIR＋EX527組比較P＜0.05。

組別　OD值SIR組　0.502±0.042 PTE＋SIR組　0.743±0.031aPTE＋SIR＋EX527組　0.6140±0.025bEX527＋SIR組　0.490±0.056c

圖2　PTE對SIR損傷后HUVEC細胞SIRT1、Ac-FOXO1、Bcl-2、Bax等蛋白表達的影響

2.5 PTE與EX527共處理對SIR損傷后HUVEC細胞的影響 圖3所示為各組Western blot典型結(jié)果,并用圖像分析軟件進行統(tǒng)計分析。可見:與SIR組相比,PTE＋SIR處理組SIRT1的表達水平顯著增加,同時Ac-FOXO-1的表達顯著下降( P＜0.05)；抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯增加,凋亡蛋白Bax表達明顯下降( P＜0.05)。與PTE＋SIR組相比,PTE＋SIR＋EX527組SIRT1表達輕微下降,Ac-FOXO1表達顯著增加( P＜0.05)；抗凋亡蛋白Bcl-2表達下降,凋亡蛋白Bax表達增加( P＜0.05)。與SIR組相比,EX527＋SIR組未引起各蛋白表達顯著變化。

圖3　PTE與EX527共處理對SIR損傷后HUVEC細胞SIRT1、Ac-FOXO1、Bcl-2、Bax等蛋白表達的影響

3 討 論

紫檀芪可以通過多種作用機制,可以保護多種組織細胞,對多種疾病具有治療和預(yù)防作用[5,8]。以前的研究顯示紫檀芪可以劑量依賴性的促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞eNOS磷酸化,增強NO合成,最終可以阻止內(nèi)皮細胞功能紊亂[10]。對于氧化修飾的低密度脂蛋白所誘發(fā)的內(nèi)皮細胞凋亡,紫檀芪同樣可以發(fā)揮保護作用,機制涉及其抗氧化應(yīng)激功能[9],該課題組的另一項研究顯示紫檀芪可以促進內(nèi)皮細胞發(fā)生保護性自噬,最終避免凋亡的命運[9]。上述證據(jù)都支持紫檀芪可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能,抑制細胞凋亡,對于心血管疾病具有預(yù)防和治療作用。筆者的研究在人臍靜脈內(nèi)皮細胞缺血再灌注模型上探討了紫檀芪的保護作用,最終發(fā)現(xiàn)了類似的保護效果。結(jié)果提示缺血再灌注處理的內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激明顯增強,凋亡指數(shù)明顯增加,這些效果可以被紫檀芪抑制。

Sirtuins是一個高度保守的家族,包含7個NAD＋依賴的脫乙?；?Sirt1是一種位于細胞核的脫乙酰化酶[12-13]。Sirt1可以作用于其下游的多種底物發(fā)揮生理效應(yīng),叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(fork head transcription factor 1,FOXO1)是其中重要的一種[14-15]。SIRT1可以作用于FOXO1,通過去乙酰化作用激活FOXO1。以前的研究證明SIRT1/FOXO1信號通路在心臟缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護作用[15]。并且該信號通路同Bax和Bcl-2凋亡信號通路密切相關(guān)[16-17],它可以增加Bcl-2/Bax比例,最終抑制凋亡的發(fā)生[16]。在本研究中筆者同樣發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞缺血再灌注處理后Sirt1下調(diào),乙?；疐OXO1上調(diào),Bcl-2/Bax比例下調(diào),凋亡增加。紫檀芪處理后可以抑制這些效應(yīng)的發(fā)生,保護內(nèi)皮細胞,并且這種保護作用表現(xiàn)為劑量依賴性。紫檀芪的保護效應(yīng)可以被Sirt1阻斷劑抵消,進一步肯定了SIRT1/FOXO1凋亡信號通路參與紫檀芪對內(nèi)皮細胞的保護作用。

綜上,筆者發(fā)現(xiàn)紫檀芪可以保護內(nèi)皮細胞抵抗缺血再灌注損傷,其機制是激活SIRT1/FOXO1保護性信號通路,抑制內(nèi)皮細胞凋亡。

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(修訂日期:2015-11-04)

(收稿日期:2015-10-20)

通訊作者：金振曉,E-mail:13571921011@ 163.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81570231,81570230,81570232,81470415,81270170,81200151,81470411)；陜西省國際科技合作與交流計劃項目(2015KW-047)；陜西省社會發(fā)展公關(guān)計劃(2015SF104,2012K15-02-01)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2013KTCL03-01)；陜西省自然科學(xué)基金( 2014JM4106 )；西京醫(yī)院學(xué)科助推計劃( XJZT14203,XJGX12C11,XJGX13LC15)

DOI:10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2016.01.13

作者單位：710032西安,第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管外科(馮 笑、段維勛、梁洪亮、金振曉、俞世強)；710032西安,第四軍醫(yī)大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)系(楊 陽)；710003陜西西安,西安市中心醫(yī)院胸心外科；710038陜西西安,第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸外科(范崇熙、狄守印)；710032陜西西安,第四軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系(胡 偉)