彭耀宗，周　霞，韓　冰，黃　濤，黃利掛，李學剛,3,4

(1.西南大學藥學院，重慶　400715；2.西南大學生命科學學院，400715；

3.重慶中藥現(xiàn)代化生產(chǎn)力促進中心，重慶　400715；

4.重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶　400715)

?

鹽酸小檗堿對草魚補體系統(tǒng)及補體c3作用的研究

彭耀宗1，周霞1，韓冰2，黃濤1，黃利掛1，李學剛1,3,4

(1.西南大學藥學院，重慶400715；2.西南大學生命科學學院，400715；

3.重慶中藥現(xiàn)代化生產(chǎn)力促進中心，重慶400715；

4.重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶400715)

摘要：為了探究鹽酸小檗堿(berberine hydrochloride)對草魚(Ctenopharyngodon idellus)補體c3的作用機理，用含0、0.06%、0.12%、0.24%鹽酸小檗堿飼料投喂草魚，在第7 d、14 d檢測血清中補體c3含量，在第14 d檢測肝臟中補體c3 mRNA表達量及急性感染嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)后存活情況。并進一步對鹽酸小檗堿體內(nèi)藥代動力學和補體消耗試驗進行了研究。結(jié)果顯示；攝食鹽酸小檗堿的草魚血清中補體c3含量和肝臟補體c3 mRNA表達量均顯著性增加(P<0.05/P<0.05)，草魚的存活率與對照組相比也有顯著性提高(P<0.01)。補體消耗試驗結(jié)果顯示，當鹽酸小檗堿在血清中濃度小于5 mg/L時與對照組相比補體消耗不顯著，當鹽酸小檗堿濃度大于5 mg/L時，補體消耗達到顯著性差異(P<0.05)，表明此時鹽酸小檗堿與補體c3直接結(jié)合，激活補體。藥代動力學實驗發(fā)現(xiàn)，灌服鹽酸小檗堿后，出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，兩峰值分別是0.243 mg/L和0.117 mg/L，此濃度遠遠低于與補體c3直接結(jié)合量最低量(5 mg/L)。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿對草魚補體c3的作用機理可能是通過上調(diào)補體c3mRNA的表達增加補體c3數(shù)量，而非通過直接結(jié)合補體c3來改變其活性。

關(guān)鍵詞：草魚(Ctenopharyngodon idellus);鹽酸小檗堿;補體c3;中藥

近年來，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)得到長足的發(fā)展，隨之而來的病害防控使得抗生素濫用成災(zāi)，各國取消飼用抗生素的呼聲也越來越高，中藥以其獨特的優(yōu)勢已成為各國研究的熱點[1]。魚類主要疾病是細菌性和病毒性疾病[2-3]，黃連類清熱解毒中藥具有很好的抗菌抗病毒作用，黃連的代表性成分小檗堿(Berberine，BBR)又稱黃連素，是黃連主要的生物堿，是一種黃色的異喹啉類生物堿[4-7]，現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，小檗堿有殺菌、抗病毒、降血糖以及免疫調(diào)節(jié)等作用[8-9]，在殺菌抗病毒方面，國內(nèi)外已有不少報道[10-13]。但大部分是黃連復方殺菌抗病毒[14-15],而關(guān)于黃連單體小檗堿對免疫大分子機理研究卻鮮有報道。

補體c3是補體成分中含量最高的一種，不論是經(jīng)典途徑還是替代途徑，均需在c3被活化之后，才能推進后續(xù)補體成分的連鎖反應(yīng)[16]，參與抗菌及多種免疫調(diào)節(jié)和應(yīng)答反應(yīng)[17]，在補體系統(tǒng)激活中起關(guān)鍵性作用。因此一定程度上提高補體c3水平對魚類非特異性免疫有重大意義。本研究工作系統(tǒng)評價了鹽酸小檗堿對補體c3含量，mRNA表達及其分子結(jié)構(gòu)變化的影響，為黃連等清熱類中藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗魚

試驗草魚(Ctenopharyngodonidellus)(500±10) g購自重慶市草魚養(yǎng)殖廠，從中挑選整齊、健壯的草魚，在實驗室循環(huán)水養(yǎng)殖箱中馴養(yǎng)14 d，水中溶氧保持在5 mg/L以上，水溫控制(25±1) ℃。

1.2飼料與分組

通威全價飼料打成粉，按0、600、1 200、2 400 mg/kg添加鹽酸小檗堿，將各種原料充分混合后，加入膨化機中，即制備成普通飼料(NC)組、0.06%(BBR-L)組、0.12%(BBR-M)組、0.24%(BBR-H)組的鹽酸小檗堿飼料，烘干后放于室溫保存。

1.3測定指標與方法

1.3.1草魚血清補體c3含量測定

將試驗魚隨機分在NC、BBR-L、BBR-M、BBR-H組,每組6尾，每天投喂飼料10 g/尾，分別在第7 d、14 d尾靜脈取血，4 ℃離心,4 000 r/min，10 min，取上清液置備血清，血清保存于4 ℃冰箱，重復三次，血清補體c3含量測定按南京建成補體c3試劑盒說明書進行。

1.3.2RNA提取、cDNA合成和實時熒光定量PCR

RNA的提取及cDNA的合成：NC、BBR-L、BBR-M、BBR-H組喂養(yǎng)(10 g/(尾·d))14 d后取肝臟每尾50 mg，液氮研磨，按照TRIzol (Invitrogen公司)說明書提取肝臟總RNA，測定其濃度和純度，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，按照PrimeScript?RTreagentKit(Takara公司)試劑盒說明書將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實時熒光定量PCR分析基因表達：利用primer Primer 5.0設(shè)計引物，根據(jù)實驗室獲得草魚的補體c3全長序列(GenBank登錄號：AY374472.1) 和β-actin 基因(GenBank登錄號：DQ211096.1)，設(shè)計熒光定量引物(表1)， 熒光定量PCR反應(yīng)采用熒光染料SYBR Green，根據(jù)TaKaRa公司產(chǎn)品設(shè)計反應(yīng)體系。在Bio-Rad的CFX96系統(tǒng)上執(zhí)行。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min,95 ℃ 10 s,53.9 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s ，42個循環(huán),溶解曲線從55.0 ℃到95.0 ℃ 每5 s增加0.5 ℃作為一個時間間隔用來檢測補體c3的表達差異。mRNA相對表達水平的計算采用了2-△△CT法和用β-actin進行標準化。

表1　草魚補體c3基因和β-actin參考基因引物序列

1.3.3細菌攻毒實驗

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)菌株由中國海洋微生物菌種保藏管理中心提供，將NC、BBR-L、BBR-M、BBR-H組喂養(yǎng)14 d后，每組30尾，分別腹腔注射0.2 mL無菌生理鹽水和等量的嗜水氣單胞菌(108cfu/mL)，觀察發(fā)病癥狀及死亡情況，分離細菌，確認死因，連續(xù)10 d均無死亡情況后統(tǒng)計草魚存活情況。

1.3.4補體消耗實驗

鹽酸小檗堿體外補體激活實驗Ji等[18]已報道。本研究在他們實驗上稍加改善。將試驗魚隨機分為8組，每組10尾，尾靜脈取血，分離血清，取30 μL的草魚血清分別與等量的4、10、20、40、80、120、160 mg/L的鹽酸小檗堿溶液充分混合，攪拌1.5 h。用等體積的PBS代替鹽酸小檗堿作為對照組。分別在每支試管中加入60 μL新鮮兔紅細胞(1×108cells/mL)，不時輕微搖動1.5 h后，在每支試管中加入3.38 mL PBS，并在1 600g條件下離心5 min，取上清液于414 nm處測定吸光度。在60 μL兔紅細胞中分別加入3.44 mL蒸餾水或PBS，獲得溶血的最大值和最小值(自發(fā)溶血)。補體引起的兔紅細胞溶血率按下面公式計算：溶血率={[A414 nm(樣品)-A414 nm(自然溶血)]/

[A414 nm(100% 全溶血)-A414 nm(自然溶血)]}×100%。

1.3.5藥代實驗

每尾魚按48 mg/kg灌服鹽酸小檗堿(5 mg/mL)，藥液務(wù)必灌入草魚前腸，無回吐者用于試驗。在0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、12、24、36 h尾靜脈采血，置于預先用1%肝素鈉抗凝過的試管內(nèi)，分離血漿，-20 ℃保存，各時間點設(shè)置6個重復。樣品前處理參考馬寅[19]的方法，把血清和乙酸乙酯按體積比1∶4比例混合，離心，收集上清液于15 mL離心管中，同法重復1次，合并2次收集的上清液，置于氮吹儀上吹干，加入1 mL甲醇，渦旋2 min，經(jīng)0.25 μm一次性針頭過濾器過濾后，采用流動相乙腈-磷酸二氫鉀(50∶50)，流速1.0 mL/min,檢測波長345 nm，進樣量50 μL，進樣檢測，保留時間為25 min，回收率及精密度試驗參考馬寅[19]方法進行。

1.3.6實驗數(shù)據(jù)的分析

所有數(shù)值均為平均值±標準差。統(tǒng)計分析采用spss軟件，用獨立樣本t-檢驗分析試驗結(jié)果的差異顯著性,P<0.05 為顯著性差異。

2結(jié)果與分析

2.1草魚血清補體c3含量的變化

投喂鹽酸小檗堿飼料后血清補體c3的變化見圖1，投喂7 d， BBR-M和BBR-H組顯著高于對照組(P<0.05)。當投喂14 d后，3個給藥組補體c3升高均達顯著水平(P<0.05)，且呈一定趨勢的劑量依賴關(guān)系。結(jié)果表明鹽酸小檗堿能促進草魚血清補體c3含量的增加，且與濃度和喂養(yǎng)時間成正相關(guān)。

圖1　各個濃度鹽酸小檗堿對草魚血清補體c3的影響

2.2補體c3 mRNA的表達

投喂鹽酸小檗堿飼料14 d后，檢測肝臟中補體c3 mRNA表達的變化(圖2)。PCR結(jié)果顯示，試驗組草魚補體c3 mRNA表達均顯著性升高(P<0.05)，高濃度的上調(diào)比例大于低濃度，且上調(diào)的趨勢與血清中補體c3結(jié)果類似。表明鹽酸小檗堿能上調(diào)草魚補體c3 mRNA的表達。

圖2　不同含量鹽酸小檗堿對補體c3 mRNA表達的影響

2.3細菌攻毒試驗結(jié)果

攻毒結(jié)果見圖3,BBR-L、BBR-M、BBR-H組草魚存活數(shù)分別是15尾、21尾和22尾，存活率分別為50%、70%、73.3%。而對照組(NC)存活僅3尾，存活率為10%。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，各個濃度試驗組草魚存活率均顯著提高(P<0.01)，表明鹽酸小檗堿能提高草魚的免疫力，且高劑量比低劑量更有效。

圖3　草魚投喂不同濃度鹽酸小檗堿后用嗜水氣

2.4體外補體消耗試驗

圖4可見，當鹽酸小檗堿在血清中濃度為2 mg/L時溶血率為85.71%，與對照組85.19%相比變化不大，此時未激活補體，當鹽酸小檗堿在血清中濃度為5 mg/L時，溶血率為82.42%，溶血率有所下降但未達顯著水平(P>0.05)，當鹽酸小檗堿在血清中的濃度超過10 mg/L時，溶血率先降低后升高，其濃度為10、20、40、60 mg/L時溶血率顯著性下降(P<0.05)，此結(jié)果與Ji等[18]報道是一致的，表明此濃度的鹽酸小檗堿激活補體系統(tǒng)。40 mg/L以后溶血率逐漸升高，可能是由于高濃度鹽酸小檗堿具有溶血功能。試驗結(jié)果表明，當血清中鹽酸小檗堿濃度小于5 mg/L時不能激活補體，當鹽酸小檗堿濃度≥10 mg/L時補體被激活。

圖4　鹽酸小檗堿對補體消耗的影響

2.5鹽酸小檗堿藥代動力學

在設(shè)定的色譜條件下，本法回收率為95.3%±1.1%，日內(nèi)與日間精密度均小于10%，結(jié)果顯示此法適合樣品檢測。灌服鹽酸小檗堿后，血藥濃度隨時間變化見圖5，灌服藥物后血藥濃度逐漸升高，在1.5 h時達到第一個峰(0.243 mg/L),之后血藥濃度下降后又升高，在第5 h時到達第二峰(0.117 mg/L)，36 h后檢測不到鹽酸小檗堿。本研究結(jié)果出現(xiàn)明顯雙峰現(xiàn)象與秦青英[20]研究羅非魚口灌鹽酸小檗堿和王亮等[21]研究小鼠口服小檗堿等結(jié)果類似，出現(xiàn)雙峰的原因可能是因為分布-重吸收，當組織的藥物濃度高于血漿，藥物可能從組織轉(zhuǎn)移到血漿，或肝腸循環(huán)造成二次吸收帶來的。

圖5　口灌鹽酸小檗堿在草魚體內(nèi)血漿的藥物濃度-

3討論

補體系統(tǒng)在被病原體或者抗原抗體復合物等多種物質(zhì)激活后,能誘導炎癥反應(yīng)和抗體的形成,介導病原體的清除[22],其中補體c3在激活途徑中起關(guān)鍵作用，其水平是衡量體液免疫的重要指標[23-24]。在我們研究中，投喂鹽酸小檗堿14 d后，攻毒實驗表明草魚存活率顯著提高。為探究體液免疫的保護作用，我們對補體c3作用機理展開了研究，實驗發(fā)現(xiàn)草魚攝食鹽酸小檗堿后，血清中補體c3的含量明顯升高，熒光定量PCR實驗也表明補體c3 mRNA相對表達顯著性增加，蛋白質(zhì)的表達與mRNA的實驗結(jié)果是一致的，說明鹽酸小檗堿能通過上調(diào)補體c3 mRNA表達來提高補體c3數(shù)量。

天然補體c3發(fā)揮功效主要是通過蛋白酶水解切割后其構(gòu)象改變完成的[25]，補體c3活化會引起膜攻擊復合物的形成，當補體c3被激活后進而推動后續(xù)免疫反應(yīng)[26]。Ji等[18]報道在草魚血清中加入鹽酸小檗堿，鹽酸小檗堿能與補體c3直接結(jié)合，改變補體c3構(gòu)象，進而激活補體c3。本研究結(jié)果與文獻報道結(jié)果類似，即鹽酸小檗堿在血清中濃度達到5 mg/L時，可以激活補體c3，但未達顯著水平，當鹽酸小檗堿濃度達到10 mg/L后，激活作用達到顯著水平，可見高濃度的鹽酸小檗堿可以與補體c3直接結(jié)合并改變補體c3的構(gòu)像，激活補體c3，濃度低于5 mg/L則無此作用。研究鹽酸小檗堿體內(nèi)藥代動力學發(fā)現(xiàn)，藥-時曲線出現(xiàn)2個峰，最大值為0.243 mg/L，遠遠低于鹽酸小檗堿與補體c3直接作用所需要的濃度(5 mg/L)，因此，可以推測，草魚攝食鹽酸小檗堿后，體內(nèi)血藥濃度不足以達到鹽酸小檗堿與補體c3直接相結(jié)合的濃度，此時鹽酸小檗堿與補體c3不能直接結(jié)合產(chǎn)生激活作用。

本試驗表明，鹽酸小檗堿能提高草魚免疫力，對草魚補體c3作用機理可能是通過上調(diào)補體c3 mRNA的表達，增加體內(nèi)補體c3數(shù)量來完成。而并非通過直接結(jié)合補體c3改變其活性來完成的，這也為黃連、黃柏等含小檗堿的中草藥用于水產(chǎn)疾病的防止提供了理論依據(jù)。

參考文獻:

[1]Gorbach S L.Antimicrobial use in animal feed-time to stop[J].New England J Med,2001,345(16):1202.

[2]李華,李強,付雷.幾種中草藥對海水養(yǎng)殖中常見病原菌的抗菌作用[J].大連海洋大學學報,2011,26(1):6-11.

[3]李義,黃輝,陳建.中國水生動物病毒病研究進展[J].四川畜牧獸醫(yī)學院學報,1998,(2):8.

[4]Ma B L,Ma Y M.Pharmacokinetic properties,potential herb-drug interactions and acute toxicity of oral rhizoma coptidis alkaloids[J].Exp Opin on Drug Metabol Toxicol,2013,9(1):51-61.

[5]Ye M,Fu S,Pi R,et al.Neuropharmacological and pharmacokinetic properties of berberine:a review of recent research[J].J Pharma Pharmacol,2009,61(7):831-837.

[6]Fan D,Wu X,Dong W,et al.Enhancement by sodium caprate and sodium deoxycholate of the gastrointestinal absorption of berberine chloride in rats[J].Drug Develop Indust Pharma,2013,39(9):1447-1456.

[7]Eom K S,Kim H J,So H S,et al.Berberine-induced apoptosis in human glioblastoma T98G cells is mediated by endoplasmic reticulum stress accompanying reactive oxygen species and mitochondrial dysfunction[J].Biol Pharmaceut Bull,2010,33(10):1644-1649.

[8]昝琦,劉欣,逄越,等.補體C3結(jié)構(gòu)與功能研究進展[J].中國免疫學雜志,2014,(4):549-553.

[9]Huang C G,Chu Z L,Wei S J,et al.Effect of berberine on arachidonic acid metabolism in rabbit platelets and endothelial cells[J].Thromb Res,2002,106(4):223-227.

[10]Freile M L,Giannini F,Pucci G,et al.Antimicrobial activity of aqueous extracts and of berberine isolated from Berberis heterophylla [J].Fitoterapia,2003,74(7):702-705.

[11]Stermitz F R,Lorenz P,Tawara J N,et al.Synergy in a medicinal plant:antimicrobial action of berberine potentiated by 5'-methoxyhydnocarpin,a multidrug pump inhibitor[J].Proceed Nat Acad Sci,2000,97(4):1433-1437.

[12]Hayashi K,Minoda K,Nagaoka Y,et al.Antiviral activity of berberine and related compounds against human cytomegalovirus[J].Bioor Medic Chem Letters,2007,17(6):1562-1564.

[13]李一珊,倪晨,童建輝,等.黃連、五倍子醇提物對羅非魚源性鏈球菌生長曲線的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(6):234-237.

[14]蔣國政,李繼昌,韓振興,等.六味中藥對養(yǎng)殖場供水渠道真菌的抗菌活性研究[J].中國獸醫(yī)雜志,2012,48(8):68-70.

[15]楊國棟,肖魚,趙建培.防治草魚出血病并發(fā)癥的經(jīng)驗[J].飼料研究,1985,(10):20.

[16]Smith L C,Clow L A,Terwilliger D P.The ancestral complement system in sea urchins[J].Immunol Rev,2001,180(1):16-34.

[17]萬金娟,劉波,戈賢平,等.硬骨魚補體系統(tǒng)的研究進展[J].江西農(nóng)業(yè)學報,2012(11):159-164.

[18]Ji C,Zhang D F,Li A H,et al.Effect of berberine hydrochloride on grass carpCtenopharyngodonidellaserum bactericidal activity against Edwardsiella ictaluri [J].Fish Shellfish Immunol,2012,33(1):143-145.

[19]馬寅.氟苯尼考和恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)的代謝動力學研究[D].浙江寧波：寧波大學,2012.

[20]秦青英.鹽酸小檗堿在羅非魚體內(nèi)藥代動力學及殘留研究[D].廣東湛江：廣東海洋大學,2014.

[21]王亮,葉小利,李學剛,等.黃連生物堿在大鼠體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化及分布[J].中國中藥雜志,2010,(15):2017-2020.

[22]Ferreira A M.How echinococcus granulosus deals with complement [J].Parasitol Today,2000,16:168.

[23]Holland M C H,Lambris J D.The complement system in teleosts[J].Fish Shellfish Immunol,2002,12(5):399-420.

[24]Ellis A E.Immunity to bacteria in fish [J].Fish Shellfish Immunol,1999,(4):291-308.

[25]Janssen B J,Huizinga E G,Raaijmakers H C,et al.Structures of complement component C3 provide insights into the function and evolution of immunity [J].Nature,2005,437(22):505-511.

[26]Law S K,Lichtenberg N A,Levine R P.Evidence for an ester linkage between the labile binding site of C3b and receptive surfaces[J].J Immunol,1979,123(3):1388-1394.

(責任編輯：張瀟峮)

The effects of berberine hydrochloride on complement system and complement c3 in Ctenopharyngodon idellus

PENG Yao-zong1,ZHOU Xia1,HAN Bing2,HUANG Tao1,HUANG Li-gua1,LI Xue-gang1,3,4

(1.SchoolofPharmaceuticalSciences,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China;2.SchoolofLifeSciences,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China;3.InstituteofModernBioPharmaceutical，Chongqing400715,China;4.EngineerResearchCenterofChongqingPharmaceuticalProcessandQualityControl，Chongqing4001715,China)

Abstract：To explore the effect of berberine hydrochloride on the complement c3 of Ctenopharyngodon idellus,the level of complement c3 in serum were studied for 7 day and 14 day,the mRNA expression of c3 in the liver and resistance against acute Aeromonas hydrophila infection in C.idellus were evaluated after 14 days of feeding with berberine hydrochloride at the rate of 0,0.06%,0.12%,0.24%,respectively.The pharmacokinetics in vivo and complement consumption test in vitro of berberine hydrochloride were further studied.The results showed that the complement c3 levels in serum and the mRNA expression of c3 in the liver of fish fed with berberine hydrochloride increased significantly when compared with the control (P<0.05/P<0.01).The survival rate was significantly higher in groups fed with berberine hydrochloride than the control (P<0.01).In addition,complement consumption showed significant difference only when the concentration of berberine hydrochloride was higher than 5 mg/L.Berberine hydrochloride combined with complement molecules directly and the complement system was activated at this time.The pharmacokinetics experiment found that bimodal phenomena appeared after taking berberine hydrochloride and the value of two peaks was 0.243 mg/L and 0.117 mg/L,respectively,which was much lower than 5 mg/L.The results suggested that the berberine hydrochloride could enhance the immunity of C.idellus and the effect of berberine hydrochloride on the complement c3 in C.idellus might not be by combining with complement molecules directly,but through up-regulating the mRNA expression of c3 to increase the quantity of c3 protein.

Key words：Ctenopharyngodon idellus;berberine hydrochloride;complement c3;Chinese herbal medicine

中圖分類號：S948

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)02-0050-05

作者簡介：第一彭耀宗(1988-)，男，碩士研究生，專業(yè)方向為天然藥物化學。E-mail:pyz516565384@163.com通訊作者：李學剛。E-mail:xuegangli@swu.edu.cn

收稿日期：2015-07-15；

修訂日期：2015-10-28

資助項目：國家科技支撐計劃-石柱黃連規(guī)范化種植基地及其SOP優(yōu)化升級研究(2011BAI13B02-1)；石柱黃連須散中試工藝研究，西南大學校地合作基金(Sz201302)；重慶百名高端工程技術(shù)人才培養(yǎng)計劃