張雪萍，曾令兵 ，陳　倩 ，周　勇,3 ，張琳琳

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢　430070；

2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢　430223；

3.湖州師范學(xué)院浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開發(fā)技術(shù)研究重點實驗室，浙江湖州　313000)

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青魚鰭條組織細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性

張雪萍1,2，曾令兵2，陳倩1，周勇2,3，張琳琳1

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢430070；

2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢430223；

3.湖州師范學(xué)院浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開發(fā)技術(shù)研究重點實驗室，浙江湖州313000)

摘要：采用組織塊移植培養(yǎng)技術(shù)，對來源于青魚(Mylopharyngodon piceus)的鰭條組織細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，建立了青魚鰭條組織細(xì)胞系，定名為BC-Fin。青魚鰭條組織細(xì)胞為成纖維樣細(xì)胞，已穩(wěn)定傳代培養(yǎng)50多代，其最適培養(yǎng)溫度為25 ℃，最佳培養(yǎng)基為L-15，最適血清濃度為15%，在最適培養(yǎng)條件下，青魚鰭條組織細(xì)胞的群體倍增時間為60.6 h。青魚鰭條組織細(xì)胞液氮冷凍保藏6個月后，經(jīng)臺盼藍(lán)染色，約(90.09±4.65)%的細(xì)胞具有細(xì)胞活性，復(fù)蘇后的細(xì)胞生長旺盛。細(xì)胞染色體分析顯示，第16代青魚鰭條組織細(xì)胞的染色體數(shù)目為正常二倍體(2n=48)，第41代細(xì)胞染色體眾數(shù)為46。通過對離體培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中的16S rRNA基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，獲得長度為320 bp的核酸片段，核酸序列比對分析結(jié)果表明，其與青魚16S rRNA基因序列的一致性達(dá)98%，表明該細(xì)胞來源于青魚。病毒敏感性試驗結(jié)果顯示，在感染草魚呼腸孤病毒(GCRV)后BC-Fin細(xì)胞系可產(chǎn)生典型細(xì)胞病變效應(yīng)，病毒滴度為10(5.33±0.21) TCID(50)/mL，且PCR檢測可檢測出細(xì)胞培養(yǎng)的草魚呼腸孤病毒，表明BC-Fin細(xì)胞系對草魚呼腸孤病毒較敏感。

關(guān)鍵詞：青魚(Mylopharyngodon piceus)；鰭條組織；細(xì)胞系；生物學(xué)特性；病毒敏感性

青魚(Mylopharyngodonpiceus)，隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)青魚屬(Mylopharyngodon)。由于味道鮮美，營養(yǎng)價值高，備受養(yǎng)殖者和消費(fèi)者青睞。隨著青魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，病害問題日趨嚴(yán)重，其中，青魚出血病在湖北、江蘇、浙江及上海等地危害嚴(yán)重[1]。翟子玉[2]等對青魚出血病作了較為系統(tǒng)的研究，并且分離出導(dǎo)致出血病的病毒，制備了組織滅活疫苗，開展了青魚出血病免疫預(yù)防試驗。但是，長期以來，來源于青魚的細(xì)胞資源缺乏，制約了青魚出血病等病毒性疾病診斷與防治技術(shù)研究的開展。本研究建立了青魚鰭條的細(xì)胞系，對其生物學(xué)特性與病毒敏感性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，不僅豐富了魚類細(xì)胞資源，而且為今后開展病毒病流行病學(xué)特征、致病機(jī)理、診斷技術(shù)以及防控技術(shù)研究提供了重要的實驗材料。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1試驗魚與病毒株

健康青魚，體重約50 g，來自于長江水產(chǎn)研究所窯灣基地。實驗前在實驗室暫養(yǎng)2周。草魚呼腸孤病毒JX-0901株由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所吳淑勤研究員惠贈。

1.1.2試劑與耗材

L-15、R-1640、MEM、M199 培養(yǎng)液、兩性霉素B、青霉素/鏈霉素、磷酸緩沖液(DPBS)、胰蛋白酶-EDTA (Typsin- EDTA)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、二甲基亞砜(DMSO)、秋水仙素， 以上均購自sigma公司；胎牛血清(FBS)為杭州四季青生物工程材料公司產(chǎn)品；生長因子bFGF和EGF購自普飛生物；相關(guān)分子試劑均購自TaKaRa。 25 cm2和75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，15 mL和 50 mL離心管，規(guī)格為1、2、5 和10 mL的移液管，1.8 mL的凍存管均為自Corning公司產(chǎn)品；程序降溫盒購自Nalgene公司。

1.1.3主要儀器設(shè)備

Ⅱ級生物安全柜(ESCO)；倒置顯微鏡(Nikon)；正置顯微鏡(OLYMPUS)，照相 CCD(OLYMPUS)；低速冷凍離心機(jī)(Sigma)；恒溫培養(yǎng)箱 (Sanyo)；制冰機(jī)(Gelin)；液氮罐(MVE)。

1.2方法

1.2.1原代培養(yǎng)

將健康青魚浸于20 mg/L的高錳酸鉀溶液中消毒30 min，再用70%酒精擦拭魚體體表，置魚體于II級生物安全柜內(nèi)，取其鰭條組織。參照薛慶善[3]和Freshney[4]的原代培養(yǎng)法，采用組織塊移植法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。將鰭條剪成約1 cm3的組織塊，先用含高濃度雙抗的DPBS 緩沖液(500 U/mL青霉素、500 μg/mL鏈霉素、12.5 μg/mL兩性霉素B)清洗3次，再用含高濃度雙抗的培養(yǎng)液L-15(500 U/mL青霉素、500 μg/mL鏈霉素、12.5 μg/mL兩性霉素B)清洗1次，然后將組織塊移植到規(guī)格為25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中(Corning,USA)，均勻平鋪于培養(yǎng)瓶底面，倒置平放，貼壁2 h 后加1.5 mL含30%胎牛血清的L-15 培養(yǎng)液(含200 U/mL青霉素、200 μg/mL鏈霉素、5.0 μg/mL兩性霉素B，25 ng/mL EGF 和25 ng/mL bFGF)，置于25 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日加同樣的培養(yǎng)液至3 mL。隨后逐日觀察生長狀況，每3日更換一半培養(yǎng)液。倒置生物顯微鏡記錄細(xì)胞生長情況。

1.2.2傳代培養(yǎng)

當(dāng)細(xì)胞從組織塊中遷出單層達(dá)培養(yǎng)瓶底面積70%時，參照肖藝等[5]的方法進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。用PBS 清洗細(xì)胞，用胰蛋白酶(1×)消化細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞收縮變圓時，用含10%FBS的L-15中和胰蛋白酶，終止消化并吹打分散細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min(Sigma,3K15)，細(xì)胞沉淀用含有20%的DFBS新鮮培養(yǎng)液5 mL懸浮，轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中25 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)。待傳代培養(yǎng)細(xì)胞生長成單層，再采用上述相同方法進(jìn)行分瓶擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.3細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

青魚鰭條細(xì)胞的凍存：細(xì)胞冷凍保存液由終濃度分別為10%二甲基亞砜(DMSO)、20%血清(FBS)、70% L-15 培養(yǎng)液組成[6]。操作前，預(yù)先制備含20%二甲基亞砜(DMSO)、40%胎牛血清、40% L-15培養(yǎng)液的冷凍保存液，置于冰上預(yù)冷待用；將用于細(xì)胞冷凍保存的程序降溫盒(盛有異丙醇)于4 ℃冰箱過夜預(yù)冷備用；細(xì)胞凍存管置冰上預(yù)冷。用胰酶(1×)消化細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞收縮變圓時，迅速用含 10% 血清的培養(yǎng)液終止消化，離心收集細(xì)胞(1 000 r/min，5 min)，棄上清液，用不含血清的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞(與預(yù)先配制的細(xì)胞冷凍保存液等體積混合)，緩慢加入冰上預(yù)冷的冷凍保存液中，用移液管緩慢混勻，再分裝于冰上預(yù)冷的細(xì)胞凍存管中，每凍存管1.0～1.5 mL，最佳密度為1×106/mL，將細(xì)胞凍存管置于預(yù)冷的程序降溫盒中，置-80 ℃冰箱過夜后再移入液氮灌中長期凍存。

青魚鰭條細(xì)胞的復(fù)蘇：液氮保存180 d后取出冷凍保存的BC-Fin細(xì)胞，37 ℃水浴迅速融化，將細(xì)胞移入培養(yǎng)瓶，添加 4～5 mL 含10%FBS的L-15培養(yǎng)液，于 25 ℃培養(yǎng)過夜，次日吸出所有培養(yǎng)液以除去DMSO，再添加新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。從液氮中取出的細(xì)胞在37 ℃水浴融化后，取少許細(xì)胞用臺盼藍(lán)染色，顯微鏡下觀測細(xì)胞活性。

1.2.4最佳培養(yǎng)基

選擇4種培養(yǎng)液L-15、MEM、M199、R-1640，每種培養(yǎng)液配制成終濃度含15% FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液。調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL接種到12孔板，每孔1 mL，置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔2 d取2孔平行樣，用胰酶(1×)消化后計數(shù)，連續(xù)取樣6次，共計12 d，繪制其在不同培養(yǎng)液下的生長曲線。

1.2.5最適血清濃度

選擇L-15培養(yǎng)液，分別配制終濃度為5%、10%、15%、20%FBS 的細(xì)胞培養(yǎng)液。調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，接種到12孔板，每孔1 mL，正常培養(yǎng)。每隔2 d取2孔平行樣，用胰酶(1×)消化后計數(shù)，連續(xù)取樣6次并計數(shù)，共計12 d，繪制其在不同血清濃度下的生長曲線。

1.2.6最適培養(yǎng)溫度

配制終濃度含15% FBS的L-15細(xì)胞培養(yǎng)液，設(shè)置15、20、25、30 ℃四個溫度梯度，調(diào)整細(xì)胞密度依舊為5×104/mL，接種于12孔板，每孔1 mL，每個溫度下培養(yǎng)一個12孔板的細(xì)胞，每2 d取2孔平行樣，用胰酶(1×)消化后計數(shù)，連續(xù)取樣6次，共計12 d，繪制其在不同溫度下的生長曲線。

1.2.7 細(xì)胞群體倍增時間

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，進(jìn)行傳代，所用的培養(yǎng)液是終濃度含15% FBS的L-15，以1×105/孔 的細(xì)胞濃度接種于6孔板，置于25 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔12 h取3孔平行樣，用胰酶(1×)消化后計數(shù)，連續(xù)取12次，共計6 d。根據(jù)公式T=t×lg2/lg(Nt/N0)計算青魚鰭條細(xì)胞的群體倍增時間；以培養(yǎng)時間(d)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞濃度為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.2.8細(xì)胞染色體分析

取16代、41代的青魚鰭條細(xì)胞，傳代24 h后，棄原有培養(yǎng)液，接質(zhì)量終濃度為1.0 μg/mL的秋水仙素，繼續(xù)在原培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)13～15 h，用胰酶(1×)消化細(xì)胞、收集并離心，用DPBS清洗細(xì)胞，用冰醋酸和甲醇的混合液(體積比3∶1)預(yù)處理細(xì)胞，參照Wang等[6]的方法經(jīng)過低滲、固定、制片、晾干、吉姆薩染色，制備染色體薄片，隨機(jī)抽取100個樣品，100倍油鏡下觀察染色體，統(tǒng)計其數(shù)目。

1.2.916S rRNA 分析

參照Wang等[6]的方法，從培養(yǎng)的青魚鰭條細(xì)胞中提取總DNA。設(shè)計青魚線粒體中16S rRNA 基因的特異性引物，其序列為： 16S-F (5′-ACCGAACCTGGTGATAGC-3′) 和 16S-R (5′-TTTC-TTCCATGTGGGCAT-3′)。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系25 μL，2.5 μL PCR 緩沖液(10×)，2.0 μL dNTPs，2.0 μL MaCl2，2條引物各0.4 μL，0.2 μL Taq-DNA酶，1.0 μL DNA 模板，16.5 μL 水，混合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為： 首先94 ℃預(yù)變性5 min；然后95 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，30次循環(huán)；再72 ℃保溫10 min；最后 4 ℃保溫。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD-19T載體轉(zhuǎn)化到DH5α中，檢測到的陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物測序與比對分析。

1.2.10病毒敏感性

傳代培養(yǎng)的青魚鰭條細(xì)胞形成匯合單層后，棄培養(yǎng)液，加入1.0 mL GCRV細(xì)胞毒，病毒的感染復(fù)數(shù)MOI(multiplicity of infection)為1，加入終濃度為10 μg/mL polybrene，25 ℃吸附1.5 h，期間每間隔15-20 min輕微晃動培養(yǎng)瓶1次以便均勻吸附。吸附結(jié)束后，棄多余病毒液，添加5 mL含2%FBS 的L-15培養(yǎng)液，25 ℃培養(yǎng)，同時設(shè)置陰性空白對照。光學(xué)顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞病變效應(yīng)。采用微量培養(yǎng)板(Corning)培養(yǎng)法測定病毒滴度，按照Reed-Muench法計算病毒滴度。待病毒感染的青魚鰭條組織細(xì)胞出現(xiàn)典型細(xì)胞病變效應(yīng) (CPE) 達(dá)70%時，進(jìn)行PCR檢測。棄掉原有細(xì)胞培養(yǎng)液，用DPBS清洗3次，-80 ℃與室溫反復(fù)凍融三次后，3 000 r/min，4 ℃離心30 min，收集沉淀，RNAzol 法提取病毒基因組RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計與合成草魚呼腸孤病毒JX-0901株特異性引物P1:5′-TCTCTACCATCCGTTGGTTGTCC-3′和P2:5′-ATCGTTGTTGAGCTGAGCCTCTT-3′，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為461 bp。

2結(jié)果

2.1原代培養(yǎng)

青魚鰭條組織塊接種到25 cm2細(xì)胞瓶后1～2 d可良好貼壁，3-4 d有些許細(xì)胞從組織塊周圍遷出，6 d左右可形成生長暈(圖1)， 9 d時遷出的細(xì)胞已形成單層(圖2)，15 d后單層細(xì)胞約占瓶底面積70%。

圖1　原代培養(yǎng)第6天的BC-Fin細(xì)胞

圖2　原代培養(yǎng)第9天的BC-Fin細(xì)胞

2.2傳代培養(yǎng)

細(xì)胞首次傳代，約8～12 h可貼壁生長，但較多細(xì)胞無法貼壁，形成單層細(xì)胞需要5 d左右。連續(xù)傳代8次后，傳代細(xì)胞12 h后90%可貼壁生長，貼壁數(shù)目明顯增加，且3 d可形成單層細(xì)胞。目前青魚鰭條細(xì)胞已傳代50多次，細(xì)胞形態(tài)和生長穩(wěn)定(圖3)。

圖3　傳代培養(yǎng)的第40代BC-Fin細(xì)胞

2.3細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

青魚鰭條細(xì)胞在液氮中凍存6個月后復(fù)蘇，用臺盼藍(lán)染色計數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計細(xì)胞成活率高達(dá)(90.09±4.65)%。復(fù)蘇后的細(xì)胞經(jīng)觀察，形態(tài)上無明顯差別，貼壁較快，生長狀態(tài)良好，因此青魚鰭條細(xì)胞可長期保存。

2.4最佳培養(yǎng)基

青魚鰭條細(xì)胞在MEM、M199、R-1640、L-15四種培養(yǎng)液中均有生長，L-15更適合BC-Fin細(xì)胞生長。如圖4所示，R-1640 在培養(yǎng)早期細(xì)胞生長較為迅速，但從4 d開始生長緩慢，6 d后細(xì)胞量開始下降；MEM和M199培養(yǎng)基中細(xì)胞生長較為緩慢，細(xì)胞數(shù)峰值僅為1.5×105/mL左右，且8 d后細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)下降；L-15 培養(yǎng)液有著明顯的優(yōu)勢，細(xì)胞增殖迅速，生長趨勢明顯，細(xì)胞量可達(dá)到2.4×105/mL，是四種培養(yǎng)液里面峰值最高的一組，8-12 d細(xì)胞數(shù)量雖未再增加，但無明顯下降。

2.5最適血清濃度

15%的血清濃度最適于BC-Fin生長。分別添加5%、10%、15%、20%FBS于L-15培養(yǎng)液，置于25 ℃培養(yǎng)箱下，細(xì)胞生長有明顯不同(圖5)，經(jīng)統(tǒng)計分析得出血清濃度為5%和10%下的細(xì)胞生長較慢，且血清濃度為5%培養(yǎng)下細(xì)胞數(shù)在12 d時已少于接種數(shù)目，10%FBS的細(xì)胞數(shù)量在12 d時數(shù)量增加較少；在含15% 和20% FBS的L-15培養(yǎng)液中，細(xì)胞數(shù)量增長較快，在第8 d時達(dá)到峰值約為2.7×105/mL；但考慮到細(xì)胞單層及在保持細(xì)胞形態(tài)方面，15%的血清濃度優(yōu)越于20%。

圖4　BC-Fin 細(xì)胞在不同培養(yǎng)液中的生長比較

圖5　BC-Fin 細(xì)胞在不同血清濃度中的生長比較

2.6最適培養(yǎng)溫度

使用含15% FBS的L-15培養(yǎng)液，如圖6所示，25 ℃為最佳培養(yǎng)溫度。 分別在15、20、25、30 ℃四個溫度梯度下培養(yǎng)，細(xì)胞計數(shù)顯示15 ℃ 和20 ℃不利于細(xì)胞的生長，在此溫度下，細(xì)胞的數(shù)目沒有明顯變化，在12 d時細(xì)胞數(shù)量已出現(xiàn)下降；在25 ℃ ，細(xì)胞貼壁較快，生長迅速，對數(shù)生長期較長，在第8 d時達(dá)到峰值4.5×105/mL，是四個溫度下細(xì)胞數(shù)量的最高值；在30 ℃，細(xì)胞迅速生長，且最早達(dá)到峰值，但是峰值較小，達(dá)到峰值后細(xì)胞出現(xiàn)老化，細(xì)胞數(shù)量有所下降，細(xì)胞不能穩(wěn)定生長。

圖6　BC-Fin 細(xì)胞在不同溫度中的生長比較

2.7細(xì)胞群體倍增

第16代青魚鰭條細(xì)胞的生長曲線如圖7所示。細(xì)胞培養(yǎng)的1-5 d為青魚鰭條細(xì)胞的對數(shù)生長期，5-7 d細(xì)胞單層穩(wěn)定，細(xì)胞增殖速度明顯緩慢。根據(jù)公式T=t×lg2/lg(Nt/N0)計算細(xì)胞的群體倍增時間，其中Nt為t時間的細(xì)胞數(shù)， N0為接種細(xì)胞數(shù)。計算結(jié)果顯示，第16代鰭條細(xì)胞的群體倍增時間為60.6 h。

圖7　第16代BC-Fin細(xì)胞的生長曲線

2.8細(xì)胞染色體分析

BC-Fin細(xì)胞染色體統(tǒng)計結(jié)果顯示，第16代青魚鰭條細(xì)胞的染色體數(shù)目為2n=48(圖8)，與已經(jīng)報道的青魚染色體數(shù)目2n=48相符[7]。第41代青魚鰭條細(xì)胞染色體數(shù)目分布在32～56之間，染色體眾數(shù)為46 (圖9)，表明第41代的BC-Fin 細(xì)胞染色體數(shù)目已發(fā)生變化。

2.916S rRNA 分析

采用青魚16S rRNA基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了一段長度為320 bp擴(kuò)增產(chǎn)物(圖10)，與預(yù)期結(jié)果一致。經(jīng)對該片段測序與序列比對分析，結(jié)果顯示其序列與來自青魚的16S rRNA 基因(GQ406278.1)序列同源性為98%，證明此細(xì)胞來源于青魚。

圖8　第16代BC-Fin 細(xì)胞染色體

圖9　第41代BC-Fin 細(xì)胞染色體數(shù)目分布

圖10　BC-Fin細(xì)胞16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.10病毒敏感性

用GCRV-JX0901感染青魚鰭條細(xì)胞，感染后第3天，細(xì)胞開始收縮變圓、折光度增加，細(xì)胞單層收縮。感染后第6天，細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞脫落，單層呈破漁網(wǎng)狀，出現(xiàn)典型細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)(圖11A)，而對照組正常(圖11B)。采用微量培養(yǎng)板培養(yǎng)法測定病毒滴度為105.33±0.21TCID50/mL。細(xì)胞培養(yǎng)病毒的分子檢測結(jié)果顯示，RT-PCR擴(kuò)增出的片段為461 bp ，與預(yù)期結(jié)果相一致，且條帶單一(圖12)。表明BC-Fin細(xì)胞對GCRV-JX0901敏感，GCRV-JX0901病毒可在BC-Fin細(xì)胞上增殖。

圖11　GCRV-JX0901感染BC-Fin細(xì)胞

圖12　GCRV-JX0901 RT-PCR檢測結(jié)果

3討論

原代細(xì)胞培養(yǎng)方法主要有組織塊移植法、酶消化法、機(jī)械分散法、絡(luò)合劑分散法等[8]。常用的是組織塊移植法和胰酶消化法，比較這兩種原代細(xì)胞培養(yǎng)法的優(yōu)缺點，組織塊法更適用于難以消化的組織，考慮到鰭條組織質(zhì)地堅硬，選擇組織塊法對青魚鰭條細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。采用酶消化法對青魚鰭條細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，一般以1∶2的比例分瓶傳代。傳代培養(yǎng)時選擇生長末期或平臺期的細(xì)胞為宜。細(xì)胞是否可以長期凍存和成功復(fù)蘇，對于建立穩(wěn)定的細(xì)胞系至關(guān)重要。本實驗中，采用液氮保存法，經(jīng)過程序降溫盒在-80 ℃梯度式降溫后放入液氮中，有效避免了細(xì)胞在降溫過程中冰晶形成造成的傷害[3,8]。細(xì)胞復(fù)蘇后，生長狀態(tài)良好，形態(tài)與凍存之前無差別，經(jīng)臺盼藍(lán)染色后計數(shù)，細(xì)胞復(fù)蘇的成活率達(dá)約(90.09±4.65)%。證明此細(xì)胞可長期保存于液氮中。值得注意的是，經(jīng)過復(fù)蘇的細(xì)胞在細(xì)胞貼壁后要盡早更換培養(yǎng)液，以便較早去除培養(yǎng)基中的DMSO，實驗過程中發(fā)現(xiàn)較早更換培養(yǎng)液的細(xì)胞狀態(tài)好于較晚更換培養(yǎng)液的細(xì)胞。

BC-Fin細(xì)胞系生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，含15%的胎牛血清的L-15培養(yǎng)液于25 ℃培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，BC-Fin生長最好，細(xì)胞群體倍增時間為60.6 h。L-15培養(yǎng)液采用磷酸鹽緩沖體系，氨基酸組成進(jìn)一步改良，并由半乳糖替代了葡萄糖，使用于無二氧化碳下培養(yǎng)細(xì)胞，且此培養(yǎng)液用于多種細(xì)胞的培養(yǎng)[3,9]。胎牛血清中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，可以促進(jìn)細(xì)胞貼壁和生長，保護(hù)細(xì)胞免受重金屬離子、蛋白酶等物質(zhì)的損害[3]；但當(dāng)血清濃度過高時會產(chǎn)生較多的代謝產(chǎn)物，甚至?xí)种萍?xì)胞增長，因此選擇適合的血清濃度至關(guān)重要。BC-Fin細(xì)胞系的胎牛血清濃度為15%時，細(xì)胞表現(xiàn)出最佳生長性能。青魚鰭條細(xì)胞最適溫度為25 ℃，與青魚的養(yǎng)殖溫度22～28 ℃基本一致。生長因子主要通過與酪氨酸激酶性受體結(jié)合，刺激細(xì)胞增殖[11]，bFGF 因子是一種陽離子多肽，具有刺激成纖維細(xì)胞分裂能力的作用[10]。在培養(yǎng)半滑舌鰨細(xì)胞時使用EGF和bFGF,亦發(fā)現(xiàn)這些生長因子具有促進(jìn)魚類細(xì)胞增殖的作用[11]。本試驗中在進(jìn)行青魚鰭條組織細(xì)胞原代培養(yǎng)時，于培養(yǎng)基中添加適量EGF和bFGF，可明顯促進(jìn)組織塊中細(xì)胞遷出形成生長暈以及細(xì)胞增殖。

16S已被廣泛用于鑒定細(xì)胞來源。本實驗中通過PCR擴(kuò)增技術(shù)，獲得了青魚線粒體中的16S rRNA基因片段，從分子水平上可確定此細(xì)胞系來源于青魚。細(xì)胞染色體分析是鑒定細(xì)胞系的重要依據(jù)。通過對第16代BC-Fin細(xì)胞系進(jìn)行染色體分析發(fā)現(xiàn)，BC-Fin細(xì)胞系二倍體染色體數(shù)目為2n=48，與基于正常染色體數(shù)目一致，但第41代細(xì)胞的染色體數(shù)目分布在32～56區(qū)間，眾數(shù)為46。染色體數(shù)目的變化可能是由于細(xì)胞為了適應(yīng)體外環(huán)境，在長期的傳代培養(yǎng)中染色體發(fā)生了缺失、畸變、斷裂或重組等。染色體的變異也會導(dǎo)致一些功能的喪失，因此基于細(xì)胞的體外研究應(yīng)盡量選擇早期傳代細(xì)胞。

細(xì)胞系是分離培養(yǎng)病毒病原的重要基礎(chǔ)材料。青魚來源細(xì)胞系的缺乏，制約有關(guān)青魚出血病等病毒病的研究進(jìn)展。本研究采用草魚呼腸孤病毒GCRV-JX0901毒株感染青魚鰭條細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)了明顯病變效應(yīng)，證明此細(xì)胞系對GCRV敏感。這與養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中觀察到的草魚出血病呼腸孤病毒可以感染養(yǎng)殖青魚的結(jié)果一致[12]。草魚對GCRV高度敏感，GCRV感染草魚可導(dǎo)致草魚大量死亡。同時，草魚呼腸孤病毒亦能感染養(yǎng)殖青魚，導(dǎo)致青魚出血病的發(fā)生，但死亡率低于草魚出血病，我們推測，草魚呼腸孤病毒感染青魚可能有不同的感染和致病機(jī)理。

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(責(zé)任編輯：鄧薇)

Establishment and characterization of a cell line derived from fin of Mylopharyngodon piceus

ZHANG Xue-ping1,2,ZENG Ling-bing1,CHEN Qian1,ZHOU Yong2,3,ZHANG Lin-lin1

(1.CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070，China;2.YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Wuhan430223,China;3.ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofAquaticDevelopment,HuzhouNormalUniversity,Huzhou313000,Zhejiang,China)

Abstract：In order to rich the fish cell resourse and provide the important basic experiment materials for research of herring hemorrhagic disease etiology and pathogenesis,diagnostic technology,vaccine and immune prevention technology,a cell line,designated BC-Fin,has been established and characterized from the fin of Mylopharyngodon piceus by using tissue explant techniques.BC-Fin cell line has been continuously subcultured over 50 times and fully characterized in the aspects of morphological observation,cryopreservation,optimal growth kinetics,population doubling time and karyotyping, etc.BC-Fin cell monolayer consists of fibroblast-like cells and its optimal growth condition is:L-15medium,15% FBS and 25 ℃.Under such optimized condition the doubling time of BC-Fin cell numbers is about 60.6 h.After 6 months cryopreservation in liquid nitrogen,BC-Fin cells exhibit a viability of about (90.09±4.65) % with trypan blue staining.Chromosome analysis of BC-Fin cell line revealed that the chromosome number was diploid (2n=48) at the 16(th) passage,and the chromosome modal number is 46 at the 41(th) passage.16S rRNA amplification,sequencing and analysis showed that the cloned fragment sequence has 98% identity with the mitochondrial 16S rRNA of black carp.The results of virus sensitivity test indicated that BC-Fin cell line is susceptible to the infection of Grass carp reovirus (GCRV),a characteristic viral-induced cytopathic effect (CPE) is observed and the viral titer (TCID(50)/mL) reaches about 10(5.33±0.21).Moreover,PCR detection demonstrats that the targeted gene can be amplified by using specific primers.

Key words：Mylopharyngodon piceus;fin;cell line;biological characterization;viral susceptibility

中圖分類號：S917.42

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)02-0003-07

作者簡介：第一張雪萍(1988-)，女，碩士研究生，專業(yè)方向為魚類細(xì)胞培養(yǎng)及病害研究。E-mail:zhangxueping.2882@163.com通訊作者：曾令兵。E-mail:zlb@yfi.ac.cn.

收稿日期：2015-03-25；

修訂日期：2015-12-09

資助項目：國家“現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金”(nycytx-46-11)；浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開發(fā)技術(shù)研究重點實驗室開放基金資助課題(SS201403)