邱珊蓮，張少平，翁伯琦，羅　濤，林霜霜，何炎森*

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，福建漳州363005；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，福州350003；3.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，福州350003）

?

雞糞菌渣好氧堆肥過程中氨氧化古菌及氨氧化細(xì)菌群落的動態(tài)變化

邱珊蓮1，張少平1，翁伯琦2，羅濤3，林霜霜1，何炎森1*

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，福建漳州363005；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，福州350003；3.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，福州350003）

摘要：以amoA基因?yàn)闃?biāo)記，通過Real-Time PCR和限制性片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）法對雞糞菌渣好氧堆肥過程中的氨氧化古菌（Ammonia-oxidizing archaea, AOA）和氨氧化細(xì)菌（Ammonia-oxidizing bacteria, AOB）進(jìn)行了豐度及群落結(jié)構(gòu)的分析。結(jié)果表明，在堆制初期、好氧發(fā)酵高溫期及后熟期，AOB的amoA基因豐度均占主導(dǎo)優(yōu)勢，是AOA的38～992倍。進(jìn)入好氧發(fā)酵高溫期，AOA amoA基因豐度下降至發(fā)酵前的0.9%，AOB下降至17.6%，后熟期AOA與AOB的amoA基因豐度與好氧發(fā)酵高溫期相當(dāng)。在上述3個階段AOA與AOB各自存在一個絕對優(yōu)勢菌群，分別為Cluster 3和Nitrosomonas europaea，其中Cluster 3克隆子數(shù)目分別占整個克隆文庫的70.73%、54.28%、72.45%，Nitrosomonas europaea克隆子數(shù)目分別占整個克隆文庫的78.44%、93.20%、94.27%。堆肥3個階段AOA的多樣性指數(shù)變化不大，Shannon-Wiener值維持在1.53～1.60，但群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯演替，隨著堆肥溫度升高，堆肥前期的一些菌群（Cluster 4、Cluster 5、Cluster 6）逐漸消失，新的菌群Cluster 1出現(xiàn)并成為堆肥中后期的第二大優(yōu)勢菌群。AOB無論是多樣性指數(shù)還是群落組成，都發(fā)生劇烈的變化。AOB在堆肥前期Shannon-Wiener指數(shù)值最大（1.47），種群數(shù)最多（6個基因簇，分別為Nitrosomonas europaea Cluster，Nitrosomonas halophila Cluster，Nitrosomonas communis Cluster，Nitrosomonas nitrosa Cluster，Nitrosospira briensis Cluster，Nitrosospira multiformis Cluster）；進(jìn)入高溫發(fā)酵期，Shannon-Wiener下降至0.45，群落結(jié)構(gòu)單一，只有Nitrosomonas europaea Cluster和Nitrosomonas halophila Cluster；進(jìn)入后熟期，AOB多樣性及種群數(shù)得到一定程度的回升。

關(guān)鍵詞：堆肥；RFLP；氨氧化古菌；氨氧化細(xì)菌；豐度；群落結(jié)構(gòu)

邱珊蓮，張少平，翁伯琦，等.雞糞菌渣好氧堆肥過程中氨氧化古菌及氨氧化細(xì)菌群落的動態(tài)變化[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2016, 35（3）：573-583.

QIU Shan-lian, ZHANG Shao-ping, WENG Bo-qi, et al. Dynamics of ammonia-oxidizing archaea and ammonia-oxidizing bacteria during composting of chicken manure and mushroom cultural waste[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2016, 35（3）:573-583.

隨著我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)向規(guī)模化、集約化的快速轉(zhuǎn)變，畜禽糞便排放量呈逐年上升的趨勢，預(yù)計(jì)到2015年將達(dá)到60億t[1]，給環(huán)境帶來巨大的壓力。同時，食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展會產(chǎn)生大量的菌渣，不加以利用也會造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。用上述兩種農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)有機(jī)肥既可實(shí)現(xiàn)廢棄物的資源化利用又可避免環(huán)境污染。好氧堆肥是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)固體有機(jī)廢棄物無害化、減量化和資源化利用的主要途徑[2]。但堆肥化過程會造成不同程度的氮素?fù)p失[3-4]，一般氮素?fù)p失量為初始總氮的16%～76%[5]，其損失途徑包括氨氣揮發(fā)、氧化亞氮和氮?dú)馀欧拧⒘苋艿刃问?，其中以氨氣揮發(fā)形式損失的氮素可達(dá)氮素總損失量的44%～99%[4]。氮素?fù)p失不僅降低了堆肥的質(zhì)量，還導(dǎo)致二次污染。研究農(nóng)業(yè)廢棄物在堆肥過程的氮素循環(huán)及微生物種群特征，對于選擇保護(hù)環(huán)境措施及提高堆肥質(zhì)量至關(guān)重要。硝化作用是氮循環(huán)的一個重要過程，包括氨氧化和亞硝酸鹽氧化作用，其中氨氧化是硝化作用的關(guān)鍵限速步驟[6]，主要由氨氧化細(xì)菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）完成。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者以16S rRNA基因或amoA基因?yàn)闃?biāo)記，對堆肥過程中AOB和AOA群落進(jìn)行了研究。Zeng等[7]發(fā)現(xiàn)在農(nóng)業(yè)廢棄物堆肥全過程中，AOA和AOB的amoA基因豐度與潛在的氨氧化作用都存在線性相關(guān)，表明AOA和AOB均活躍地參與了堆肥過程的硝化作用。Yamamoto等[8]研究發(fā)現(xiàn)在牛糞、雞糞及豬糞三種糞便堆肥過程中均檢測到AOB數(shù)量明顯高于AOA。Yamada等[9]在銨含量較高的牛糞堆肥過程中未能檢測到AOA。虞泳等[10]在農(nóng)業(yè)廢物好氧堆肥研究中發(fā)現(xiàn)AOB優(yōu)勢種群為Nitrosospira 和Nitrosomonas，其中Nitrosomonas存在于堆肥全程，耐受性較強(qiáng)。研究堆肥環(huán)境中AOB和AOA的種群特征及動態(tài)變化對于理解堆肥中的氮素循環(huán)有著積極作用。本研究采用Real-Time PCR、RFLP技術(shù)，對菌-禽業(yè)廢棄物堆肥化過程中物料混合后發(fā)酵前、翻堆發(fā)酵階段、堆置后熟階段3個時期的AOB和AOA群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，深入了解堆肥系統(tǒng)中微生物的演替規(guī)律，探析微生物與堆肥養(yǎng)分轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系，這將有助于通過改變工藝參數(shù)等方法調(diào)控AOA和AOB的群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高硝化速率，減少氮素?fù)p失。

1　材料與方法

1.1堆肥過程及采樣介紹

供試樣品為菌-禽業(yè)廢棄物堆肥，采自福建漳州龍海市農(nóng)豐源肥料有限公司，堆肥物料由雞糞（水分76%，重量占65%）、菌渣（袖珍菇渣、木耳渣混合物料，水分30%，重量占25%）和油土（制油下腳料，水分5%，重量占10%）組成?？偦旌习l(fā)酵物料水分含量58.1%。雞糞來源于龍海騰龍養(yǎng)雞場，袖珍菇渣和木耳渣分別由漳州寶鴻生物科技有限公司和龍海市程溪鎮(zhèn)建國食用菌場提供，油土來源于廣東華美油脂有限公司。

堆肥工藝：根據(jù)上述配方，每批總物料重量70 t。用鏟車攪拌混合各種物料后，輸送到發(fā)酵槽（長54 m、寬3.65 m、高1.1 m）內(nèi)，堆放0.8 m高。前8 d內(nèi)每2 d翻堆1次，接著每天翻堆1次。采用自動翻料設(shè)備（電機(jī)功率30 kW，翻堆主軸轉(zhuǎn)速為480 r·min-1），翻料機(jī)工作時，機(jī)器沿槽頂鋼軌從出料口端向進(jìn)料口方向行走翻動物料，每次翻料機(jī)往返用時1 h。翻料發(fā)酵15 d后全部移出，倉式靜態(tài)二次發(fā)酵后熟化30 d。自物料混合始計(jì)時，堆肥總天數(shù)為45 d。

堆肥取樣時間：（1）各種物料混合后發(fā)酵前（樣品Ⅰ），代表堆肥堆制起始階段，還未進(jìn)入發(fā)酵升溫階段；（2）發(fā)酵15 d后堆置熟化前（樣品Ⅱ），代表堆肥用翻料機(jī)翻料發(fā)酵階段結(jié)束，即好氧動態(tài)發(fā)酵（一次發(fā)酵）末期，但還未進(jìn)入倉式靜態(tài)二次發(fā)酵階段；（3）堆置熟化20 d后（樣品Ⅲ），代表堆肥靜態(tài)二次發(fā)酵高溫階段后期（后熟階段）。采用多點(diǎn)混合法進(jìn)行取樣，理化性質(zhì)見表1。

1.2樣品理化指標(biāo)分析

用針插式溫度計(jì)測定堆體中層取樣位置處堆體溫度。肥料樣品在105℃烘干至恒重測定含水率。銨態(tài)氮（NH+4-N，ammonia nitrogen）和硝態(tài)氮（NO-3-N，nitrate nitrogen）以靛酚藍(lán)比色法和酚二磺酸比色方法進(jìn)行測定[11]。按1：10的質(zhì)量比向堆肥樣品中加入去離子水，180 r·min-1室溫振蕩30 min，5000 r· min-1離心5 min，測定上清液的pH值。有機(jī)質(zhì)測定采用重鉻酸鉀氧化-容量法；全氮用凱氏法；全磷用NaOH熔融-鉬藍(lán)比色法；全鉀用NaOH熔融-火焰光度法[12]。

1.3堆肥總DNA提取及基因擴(kuò)增

堆肥總DNA的提取參見文獻(xiàn)[13]。AOB的引物對為amoA-1F/amoA-2R[14]，AOA的引物對為ArchamoAF/Arch-amoAR[15]。

反應(yīng)體系：12.5 μL Premix TaqTM（TaKaRa），0.4 mg·mL-1BSA（TaKaRa），上下游引物各400 nmol·L-1（AOB）/200 nmol·L-1（AOA），1 μL總DNA模板，以滅菌的去離子水補(bǔ)足25 μL。

反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃30 s，40個循環(huán)的95℃變性10 s，AOB 57℃/AOA 63℃退火25 s，72℃延伸45 s，最后72℃延伸3 min[16]。

1.4amoA的定量PCR

定量PCR采用SYBY Green法，AOA/AOB選用引物同上。擴(kuò)增體系及程序參見文獻(xiàn)[17]。

1.5amoA基因的克隆文庫構(gòu)建、RFLP分析、測序與系統(tǒng)發(fā)育分析

使用磁珠法DNA膠回收試劑盒（Sangon，上海）純化試劑盒對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化，將PCR回收產(chǎn)物與pMD19-T載體（TaKaRa，大連）進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。采用菌落PCR鑒定陽性克隆，引物為載體引物RV-M 和M13-47，每個樣品選取約200個經(jīng)鑒定為陽性克隆子的amoA基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行RFLP分析，分別用2種限制性內(nèi)切酶Msp I和Hha I對PCR產(chǎn)物進(jìn)行37℃酶切60 min，綜合雙酶切圖譜，將陽性克隆分成若干個操作分類單元（OTU），統(tǒng)計(jì)OTU種類和各OTU所含陽性克隆的數(shù)量，從每個樣品所含的每個OTU類型中挑取1～3個陽性克隆進(jìn)行測序（鉑尚生物科技有限公司，上海）。應(yīng)用Bioedit軟件對測序結(jié)果進(jìn)行編輯，去除載體序列后用BLAST在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，選取相近序列，使用MEGA 5軟件中Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

amoA基因序列提交GenBank，AOA的amoA基因登錄號為：KT595982-KT596043，AOB的amoA基因登錄號為：KT595940-KT595981。

2　結(jié)果

2.1堆肥養(yǎng)分在發(fā)酵過程中的變化

隨著堆肥進(jìn)入發(fā)酵期，堆體溫度持續(xù)上升，堆肥中后期可達(dá)60℃以上，高溫期（＞55℃）時間有40 d（圖1）。長時間的高溫加速了堆肥水分的蒸發(fā)，進(jìn)而導(dǎo)致堆肥的含水量呈下降趨勢（表1），但堆肥pH值變化小，基本維持在弱堿性水平。隨著堆肥的進(jìn)行，有機(jī)質(zhì)含量因微生物的不斷分解而降低，前15 d下降幅度較小，至堆肥35 d后下降幅度很明顯。總氮、總磷、總鉀含量經(jīng)發(fā)酵后有所提升，NH+4-N和NO-3-N含量在進(jìn)入高溫發(fā)酵階段后急劇上升，由發(fā)酵階段到后熟階段含量略有提高。

表1　堆肥理化性質(zhì)變化Table 1 Changes in physical and chemical properties during composting

圖1　堆肥過程中堆體溫度的變化Figure 1 Changes of temperature in compost pile during composting

2.2AOA和AOB amoA基因的相對豐度變化

如表2所示，在堆肥的3個階段，樣品中AOB的amoA基因拷貝數(shù)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于AOA，是AOA的38～992倍，但兩者進(jìn)入一次發(fā)酵高溫階段時，豐度均急劇下降，且AOA amoA基因拷貝數(shù)減少幅度更大，AOA amoA基因豐度下降至原來的0.9%，AOB下降至原來的17.6%。后熟階段AOA與AOB的amoA基因豐度與高溫發(fā)酵期相差不明顯。

表2　堆肥過程中AOA與AOB amoA基因拷貝數(shù)（個·g-1soil）Table 2 amoA gene copy numbers of ammonia-oxidizing archaea and ammonia-oxidizing bacteria during composting（amoA gene copy number·g-1soil）

2.3AOA與AOB amoA基因的RFLP分析

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ樣品酶切所用的AOA陽性克隆子數(shù)目分別181、210、207，AOB陽性克隆子數(shù)目分別為204、206、192。綜合雙酶切圖譜，將陽性克隆分成若干個操作分類單元（OTU），統(tǒng)計(jì)OTU種類和各OTU所含陽性克隆的數(shù)量及百分率，得到OTU的分布圖。3個樣品綜合統(tǒng)計(jì)，AOA amoA基因共得到26個OTU（圖2a），其中Ⅰ樣品含有14個OTU，Ⅱ樣品含有14個OTU，Ⅲ樣品含有12個OTU；AOB amoA基因共得到29個OTU（圖2b），其中Ⅰ樣品含有20個OTU，Ⅱ樣品含有7個OTU，Ⅲ樣品含有12個OTU。對于AOA，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ存在一個共同的優(yōu)勢類群，即A10，但隨著發(fā)酵和熟化過程，A10優(yōu)勢效應(yīng)減弱，從堆肥前期的59.12%到發(fā)酵后的47.14%再到熟化后的36.71%，并且經(jīng)發(fā)酵后新出現(xiàn)的OTU A5成為第二優(yōu)勢類群，占22.38%，再經(jīng)過熟化階段，A10、A3、A5分別成為第一、第二、第三優(yōu)勢類群，分別占36.71%、30.43%及19.81%。雖然AOA在堆肥發(fā)酵過程中其OTU類型也存在此消彼長的情況，但是總的OTU類型數(shù)較為穩(wěn)定，數(shù)量范圍維持在12～14，并且多樣性變化不大，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ階段的Shannon-Wiener指數(shù)分別為1.53、1.60、1.55，Evenness指數(shù)分別為0.58、0.61、0.63（表3）。

對于AOB，堆制前期、一次發(fā)酵高溫期及后熟期均以B4為優(yōu)勢類群，經(jīng)發(fā)酵后這種集中優(yōu)勢更明顯，并且經(jīng)發(fā)酵后，發(fā)酵前的大多數(shù)OTU（17個）消失，新出現(xiàn)4個OTU：B13、B16、B21及B22。再經(jīng)過腐熟階段，AOB OTU的數(shù)量得到增加，與Ⅱ階段相比，新出現(xiàn)6個OTU類型，消失1個OTU類型。根據(jù)OTU分布特征，得到表3，堆肥Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ樣品的AOB amoA文庫覆蓋率分別為94.61%、99.03%、97.92%，Shannon-Wiener指數(shù)分別為1.47、0.45、0.74（表3），表明AOB在發(fā)酵前具有最豐富的多樣性，而在發(fā)酵后熟化前多樣性最低。

2.4AOA與AOB amoA系統(tǒng)發(fā)育樹分析

從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，本研究所獲得的AOA amoA功能基因分為6個簇（圖3），樣品Ⅰ的14個OTU分布于5個簇（Cluster 2，3，4，5，6），樣品Ⅱ的14 個OTU分布于4個簇（Cluster 1，2，3，6），樣品Ⅲ的12個OTU分布于2個簇（Cluster 1和3）。在6個簇中，Cluster 3含有最多類型的OTU（12種），3個樣品中其克隆子數(shù)目占整個克隆文庫的半數(shù)以上，其中樣品Ⅰ70.73%，樣品Ⅱ54.28%，樣品Ⅲ72.45%（圖4），Cluster 3是最大的優(yōu)勢菌群，根據(jù)BLAST結(jié)果，其包含的序列與來自河流、水庫、湖泊沉積物的AOA amoA基因序列相似性最高。Cluster 1沒有出現(xiàn)樣品Ⅰ的OTU，樣品Ⅱ和樣品Ⅲ分別有6種和4種OTU隸屬于Cluster 1（表4），其克隆子數(shù)目分別占整個克隆文庫的32.39%和27.55%（圖4），是發(fā)酵和熟化階段的第二大優(yōu)勢菌群，其包含的序列與來自動物糞便堆肥的AOA amoA基因序列同源性最高。

圖2　各樣品中AOA（a）及AOB（b）amoA克隆子的OTU分布Figure 2 OTUs distribution of amoA clones of ammonia-oxidizing archaea（a）and ammonia-oxidizing bacteria（b）in samples

表3　AOA與AOB克隆文庫的多樣性Table 3 Diversity of amoA clone library of ammonia-oxidizing archaea and ammonia-oxidizing bacteria

AOB amoA功能基因分為Nitrosomonas和Nitrosospira2個分支，Nitrosomonas細(xì)分為4個簇（圖5），分別為Nitrosomonas europaea Cluster，Nitrosomonas halophilaCluster，Nitrosomonas communis Cluster，Nitrosomonas nitrosa Cluster，Nitrosospira細(xì)分為3個簇，分別為Unkown Nitrosospira Cluster，Nitrosospira briensis Cluster，Nitrosospira multiformis Cluster。AOB amoA基因的29個OTU中有16個（55.17%）分布在Nitrosomonas europaea Cluster（表5），Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3個樣品中其克隆子數(shù)目分別占整個克隆文庫的78.44%、93.20%、94.27%（圖6），是堆肥3個階段的絕對優(yōu)勢菌，而且隨著堆肥時間的延長，優(yōu)勢效應(yīng)更加明顯和集中。堆肥各物料混合后發(fā)酵前AOB種類最為豐富，其含有的20個OTUs在Nitrosomonas所含的4個簇中均有分布，在Nitrosospira所含的Nitrosospira briensis Cluster和Nitrosospira multiformis Cluster中也有分布（表5、圖6），而經(jīng)一次高溫發(fā)酵后，Nitrosospira消失，只存在Nitrosomonas europaea Cluster及Nitrosomonas halophila Cluster，再到熟化階段，有少量的Unkown Nitrosospira Cluster出現(xiàn)。這些結(jié)果表明，Nitrosomonas europaea與Nitrosomonas halophila對堆肥環(huán)境條件的變化較不敏感，是耐受性較強(qiáng)的種屬，而Nitrosospira是對環(huán)境變化較敏感的種屬。

圖3　基于amoA功能基因序列構(gòu)建的AOA系統(tǒng)發(fā)育樹（鄰接法）Figure 3 Neighbour-joining tree of ammonia-oxidizing archaea based on amoA sequences

圖4　各樣品AOA群落組成Figure 4 Composition of ammonia-oxidizing archaea communities in three samples

表4　AOA OTUs在6個簇中的分布Table 4 OTUs distribution in six clusters of ammonia-oxidizing archaea

3　討論

隨著堆肥時間的進(jìn)行，除pH外，堆肥的理化性質(zhì)變化明顯。堆肥營養(yǎng)元素的變化與微生物的活動密不可分。隨著堆肥升溫，一些簡單、易分解的有機(jī)質(zhì)被微生物分解導(dǎo)致有機(jī)質(zhì)含量略微下降，到高溫的中后期，有機(jī)質(zhì)被大量分解，引起有機(jī)質(zhì)含量的明顯下降?？偟⒖偭?、總鉀均呈遞增趨勢，與有機(jī)質(zhì)分解導(dǎo)致總干物質(zhì)重量下降有關(guān)?？偟纳弑砻饔砂睋]發(fā)、氧化亞氮及氮?dú)馀欧牛ǚ聪趸┰斐傻牡負(fù)p失并不大。堆肥中氨化微生物將有機(jī)含氮化合物不斷分解產(chǎn)生氨，但大于50℃高溫下氨氧化微生物及亞硝酸鹽氧化微生物被抑制且硝化作用基本停止[18]，因而引起NH+4-N濃度持續(xù)上升，并引起NO-3-N濃度在堆肥升溫階段增加明顯，但在高溫期穩(wěn)定。

在本研究堆肥的3個取樣階段，AOB的amoA基因拷貝數(shù)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于AOA，與Yamamoto等[8]的研究結(jié)果一致，Yamamoto等通過實(shí)時熒光定量PCR研究發(fā)現(xiàn)在牛糞、雞糞、豬糞堆肥過程中AOB數(shù)量明顯高于AOA。這些結(jié)果表明，AOB可能比AOA更適合生存于畜禽糞便堆肥的環(huán)境?？茖W(xué)家們總結(jié)發(fā)現(xiàn)在低有機(jī)質(zhì)含量的環(huán)境中，如土壤、海洋/河流沉積物等，AOA比AOB對硝化作用的貢獻(xiàn)更大[19-21]，而在富含有機(jī)質(zhì)的環(huán)境中，例如廢水處理系統(tǒng)、動物糞便堆肥等，AOB比AOA對硝化作用顯得更為重要[9，19，22]。這種分布差異可能與環(huán)境中的銨離子濃度有直接的關(guān)系[23]。Di等[24]研究發(fā)現(xiàn)AOB可以在高銨離子濃度的土壤中生長，而AOA適于在較低銨離子濃度的土壤中生長；Wuchter等[25]研究結(jié)果表明，AOA的amoA基因數(shù)量與海水中銨態(tài)氮的濃度顯著負(fù)相關(guān)。在本研究中，高銨離子濃度可能是導(dǎo)致AOA豐度低的一個關(guān)鍵因素。當(dāng)雞糞菌渣好氧堆肥進(jìn)入一次發(fā)酵高溫期時，無論AOA還是AOB，amoA基因拷貝數(shù)均發(fā)生急劇的變化，均明顯降低，AOA數(shù)量減少更為顯著。氨氧化微生物豐度的減少與溫度、pH、NH+4-N濃度、NO-3-N濃度等外界環(huán)境因素變化有著密切的聯(lián)系。溫度是影響微生物生長和生存的最主要的環(huán)境因素之一[26]，隨著堆肥的發(fā)酵，堆體的溫度持續(xù)上升，至采樣時達(dá)到60℃以上，此時只有對高溫耐受性強(qiáng)的氨氧化微生物得以生存和繁殖，而對高溫耐受性差的被高溫所抑制和淘汰。另外，發(fā)酵過程中NH+4-N濃度的大幅升高可能也是導(dǎo)致AOA比AOB數(shù)量降幅更大的一個重要因素。從一次發(fā)酵高溫期進(jìn)入后熟期，AOA及AOB的豐度變化均不顯著，AOA豐度仍呈現(xiàn)下降趨勢（22.99%），可能是由于NH+4-N濃度仍在升高，而AOB豐度變化甚微（上升4.65%），可能與其耐銨性有關(guān)。

圖5　基于amoA功能基因序列構(gòu)建的AOB系統(tǒng)發(fā)育樹（鄰接法）Figure 5 Neighbour-joining tree of ammonia-oxidizing bacteria based on amoA sequences

表5　AOB OTUs在7個簇中的分布Table 5 OTUs distribution in seven clusters of ammonia-oxidizing bacteria

圖6　各樣品AOB群落組成Figure 6 Composition of ammonia-oxidizing bacteria communities in three samples

本研究堆肥過程不僅氨氧化微生物的豐度發(fā)生了急劇的變化，AOA及AOB的群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生了明顯的演替。AOA的多樣性指數(shù)雖然在堆肥前期、發(fā)酵期及后熟期變化不明顯，但是群落組成在各個時期卻明顯不同，從堆制前期至一次發(fā)酵高溫階段，Cluster 4 和Cluster 5消失，但新增一個優(yōu)勢菌群Cluster 1，該菌群與GenBank中來源于動物糞便堆肥的amoA序列相似性最高。這些結(jié)果表明Cluster 1可能是動物糞便堆肥高溫期特有的優(yōu)勢菌。從一次發(fā)酵高溫階段至后熟階段，Cluster 2和Cluster 6也消失，群落組成只剩Cluster 1和Cluster 3。解開治等[27]研究表明，堆體溫度、總氮、NO-2-N和NO-3-N這4種環(huán)境因子對AOA群落結(jié)構(gòu)演替影響顯著；Auguet等[28]研究表明，氨氧化過程中間接底物（銨）和產(chǎn)物（硝酸鹽）濃度變化會導(dǎo)致AOA相對豐度和多樣性的變化。結(jié)合本研究表1、圖1分析，AOA群落結(jié)構(gòu)的演替可能與長時間持續(xù)高溫及NH+4-N濃度升高密切相關(guān)，但具體與哪一個堆肥理化指標(biāo)關(guān)系更大，還需要在堆肥過程中更多的時間點(diǎn)上采集更多的樣品來測定及分析，這也將成為我們下一步的工作目標(biāo)。

堆肥過程中AOB多樣性變化很劇烈，在堆肥前期，OTUs、Shannon-Wiener指數(shù)及Evenness指數(shù)值最高，其次為后熟期，高溫發(fā)酵期多樣性最低。群落結(jié)構(gòu)的演替也表現(xiàn)很劇烈，堆制前期種群最豐富，由Nitrosomonas的4個簇和Nitrosospira的2個簇組成，到高溫發(fā)酵15 d后只剩Nitrosomonas europaea及Nitrosomonas halopihila 2個簇。群落物種數(shù)的大幅減少可能與堆肥理化性質(zhì)的明顯變化密切相關(guān)，從堆制前期到一次發(fā)酵高溫期，堆體溫度、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、總氮等均大幅提高，而一次發(fā)酵高溫期與后熟期AOB的群落結(jié)構(gòu)較相似，可能是由于這2個階段堆肥的各個理化性質(zhì)相差并不大。在堆肥取樣的3個階段，Nitrosomonas均占據(jù)主導(dǎo)地位，樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別有88.24%、100%、99.48%的AOB種群屬于Nitrosomonas（圖6），在Nitrosomonas分支內(nèi)又以Nitrosomonas europaea為優(yōu)勢種群。虞泳等[10]發(fā)現(xiàn)Nitrosomonas和Nitrosospira是農(nóng)業(yè)廢物好氧堆肥AOB優(yōu)勢種屬，其中Nitrosomonas存在于堆肥全程，是耐受性較強(qiáng)的種屬，并且通過冗余分析發(fā)現(xiàn)堆體溫度、NH+4-N、NO-3-N 對AOB群落演替影響顯著（P＜0.05），其中溫度、NH+4-N的影響達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01）。Yan等[29]研究表明，在城市污泥堆肥全程AOB均以Nitrosomonas為優(yōu)勢種群；Yamamoto等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在牛糞堆肥過程中AOB的優(yōu)勢種群主要為Nitrosomonas europaea；Gao等[31]研究發(fā)現(xiàn)10個廢水處理系統(tǒng)也是以Nitrosomonas europaea為AOB的優(yōu)勢種群。許多研究結(jié)果表明，在堆肥高溫階段，均以Nitrosomonas europaea為優(yōu)勢種群[8，30，32-33]，并且發(fā)現(xiàn)Nitrosomonas europaea是一個耐受高NH+4-N濃度的菌群[30，34-35]。本研究與以上的研究報道具有高度的一致性，但是仍然需要進(jìn)一步加強(qiáng)群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的研究，更深入揭示堆肥中氮循環(huán)規(guī)律，以期減少氮的損失。

4　結(jié)論

（1）在雞糞菌渣堆肥化的堆制前期、一次發(fā)酵高溫期、后熟期的三階段，AOB的豐度均遠(yuǎn)高于AOA，在發(fā)酵15 d后，與物料混合后發(fā)酵前相比，AOA及AOB豐度均急劇下降，AOA下降幅度更大。

（2）在堆肥的三個階段，AOA多樣性指數(shù)變化不大，群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯演替，但均以Cluster 3為絕對優(yōu)勢菌群，Cluster 1成為發(fā)酵期和熟化期第二大優(yōu)勢菌群。

（3）AOB多樣性指數(shù)及群落組成均隨發(fā)酵時間發(fā)生劇烈變化。在發(fā)酵前多樣性指數(shù)最高，種群最豐富，發(fā)酵后熟化前多樣性指數(shù)最低，種群最少，至后熟階段，多樣性和種群得到一定程度恢復(fù)。Nitrosomonas europaea是堆肥三個階段的絕對優(yōu)勢菌。

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Dynamics of ammonia -oxidizing archaea and ammonia -oxidizing bacteria during composting of chicken manure and mushroom cultural waste

QIU Shan-lian1, ZHANG Shao-ping1, WENG Bo-qi2, LUO Tao3, LIN Shuang-shuang1, HE Yan-sen1*
（1.Institute of Subtropical Agriculture, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Zhangzhou 363005, China; 2.Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China; 3.Soil and Fertilizer Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China）

Abstract：The transformation and loss of nitrogen in composting materials were affected profoundly by ammonia oxidizers during the composting process. The abundance and composition of ammonia-oxidizing bacteria（AOB）and ammonia-oxidizing archaea（AOA）during composting of chicken manure and mushroom cultural waste were examined employing Real-Time PCR and PCR-restriction fragment length polymorphism（RFLP）techniques with the monooxygenase gene（amoA）as biomarker of ammonia oxidizers. Samples were collected at three representative stages, including mesophilic, thermophilic, and maturing stages. Results showed that the amoA gene abundance of AOB dominated and the gene copy numbers were about 38 to 992 times those of AOA at all three stages of composting. At the thermophilic stage, thebook=574,ebook=172amoA abundance of both AOA and AOB dropped to 0.9% and 17.6% of that at the mesophilic stage, respectively. The numbers of AOA and AOB at the maturing stage were similar to those at the thermophilic stage. Cluster 3 was the most dominant group of AOA at the three stages, and its amount of clones accounted for 70.73% of the clone library at the mesophilic stage of composting, 54.28% at the thermophilic stage, and 72.45% at the maturing stage. Nitrosomonas europaea was the most dominant species of AOB at the three stages, with clone amount representing 78.44%, 93.20% and 94.27% of all clones at mesophilic, thermophilic, and maturing stage, respectively. For AOA, the Shannon-Wiener index ranged from 1.53 to 1.60 at these three stages, showing no obvious changes, but the community composition revealed obvious succession. With increase in compost temperature, Cluster 4, Cluster 5 and Cluster 6 of AOA disappeared, but a novel member（Cluster 1）appeared and became the second dominant group. For AOB, both diversity and community structure showed dramatic changes. At the mesophilic stage, AOB gave the highest Shannon-Wiener index（1.47）and the richest number of species, with 6 clusters including Nitrosomonas europaea，Nitrosomonas halophila，Nitrosomonas communis，Nitrosomonas nitrosa，Nitrosospira briensis，and Nitrosospira multiformis clusters. However, with arrival of thermophilic stage, the Shannon-Wiener index of AOB sharply reduced to 0.45, and the community structure became simple, including Nitrosomonas europaea and Nitrosomonas halophila clusters. At the maturing stage, the diversity and species number of AOB recovered to some extent.

Keywords：compost; RFLP; ammonia-oxidizing archaea; ammonia-oxidizing bacteria; abundance; community structure

*通信作者：何炎森E-mail：heyansen1968@126.com

作者簡介：邱珊蓮（1979—），女，福建武平人，博士，副研究員，主要從事環(huán)境微生物研究。E-mail：slqiu79@163.com

基金項(xiàng)目：國家“十二五”科技支撐計(jì)劃（2012BAD14B15）；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才計(jì)劃項(xiàng)目（YC2015-19）

收稿日期：2015-10-12

中圖分類號：X713

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1672-2043（2016）03-0573-11

doi:10.11654/jaes.2016.03.022