劉曉靜，胡星星，鄧 波，段 鵬，朱慶磊

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KATP開(kāi)放劑對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡和向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化心肌標(biāo)志物的影響

劉曉靜，胡星星，鄧 波，段 鵬，朱慶磊*

（解放軍總醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100853）

研究KATP開(kāi)放劑對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）凋亡和向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化心肌標(biāo)志物的影響。培養(yǎng)4周雄性SD大鼠的BM-MSCs，以二氮嗪（Dia）和吡那地爾（Pin）預(yù)處理細(xì)胞，H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。在KATP開(kāi)放劑處理2h后提取各組細(xì)胞總mRNA，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)心肌特異基因肌鈣蛋白I（cTnI）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、縫隙連接蛋白43（Cx43）以及α重鏈蛋白（α-MHC）的mRNA表達(dá)情況。提取細(xì)胞蛋白，Western印跡法檢測(cè)cTnI、CK、CK-MB蛋白的表達(dá)情況。Dia和Pin 50mol/L預(yù)處理可明顯降低BM-MSCs凋亡率（＜0.05）。Dia和Pin處理2h，能使BM-MSCs的cTnI、CK、Cx43 mRNA表達(dá)顯著增加（＜0.05）；同時(shí)明顯增加CK、CK-MB蛋白表達(dá)（＜0.05）。Dia和Pin能增加BM-MSCs向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化心肌標(biāo)志物的表達(dá)，并具有抗凋亡的作用。

二氮嗪；吡那地爾；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；凋亡

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）是一種具有多向分化潛能的細(xì)胞，具有強(qiáng)大的自我復(fù)制能力和多向分化潛能，可以在不同的誘導(dǎo)條件下分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等，被認(rèn)為是組織工程/再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中重要的種子細(xì)胞和基因治療中理想的靶細(xì)胞[1]。但是，當(dāng)BM-MSCs被植入體內(nèi)時(shí)，會(huì)受到各種誘導(dǎo)條件及體內(nèi)環(huán)境的限制，使得移植細(xì)胞的存活率和轉(zhuǎn)化率均不高[2]。如何優(yōu)化BM-MSCs向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率以及如何提高轉(zhuǎn)化的心肌細(xì)胞在受損心肌組織內(nèi)的存活率和滯留率，是利用BM-MSCs移植治療心力衰竭研究中亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

二氮嗪（diazoxide，Dia）和吡那地爾（pinacidil，Pin）是ATP敏感性鉀離子通道（ATP sensitive potassium channel，KATP）開(kāi)放劑中的兩種，可以特異性激活KATP，提高缺氧耐受性，產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)的作用[3]。有研究表明[4]，Pin能升高人胚胎干細(xì)胞的生存率。Dia和Pin能否提高BM-MSCs的存活率以及能否促進(jìn)BM-MSCs向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，均未見(jiàn)報(bào)道。本文則研究了KATP開(kāi)放劑對(duì)BM-MSCs存活率和向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化心肌標(biāo)志物的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

低糖?DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶?EDTA（HycLone，美國(guó)），胎牛血清（Gibco，美國(guó)），Dia、Pin、二甲基亞砜（Sigma公司，美國(guó)），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real time PCR試劑盒（ABI，美國(guó)），肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）和β?actin抗體（Cell Signaling，美國(guó)）。

1.2 BM-MSCs的分離和培養(yǎng)

取4周齡雄性SD大鼠1只，頸椎脫臼法處死，于75%乙醇浸泡10min。移入彎盤(pán)，剪開(kāi)雙后肢皮膚，盡量完整地剪下雙后肢的股骨和脛骨，去除骨頭上附著的肌肉筋膜等，PBS中浸泡。移入超凈工作臺(tái)，PBS沖洗2次，浸入低糖?DMEM培養(yǎng)基中。剪去雙側(cè)干骺端暴露骨髓腔，用新鮮完全培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓至骨頭發(fā)白，收集全部沖洗液于15ml離心管中，2 000轉(zhuǎn)/min，離心5min，棄去上清液，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于37℃、5%CO2恒溫孵箱中，培養(yǎng)1.5h后，移取皿中培養(yǎng)基入新的培養(yǎng)皿以去除已經(jīng)貼壁的成纖維細(xì)胞，并標(biāo)記為P0代。將P0代細(xì)胞置于37℃、5%CO2恒溫孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24h后半量換液，72h全量換液。以后每2～3d換液，每日置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和形態(tài)特征。80%～90%融合時(shí)傳代，備用。

1.3 凋亡率測(cè)定

實(shí)驗(yàn)分為3組。（1）對(duì)照組：加入H2O2終濃度為100μmol/L，孵育4h。（2）Pin組：在對(duì)照組的基礎(chǔ)上加入終濃度為50μmol/L的Pin，孵育2h。（3）Dia組：在對(duì)照組的基礎(chǔ)上加入終濃度為50μmol/L的Dia，孵育2h。

PBS清洗后，用胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，2 000轉(zhuǎn)/min離心5min倒掉上清液，加入300μL的1×結(jié)合緩沖液（binding buffer）重懸細(xì)胞，加入5μL的膜聯(lián)蛋白A5?異硫氰酸熒光素（Annexin Ⅴ-FITC）染液，混勻，避光室溫孵育15min后，加入5μL的碘化丙啶（propidine iodide，PI）染色，作用5min后加入200μL Binding Buffer，混勻，采用流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter公司，美國(guó)）進(jìn)行凋亡測(cè)定。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定

參考文獻(xiàn)[5]，以TRIzol（Life，美國(guó)）提取各組總RNA，NanoDrop2000測(cè)定RNA濃度后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。使用SYBR熒光試劑盒（ABI，美國(guó)），以1μl cDNA產(chǎn)物為模板，加入20μl反應(yīng)體系，采用ABI-7900 Real time PCR測(cè)定儀采集實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，QPCR）中SYBR熒光信號(hào)。以36β4基因作為內(nèi)參基因，所有樣本做3個(gè)平行復(fù)孔，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以2-△CT表示，引物序列如下。（1）36B4。Forword：5'CAGAGGTGCTGGACATCACAGAG3'。Reverse：5'GGCAACAGTCGGGTAGCCAATC3'。（2）CK。Forword：5'GGCTTCACTCTGGACGATGTCA3'。Reverse：5'GTCTTATGCTTGTCTGTGGGTTTG3'。（3）CK-MB。Forword：5'ATGTGGAATGAGCG-TTTAGGAT3'。Reverse：5'TCTTTGGGAAG- CGGCTATCTT3'。（4）心肌特異性肌鈣蛋白I（cardiac-specific troponin I，cTnI）。Forword：5'ATGACCTGCGTGGCAAGTTTAA3'。Reverse：5'TTCTCAATGTCCTCCTTCTTCACC3'。（5）縫隙連接蛋白43（connexin 43，Cx43）。Forword：5'ATTCGTGTCTGTGCCCACCCTC3'。Reverse：5'TCCCGTACTTGAACTTCTTGATTT3'。（6）α重鏈蛋白（α-heavy chain protein，α-MHC）。Forword：5'CAGAACACCAGCCTCATCAAC3'。Reverse：5'TTCTCCTCTGCGTTCCTACAC3'。

1.5 Western印跡測(cè)定

收集各組細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞的量加入相應(yīng)量的RIPA細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，重懸混勻后于冰上振蕩15min，再于4℃、15 000g離心20 min后，取上清，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度?？偟鞍咨蠘樱?0μg/孔），10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分離，采用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride membrane，PVDF）上，然后5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）于搖床上室溫封閉2h。按適當(dāng)比例用5%BSA稀釋配制一抗，4℃孵育過(guò)夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖液（TBS-Tween，TBST）漂洗3次，二抗室溫孵育2h，漂洗3次，化學(xué)熒光辣根過(guò)氧化物酶底物（chemiluminescent HRP subsrate，ECL）法發(fā)光，顯影并定影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)資料比較通過(guò)方差分析。＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 KATP開(kāi)放劑對(duì)BM-MSCs凋亡的影響

100mol/L的H2O2與BM-MSCs共孵育24h，可誘導(dǎo)BM-MSCs凋亡，凋亡率為66.9%。預(yù)先加入50mol/L KATP開(kāi)放劑Pin或者Dia，均可觀察到凋亡率的顯著下降（＜0.05），分別降低至37.7%和21.6%。提示Dia和Pin可以明顯降低BM-MSCs凋亡率（圖1）。

圖1 二氮嗪和吡那地爾對(duì)BM-MSCs凋亡率的影響

Figure 1 Effects of diazoxide and pinacidil on the apoptosis rate of BM-MSCs (＝6) BM-MSCs: bone marrow mesenchymal stem cells; Pin: pinacidil; Dia: diazoxide. Compared with control group,*＜0.05

2.2 KATP對(duì)心肌標(biāo)志物mRNA表達(dá)的影響

BM-MSCs經(jīng)Pin和Dia預(yù)處理后，心肌標(biāo)志物cTnI、Cx43、CK以及CK-MB的mRNA相對(duì)表達(dá)量均有明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05；圖2）。在Pin和Dia的作用下：cTnI mRNA表達(dá)分別增加16.8倍和11.5倍；Cx43 mRNA分別增加2.5倍和2.9倍；CK mRNA分別增加16.2倍和15.4倍；CK-MB mRNA分別增加15.0和13.8倍。提示Pin和Dia均可上調(diào)BM-MSCs心肌標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。

2.3 KATP對(duì)心肌標(biāo)志物蛋白表達(dá)的影響

以Pin和Dia 50mol/L預(yù)處理BM-MSCs 2h后，BM-MSCs中的CK和CK-MB蛋白表達(dá)水平均顯著增加（＜0.05；圖3）。在Pin和Dia的作用下：CK分別增加6.8倍和6.7倍；CK-MB分別增加6.7倍和5.4倍。提示Pin和Dia均可上調(diào)BM-MSCs心肌標(biāo)志物翻譯水平的表達(dá)。

3 討 論

BM-MSCs經(jīng)體外誘導(dǎo)后具有增殖分化為心肌樣細(xì)胞的能力，將其移植于缺血的心肌可明顯改善心功能。但是，BM-MSCs的低成活率和低轉(zhuǎn)化率限制了其治療效果和臨床應(yīng)用。缺血預(yù)處理能提高包括心臟在內(nèi)的多種組織器官的功能和耐受力，產(chǎn)生保護(hù)作用[6]。其中，KATP起關(guān)鍵作用[7]。KATP開(kāi)放劑包括比卡林（bimakalim）、Pin、阿普卡林（aprikalim）、Dia等[8]。Dia已經(jīng)被證實(shí)具有抗凋亡以及提高細(xì)胞生存率的作用[9]。Pin具有舒張血管、保護(hù)心臟以及抗低毒的作用。Barbaric等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Pin有提高人胚胎干細(xì)胞生存率的作用[11]。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們探討了在Pin和Dia干預(yù)下BM-MSCs的凋亡率、及向心肌細(xì)胞分化心肌標(biāo)志物的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)Dia以及Pin預(yù)處理的BM-MSCs能顯著降低凋亡率，提高存活率，為BM-MSCs進(jìn)一步發(fā)揮自身作用提供了可能。Dia可能是通過(guò)在凋亡早期促進(jìn)細(xì)胞色素c進(jìn)入細(xì)胞漿以及保持線粒體膜的完整性來(lái)發(fā)揮其抗凋亡效應(yīng)[12]。同時(shí)它還能增加缺氧狀況下肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF），堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的分泌，HGF以及bFGF能激活蛋白激酶B磷酸化，進(jìn)而起到促進(jìn)核因子κB（NF-κB）家族的作用，提高細(xì)胞生存率[13]。Pin可提高凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)，減輕缺血缺氧后的細(xì)胞凋亡[14]，且Pin能明顯減輕心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧時(shí)細(xì)胞內(nèi)的鈣超載[15]。這些可能是KATP開(kāi)放劑抗凋亡保護(hù)BM-MSCs的機(jī)制。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)Dia和Pin預(yù)處理能增加BM-MSCs心肌特異基因CK、CK-MB、cTnI、Cx43轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)。眾所周知，cTnI、肌鈣蛋白T、CK及CK-MB、Cx43等心肌特異性蛋白的表達(dá)增加，可作為BM-MSCs向心肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的一種表現(xiàn)，且Cx43是心臟組織的一種縫隙連接蛋白，參與維持心臟功能。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)其與細(xì)胞生存有關(guān)，可以用Cx43的表達(dá)水平來(lái)表示誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率[16,17]。我們的研究表明，Dia和Pin不僅對(duì)BM-MSCs有抗凋亡的作用，而且可增加BM-MSCs向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化心肌標(biāo)志物的表達(dá)，提示KATP開(kāi)放劑誘導(dǎo)了BM-MSCs向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。而KATP開(kāi)放劑是如何誘導(dǎo)BM-MSCs向心肌細(xì)胞的分化以及在整體動(dòng)物水平是否也能促進(jìn)BM-MSCs向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化等問(wèn)題仍需要進(jìn)一步地研究和探討。

圖2 二氮嗪和吡那地爾對(duì)BM-MSCs向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化心肌標(biāo)志物基因mRNA的影響

Figure 2 Effects of diazoxide and pinacidil on the mRNA level of cardiac biomarkers in trans-differentiation of BM-MSCs into cardiomyocytes (＝6) BM-MSCs: bone marrow mesenchymal stem cells; Pin: pinacidil; Dia: diazoxide; cTnI: cardiac-specific troponin I; CX43: connexin 43; CK: creatine kinase; CK-MB: creatine kinase isoenzyme. Compared with control group,*＜0.05

圖3 二氮嗪和吡那地爾對(duì)BM-MSCs CK和CK-MB蛋白表達(dá)的影響

Figure 3 Effects of diazoxide and pinacidil on the CK and CK-MB protein expression of BM-MSCs (＝6) BM-MSCs: bone marrow mesenchymal stem cells; Pin: pinacidil; Dia: diazoxide; CK: creatine kinase; CK-MB: creatine kinase isoenzyme. Compared with control group,*＜0.05

[1] Hu XX, Zhu QL. Autologous bone marrow mesenchymal stem cells transplantation in treatment of myocardial infarction: recent advances[J]. Chin J Mult Organ Dis Elderly, 2014, 13(1): 71?75. [胡星星, 朱慶磊. 自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療心肌梗死的進(jìn)展[J]. 中華老年多器官疾病雜志, 2014, 13(1): 71?75.]

[2] Williams AR, Hare JM. Mesenchymal stem cells: biology, pathophysiology, translational findings, and therapeutic implications for cardiac disease[J]. Circ Res, 2011, 109(8): 923?940.

[3] Zhu QL, He AX, Wang SW. ATP sensitive potassium channels and cardiovascular diseases[J]. Advan Cardiovasc Dis, 2003, 24(6): 455?458. [朱慶磊, 何愛(ài)霞, 王士雯. ATP敏感性鉀通道與心血管系統(tǒng)疾病[J]. 心血管病學(xué)進(jìn)展, 2003, 24(6): 455?458.]

[4] Barbaric I, Jones M, Buchner K,. Pinacidil enhances survival of cryopreserved human embryonic stem cells[J]. Cryobiology, 2011, 63(3): 298?305.

[5] Qi Y, Xu Z, Zhu Q,. Myocardial loss of IRS1 and IRS2 causes heart failure and is controlled by p38α MAPK during insulin resistance[J]. Diabetes, 2013, 62(11): 3887?3900.

[6] Yellon DM, Downey JM. Preconditioning the myocardium: from cellular physiology to clinical cardiology[J]. Physiol Rev, 2003, 83(4): 1113?1151.

[7] Grover GJ, Garlid KD. ATP-Sensitive potassium channels: a review of their cardioprotective pharmacology[J]. J Mol Cell Cardiol, 2000, 32(4): 677?695.

[8] Qi X, Wang H, Xie WP,. Effects of iptakalim on intracellular free calcium concentration of cultured rabbit pulmonary arterial smooth muscle cells[J]. Chin Pharmacol Bull, 2008, 24(1): 67?70. [齊 栩, 王 虹, 解衛(wèi)平, 等. 埃他卡林對(duì)兔肺動(dòng)脈平滑肌內(nèi)皮細(xì)胞鈣濃度的影響[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2008, 24(1): 67?70.]

[9] Kis B, Rajapakse NC, Snipes JA,. Diazoxide induces delayed pre-conditioning in cultured rat cortical neurons[J]. J Neurochem, 2003, 87(4): 969?980.

[10] Barbaric I, Jones M, Buchner K,. Pinacidil enhances survival of cryopreserved human embryonic stem cells[J]. Cryobiology, 2011, 63(3): 298?305.

[11] Cui X, Wang H, Guo H,. Transplantation of mesenchymal stem cell preconditioned with diazaxide, a mitochondrial ATP-sensitive potassium channel opener, promotes repair of myocardial infarction in rats[J]. Tohoku J Exp Med, 2010, 220(2): 139?147.

[12] Afzal MR, Haider HKh, Idris NM,. Preconditioning promotes survival and angiomyogenic potential of mesenchymal stem cells in the infarcted heart via NF-kappaB signaling[J]. Antioxid Redox Signal, 2010, 12(6): 693?702.

[13] Jia CH, Zhang H, Li J,. Pinacidil, an ATP-sensitive potassium channel opener, inhibits ischemic apoptosis via up-regulating Bcl-2 expression in PC12 cells[J]. Chin Pharmacol Bull, 2009, 25(7): 927?931. [賈春紅, 張 鴻, 李 佳, 等. ATP敏感性鉀通道開(kāi)放劑吡那地爾增高Bcl-2表達(dá)而抑制PC12細(xì)胞缺血性凋亡[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2009, 25(7): 927?931.]

[14] Cheng HX, Zhang RQ, Jia GL,. Effects of pinacidil on intracellular free calcium concentration of cultured neonatal rat cardiomyocytes during hypoxia/reoxygenation[J]. J Med Postgrad, 2003, 16(8): 580?582. [程何祥, 張榮慶, 賈國(guó)良, 等. 吡那地爾對(duì)低氧/復(fù)氧乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的影響[J]. 醫(yī)學(xué)研究所學(xué)報(bào), 2003, 16(8): 580?582.]

[15] Wang D, Shen W, Zhang F,. Connexin43 promotes survival of mesenchymal stem cells in ischaemic heart[J]. Cell Biol Int, 2010, 34(4): 415?423.

[16] Taniguchi Ishikawa E, Gonzalez-Nieto D, Ghiaur G,. Connexin-43 prevents hematopoietic stem cell senescence through transfer of reactive oxygen species to bone marrow stromal cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(23): 9071?9076.

（編輯: 呂青遠(yuǎn)）

Effects of KATPopener on apoptosis and cardiac biomarkers in rat bone marrow mesenchymal stem cells during differentiation into cardiomyocytes

LIU Xiao-Jing, HU Xing-Xing, DENG Bo, DUAN Peng, ZHU Qing-Lei*

(Department of Cardiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

To determine the effect of ATP sensitive potassium channel (KATP) openers on the apoptosis of rat bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) and on the cardiac biomarkers in the differentiation of the cells into cardiomyocytes.BM-MSCs Were isolated from 4-week-old male SD rats, and then amplified and preconditioned by KATPopeners, diazoxide (Dia) and pinacidil (Pin). The cell apoptosis was induced by H2O2, and the apoptosis rate was detected by flow cytometry. After the BM-MSCs were treated with 2 KATPopeners respectively for 2h, the total mRNA was extracted for the expression levels of cardiac specific genes, including cardiac-specific troponin I (cTnI), creatine kinase (CK), creatine kinase isoenzyme (CK-MB), connexin 43 (Cx43) and α-heavy chain protein (α-MHC). Western blotting was used to detect the expression of cTnI, CK and CK-MB.Both Dia and Pin of 50mol/L significantly decreased the apoptosis rate of BM-MSCs (＜0.05). After 2h preconditioning, Dia and Pin obviously increased the mRNA levels of cTnI, CK, CK-MB and Cx43 (＜0.05), and enhanced the protein levels of CK and CK-MB (＜0.05).KATPopeners enhance the expression of cardiac biomarkers in the differentiation of BM-MSCs into cardiomyocytes, and also exert anti-apoptotic effect.

diazoxide; pinacidil; bone marrow mesenchymal stem cells; apoptosis

(81070200).

R963

A

10.11915/j.issn.1671-5403.2016.01.011

2015?09?14;

2015?10?27

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81070200）

朱慶磊, E-mail: qlzhu@yahoo.com