李小鵬　焦金真　顏瓊嫻　譚支良?（.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，長沙4025；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京00049）

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山羊羔羊回腸細(xì)菌群落定植與消化功能的發(fā)育性變化

李小鵬1，2焦金真1，2顏瓊嫻1譚支良1?
（1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，長沙410125；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

摘要:本試驗(yàn)旨在研究山羊羔羊回腸細(xì)菌群落定植與消化功能的發(fā)育性變化。選用44只湘東黑山羊羔羊，隨機(jī)選擇4只在1、7、14日齡（非反芻階段），28、42（過渡階段）和56、70日齡（反芻階段）屠宰取樣。采集回腸食糜測(cè)定乙酸含量，淀粉酶、纖維素酶和木聚糖酶活性，總細(xì)菌數(shù)量和部分功能性細(xì)菌（普雷氏菌屬、甲烷菌、纖維降解菌和淀粉降解菌）占總細(xì)菌百分比。結(jié)果表明：14日齡開始在回腸食糜中檢出乙酸，日齡增長顯著提高了其含量（P＜0.05），56～70日齡增長最快；日齡增長顯著或極顯著提高了纖維素酶和木聚糖酶活性（P＜0.05或P＜0.01）；日齡增長極顯著提高了總細(xì)菌數(shù)量和甲烷菌（最早檢出在7日齡）、普雷氏桿菌和棲瘤胃普雷氏菌占總細(xì)菌百分比（P＜0.01）；纖維降解菌（琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌）和淀粉降解菌（嗜淀粉瘤胃桿菌）均在28日齡開始檢出。綜合得出，山羊羔羊回腸纖維降解消化能力是在28日齡建立之后逐漸完善的，7日齡即可檢出大量甲烷菌定植，之后逐漸趨于穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞:細(xì)菌定植；消化功能建立；回腸

反芻動(dòng)物擁有與單胃動(dòng)物或其他非草食性動(dòng)物所不同的生理特性，即胃腸道內(nèi)存在大量微生物群落，可以消化其他動(dòng)物難以消化的纖維素類物質(zhì)，并通過自身的生物轉(zhuǎn)化，將其轉(zhuǎn)換成動(dòng)物性蛋白質(zhì)（肉和奶）為人類所利用［1］。反芻動(dòng)物胃腸道內(nèi)微生物區(qū)系不是一出生就存在的，而是出生后隨著與母體和環(huán)境的接觸，經(jīng)過消化道環(huán)境的適應(yīng)和選擇，經(jīng)定植、存活和繁殖，逐步建立起來的［2］。通常反芻動(dòng)物在1～20日齡處于非反芻階段，21～56日齡處于過渡階段，57日齡后進(jìn)入反芻階段，而在反芻功能完善過程中其胃腸道生理功能和微生物群落均會(huì)發(fā)生較大轉(zhuǎn)變。在這個(gè)變化過程中，胃腸道微生物會(huì)分泌各種功能性酶以降解和消化各種營養(yǎng)物質(zhì)，從而逐步完善胃腸道的消化、吸收與代謝功能［3-4］。Hungate［5］在1966年率先對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃微生物生態(tài)系統(tǒng)開展系統(tǒng)性研究，隨后的近半個(gè)世紀(jì)越來越多的研究者關(guān)注瘤胃微生物的消化代謝功能這一研究領(lǐng)域，相對(duì)而言，數(shù)量龐大的反芻動(dòng)物后腸道微生物的營養(yǎng)消化、吸收與代謝功能研究則沒有受到應(yīng)有的重視。

基于上述分析，本試驗(yàn)選擇湘東黑山羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，通過測(cè)定其回腸主要功能酶（淀粉酶、木聚糖酶和纖維素酶）活性、乙酸含量和主要功能性細(xì)菌數(shù)量等指標(biāo)，旨在揭示反芻動(dòng)物小腸道細(xì)菌群落演替與營養(yǎng)消化功能完善的發(fā)育性變化規(guī)律。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

選擇體況良好、年齡［（2.0±0.3）歲］、體重［（25.0±1.0）kg］相近的經(jīng)產(chǎn)湘東黑山羊母羊60只，參照前期研究［6］進(jìn)行同情發(fā)情處理，并在妊娠期第60天進(jìn)行超聲波檢查，選取其中44只懷孕1胎的母羊作為試驗(yàn)對(duì)象，將44只母羊單欄飼養(yǎng)在通風(fēng)良好、溫度［（24±1）℃］適宜、自然光照的羊舍內(nèi)。羔羊出生后進(jìn)行標(biāo)號(hào)、稱重。

1.2飼養(yǎng)與管理

出生后20 d內(nèi)所有羔羊（44只）僅以母羊乳喂養(yǎng)，每只羔羊每天供給1 L羊奶，分2次飼喂（08：00點(diǎn)和17：00）。分別在1、7和14日齡時(shí)，隨機(jī)選取4只進(jìn)行屠宰。剩余羔羊在21～40日齡內(nèi)逐步斷奶，并輔以食料和牧草，即每只羔羊每天供給0.5 L羊奶、0.12 kg開食料和0.04 kg新鮮牧草。41～70日齡期間，每只羔羊每天提供0.17 kg開食料和0.06 kg牧草。分別在28、42、56和70日齡時(shí)隨機(jī)選取4只進(jìn)行屠宰。

1.3羊奶、開食料

每100 g羊奶中含有總固形物12.9 g，粗脂肪3.7 g，粗蛋白質(zhì)3.5 g，酪蛋白2.9 g，乳糖4.5 g，粗灰分0. 8 g。鈣含量為134 mg/ L，總能為2.72 kJ/ L。開食料組成見表1。

1.4樣品采集

羊羔屠宰后，迅速將整個(gè)腸段用充滿二氧化碳（CO2）的塑料袋裝好，在保證無氧狀態(tài)下30 min內(nèi)轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室。將回腸內(nèi)所有食糜稱重（1、7和14日齡每只羔羊約5 g；28、42、56和70日齡每只羔羊約15 g）。其中取2 g食糜儲(chǔ)存到-80℃冰箱，以用于DNA提取和細(xì)菌數(shù)量分析；取3 g食糜用1 mL 25%偏磷酸和6 mL水混勻，離心（17 000×g，4℃，10 min），將上清液儲(chǔ)存到-20℃用于乙酸含量的測(cè)定［7］。稱取28、42、56和70日齡食糜各4 g，39℃預(yù)熱，在無氧狀態(tài)下用無菌的0.1 mol/ L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH為6.6）進(jìn)行1∶3稀釋，然后放置到-20℃冰箱，用于酶活性分析檢測(cè)。

1.5消化酶活性和乙酸含量的測(cè)定

回腸食糜乙酸含量參考García-González等［8］的方法用氣相色譜儀（7890A，Agilent公司）進(jìn)行測(cè)定。酶活性的測(cè)定：先將樣品解凍，然后無氧條件下超聲震碎細(xì)菌細(xì)胞，隨后離心（15 000×g，4℃，20 min），選取上清液作為酶溶解液。分別針對(duì)淀粉酶、纖維素酶（CMCase）和木聚糖酶，定量取0.5 mL酶溶解液、0.5 mL 0.1 mol/ L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH＝6.6）和1.0 g對(duì)應(yīng)的反應(yīng)底物（淀粉、羧甲基纖維素和木聚糖，均購自Sigma公司）溶解于100 mL水中并混勻，然后置于39℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)15、30和15 min。為了保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，設(shè)置2個(gè)空白對(duì)照（分別只有反應(yīng)底物或酶溶解液）以校正結(jié)果。酶活力單位定義為每分鐘產(chǎn)生1 μmol/ L還原糖消耗的酶量。

表1　開食料組成（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Composition of the starter（DM basis）　%

1.6功能性細(xì)菌定量

本試驗(yàn)中選取的細(xì)菌包括：總細(xì)菌（general bacteria，GB）；普雷氏菌屬，包括普雷氏桿菌（Prevotella，Pre）和棲瘤胃普雷氏菌（Prevotella ruminocula，Pr），該菌屬屬于典型蛋白質(zhì)降解菌，同時(shí)也是淀粉降解菌；2種纖維降解菌（cellulolytic bacteria，Cb），包括琥珀酸絲狀桿菌（Fibrobacter succinogenes，F(xiàn)s）和黃色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens，Rf）；2種淀粉降解菌（Amylolytic bacteria，Ab），包括反芻月形單胞菌（Selenomonas ruminantium，SELE）和嗜淀粉瘤胃桿菌（Ruminobacter amylophilu，RAMY）；甲烷菌（Methanogen，Met），是完全不同于細(xì)菌且進(jìn)化獨(dú)特的一類微生物——古菌或者古細(xì)菌，已知的瘤胃古菌均為嚴(yán)格厭氧產(chǎn)甲烷古菌，其中大部分為氫營養(yǎng)古菌，可以利用碳水化合物降解過程中釋放的H2和CO2生成甲烷［9］。之所以選取上述細(xì)菌作為研究對(duì)象，是因?yàn)樗鼈冊(cè)跔I養(yǎng)物質(zhì)消化方面起重要作用。用于實(shí)時(shí)定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）的細(xì)菌特異性引物見表2。

表2　實(shí)時(shí)定量PCR的細(xì)菌引物Table 2 Primers of bacteria used for real-time quantitative PCR

1.6.1總DNA提取

回腸食糜細(xì)菌總DNA的提取采用Qiagen公司的QIAamp DNA Stool Mini kit試劑盒。取0.2 g左右的食糜樣，按照說明書進(jìn)行DNA提取。唯一改進(jìn)的一點(diǎn)是ASL緩沖液加入后，應(yīng)在95℃培養(yǎng)10 min，來確保革蘭陰性菌和陽性菌細(xì)胞壁的裂解。提取的總DNA用50 μL無菌無酶水溶解，并用微量紫外分光光度計(jì)ND-100測(cè)定其核酸濃度（ng/μL）及純度（OD260 nm/ OD280 nm），并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2實(shí)時(shí)定量PCR分析

1.6.2.1目標(biāo)片段的擴(kuò)增

以回腸內(nèi)細(xì)菌總DNA為模板進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均參考焦金真等［9］的研究。PCR結(jié)束后，取20 μL PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6.2.2擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆

1.6.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和樣品檢測(cè)

分別取各細(xì)菌的陽性克隆質(zhì)粒，用微量紫外分光光度計(jì)ND-100檢測(cè)其濃度。根據(jù)各質(zhì)粒的分子質(zhì)量與質(zhì)量濃度計(jì)算拷貝數(shù)（個(gè)），制得標(biāo)準(zhǔn)品。然后對(duì)已知拷貝數(shù)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍的連續(xù)梯度稀釋，取5～8個(gè)稀釋梯度作為模板進(jìn)行PCR。

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和樣品的實(shí)時(shí)定量PCR條件一致，均采用10 μL體系。反應(yīng)體系：SYBR GreenⅠ熒光染料預(yù)混試劑5 μL，ROX 0.2 μL，上、下游引物（10 μmol/ mL）各0.2 μL，質(zhì)粒DNA模板或樣品DNA模板1 μL（DNA模板濃度稀釋到10 ng/μL左右），牛血清白蛋白（BSA）0.05 μL和滅菌雙蒸去離子水3.35 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火和延伸30 s并采集熒光信號(hào)，共40個(gè)循環(huán)；60℃升至95℃15 s，60℃15 s、95℃15 s，自動(dòng)采集熒光信號(hào)。

1.6.2.4細(xì)菌數(shù)量的計(jì)算方法

將實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果循環(huán)閾值（Ct）代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到其lg值，然后根據(jù)參考文獻(xiàn)［13］中公式計(jì)算細(xì)菌數(shù)量［lg（個(gè)/ g）］，再計(jì)算功能菌占總細(xì)菌百分比。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）和兩變量相關(guān)性分析（bivariate correlations），結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異顯著。

2　結(jié)　果

2.1乙酸含量

由于在1和7日齡的回腸食糜樣品中沒有檢測(cè)到乙酸，因此表3中只列出了14、28、42、56和70日齡回腸食糜乙酸含量。日齡對(duì)羔羊回腸食糜中乙酸含量有顯著影響（P＝0.045），其中28、42 和56日齡顯著高于14日齡（P＜0.05），顯著低于70日齡（P＜0.05）。

表3　不同日齡羔羊回腸食糜乙酸含量Table 3 Acetate concentration in ileal chymus of lambs at different days of age　%

2.2消化酶活性

由于1、7和14日齡的羔羊回腸食糜樣品不足，無法檢測(cè)各消化酶活性，因此表4只列出了28、42、56和70日齡的消化酶活性。回腸食糜淀粉酶活性隨日齡變化出現(xiàn)波動(dòng)性增長，但變化并不顯著（P＝0.118）；日齡增長對(duì)纖維素酶（P＝0.030）和木聚糖酶的活性（P＝0.001）有顯著或極顯著影響，其中42、56和70日齡顯著高于28日齡（P＜0.05）。

表4　不同日齡羔羊回腸食糜中消化酶活性Table 4 Digestive enzyme activities in ileal chymus of lambs at different days of age　U/ g

2.3細(xì)菌數(shù)量

由表5可知，從總細(xì)菌數(shù)量來看，日齡對(duì)羔羊回腸食糜細(xì)菌總細(xì)菌數(shù)量有極顯著影響（P＜ 0.01）；其中，7、14、28和42日齡顯著高于1日齡（P＜0.05），而顯著低于56和70日齡（P＜0.05）。從功能性細(xì)菌占總細(xì)菌百分比來分析，日齡變化極顯著影響羔羊回腸食糜中普雷氏桿菌（P＜0.01）、棲瘤胃普雷氏菌（P＜0.01）、甲烷菌（P＜0.01）、琥珀酸絲狀桿菌（P＝0.006）、黃色瘤胃球菌（P＝0.002）和嗜淀粉瘤胃桿菌占總細(xì)菌百分比（P＝0.001），但對(duì)反芻月形單胞菌占總細(xì)菌百分比沒有顯著影響（P＝0.714）。隨著日齡增長，羔羊回腸食糜中普雷氏桿菌、棲瘤胃普雷氏菌、甲烷菌和琥珀酸絲狀桿菌占總細(xì)菌百分比均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，而黃色瘤胃球菌、嗜淀粉瘤胃桿菌和反芻月形單胞菌占總細(xì)菌百分比則沒有類似規(guī)律。黃色瘤胃球菌和嗜淀粉瘤胃桿菌占總細(xì)菌百分比的峰值分別出現(xiàn)在42和28日齡。相對(duì)而言，山羊羔羊回腸食糜優(yōu)勢(shì)細(xì)菌是普雷氏桿菌、棲瘤胃普雷氏菌、甲烷菌和嗜淀粉瘤胃桿菌，而琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌數(shù)量相對(duì)較少，反芻月形單胞菌最少。

表5　不同日齡羔羊回腸食糜總細(xì)菌數(shù)量和功能性細(xì)菌占總細(xì)菌百分比Table 5 GB number and functional bacteria percentage of GB in ileal chymus of lambs at different days of age

2.4相關(guān)性分析

表6表示羔羊回腸細(xì)菌組成與消化功能指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)，相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值大于0.40的為顯著相關(guān)。乙酸含量與普雷氏桿菌、棲瘤胃普雷氏菌和甲烷菌占總細(xì)菌百分比呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。淀粉酶活性只與黃色瘤胃球菌占總細(xì)菌百分比呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。纖維素酶活性與甲烷菌占總細(xì)菌數(shù)量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與嗜淀粉瘤胃桿菌占總細(xì)菌百分比呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。木聚糖酶活性與普雷氏桿菌、棲瘤胃普雷氏菌、甲烷菌和琥珀酸絲狀桿菌占總細(xì)菌百分比呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），卻與嗜淀粉瘤胃桿菌占總細(xì)菌百分比呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。

3　討　論

3.1山羊羔羊出生后回腸消化功能的發(fā)育

直接的研究已證實(shí)，除了瘤胃具有強(qiáng)大的降解纖維物質(zhì)的能力外，反芻動(dòng)物小腸（包括空腸和回腸）對(duì)飼糧纖維類物質(zhì)亦有很強(qiáng)的補(bǔ)償消化能力［14-15］。由此可以判斷，反芻動(dòng)物后消化道消化能力的建立和完善與后腸道定植的細(xì)菌數(shù)量和種類直接相關(guān)，而腸道細(xì)菌消化能力最直接的表征即是產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的能力和酶活性的大小。隨著反芻動(dòng)物日齡的增長，伴隨著各種消化酶（尤其是纖維降解酶）被小腸道細(xì)菌分泌，進(jìn)入反芻動(dòng)物后腸道的飼料（尤其是纖維物質(zhì)）才能被轉(zhuǎn)化成VFA，此過程亦即碳水化合物降解能力逐漸建立并完善的過程［3-4］。有研究表明，在反芻動(dòng)物的盲腸和結(jié)腸部位亦存在較強(qiáng)的纖維消化能力［16-17］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著日齡的增長，山羊羔羊回腸食糜中的乙酸含量逐漸升高，且纖維素酶和木聚糖酶的活性亦同步升高，根據(jù)數(shù)據(jù)應(yīng)可推斷小腸（回腸）細(xì)菌自14日齡起在逐步形成降解和消化纖維類物質(zhì)的能力。至于是何種細(xì)菌其主導(dǎo)作用，將在后文進(jìn)一步討論。張英杰等［18］研究認(rèn)為，回腸內(nèi)淀粉酶活性隨著羔羊日齡的增長逐漸增長，3個(gè)月基本穩(wěn)定；并認(rèn)為可能是羔羊從出生后，隨著采食量逐漸增加和食物來源的變化，消化道發(fā)育日漸完善和腸道細(xì)菌的演變，腸道消化酶活性逐漸增加。而在本試驗(yàn)條件下，28～70日齡間并未發(fā)現(xiàn)回腸食糜中淀粉酶活性隨日齡增長而發(fā)生顯著變化，而纖維素酶和木聚糖酶活性顯著增加。其可能的原因是，回腸并非淀粉酶分泌的主要部位，而隨著山羊羔羊的逐漸斷奶，后腸道細(xì)菌定植數(shù)量逐漸增加，對(duì)進(jìn)入后腸道的纖維類物質(zhì)（纖維素、半纖維素和木聚糖）的響應(yīng)增強(qiáng)，進(jìn)而分泌纖維素酶和木聚糖酶的能力也增強(qiáng)。

表6　羔羊回腸食糜細(xì)菌組成與消化功能發(fā)育指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)Table 6 The correlation coefficients between bacterial community and digestive functional indexes in ileal chymus of lambs

3.2山羊羔羊出生后回腸細(xì)菌定植

回腸內(nèi)細(xì)菌種類和數(shù)量雖然無法與瘤胃內(nèi)細(xì)菌種類和數(shù)量相比，但是從本試驗(yàn)結(jié)果來看回腸內(nèi)細(xì)菌數(shù)量也達(dá)到了108～109。出生后1周，山羊羔羊回腸內(nèi)細(xì)菌數(shù)量增加了3個(gè)數(shù)量級(jí)，之所以羔羊產(chǎn)后1周后腸道細(xì)菌迅速出現(xiàn)，其主要來源應(yīng)該包括母體細(xì)菌、奶和周圍環(huán)境［19-20］。通常而言，羔羊出生后3周內(nèi)不具備反芻功能，瘤胃的發(fā)育與功能亦不完善，母羊奶則成為后腸道細(xì)菌定植和生存的主要營養(yǎng)源［21］。本試驗(yàn)中普雷氏菌屬和淀粉降解菌成為出生后羔羊回腸內(nèi)最早定植的細(xì)菌，且在14日齡的回腸食糜中即檢測(cè)到了一定量的乙酸，其原因是上述細(xì)菌會(huì)參與進(jìn)入后腸道的乳酸、乳糖和其他低聚糖轉(zhuǎn)化為VFA的過程［21］。本試驗(yàn)中山羔羊回腸食糜中細(xì)菌總數(shù)在56和70日齡達(dá)到峰值且保持相對(duì)穩(wěn)定，據(jù)此可推斷山羊后腸道細(xì)菌定植應(yīng)該在2月齡左右即完成。就功能細(xì)菌而言，羔羊回腸食糜中普雷氏桿菌、棲瘤胃普雷氏菌和琥珀酸絲狀桿菌占總細(xì)菌比例隨日齡增長亦顯著增加，這伴隨著乙酸含量以及纖維素酶與木聚糖酶活性的升高?？紤]到普雷氏桿菌和棲瘤胃普雷氏菌是回腸食糜中的優(yōu)勢(shì)菌群，僅就此而言，回腸消化纖維類物質(zhì)的能力應(yīng)該取決于普雷氏桿菌和棲瘤胃普雷氏菌數(shù)量的增加。相關(guān)性分析結(jié)果亦表明，這2種菌占總細(xì)菌百分比與乙酸含量呈顯著正相關(guān)。至于回腸食糜中的黃色瘤胃球菌和嗜淀粉瘤胃桿菌數(shù)量的峰值分別出現(xiàn)在42日齡和28日齡，可能與逐步斷奶過程提供的飼糧變化有關(guān)，有待在今后的試驗(yàn)研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，本試驗(yàn)中，42日齡為徹底斷奶并改變飼糧的取樣期，從細(xì)菌數(shù)量的變化來分析，斷奶尤其容易引起回腸食糜中黃色瘤胃球菌和嗜淀粉瘤胃桿菌數(shù)量的急劇變化（與28和56日齡相比），焦金真等［9］在盲腸和結(jié)腸亦觀察到類似的研究結(jié)果。而甲烷菌在回腸內(nèi)細(xì)菌中，其數(shù)量雖然不是最多的，但僅次于普雷氏菌屬，而且自檢測(cè)的第7日齡開始，其數(shù)量一直相對(duì)穩(wěn)定，可見甲烷菌在反芻動(dòng)物后腸道的定植可能在1周內(nèi)即可基本完成。

4　結(jié)　論

①本試驗(yàn)研究認(rèn)為山羊回腸消化降解纖維物質(zhì)的能力不是出生就有的，而是28日齡開始，隨著普雷氏桿菌和棲瘤胃普雷氏菌等功能性細(xì)菌的定植逐漸建立并進(jìn)一步完善。

②回腸內(nèi)最早定植的細(xì)菌是普雷氏菌屬、反芻月形單胞菌和甲烷菌；而纖維降解菌，包括琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌，則是在28日齡開始定植。

③甲烷菌不僅在瘤胃內(nèi)大量存在，在回腸中也有數(shù)量可觀的甲烷菌存在，但數(shù)量不隨飼糧的變化而改變。

參考文獻(xiàn):

［1］ 劉敏雄.反芻動(dòng)物消化生理學(xué)［M］.北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1991：12.

［2］ 馮仰廉.反芻動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2004.

［3］ KRAUSE D O，NAGARAJA T G，WRIGHT A D G，et al.Board-invited review：rumen microbiology：leading the way in microbial ecology［J］.Journal of Animal Science，2013，91（1）：331-341.

［4］ REY M，ENJALBERT F，MONTEILS V. Establishment of ruminal enzyme activities and fermentation capacity in dairy calves from birth through weaning ［J］. Journal of Dairy Science，2012，95（3）：1500-1512.

［5］ HUNGATE R E. The rumen and its microbes［M］. New York：Academic Press，1966.

［6］ HE Z X，WU D Q，SUN Z H，et al.Protein or energy restriction during late gestation alters fetal growth and visceral organ mass：an evidence of intrauterine programming in goats［J］.Animal Reproduction Science，2013，137（3/4）：177-182.

［7］ MAO S Y，HUO W J，ZHU W Y. Use of pyrosequencing to characterize the microbiota in the ileum of goats fed with increasing proportion of dietary grain ［J］.Current Microbiology，2013，67（3）：341-350.

［8］ GARCíA-GONZáLEZ R，LóPEZ S，F(xiàn)ERNáNDEZ M，et al.Screening the activity of plants and spices for decreasing ruminal methane production in vitro［J］. Animal Feed Science and Technology，2008，147（1/ 2/3）：36-52.

［9］ 焦金真，王芃芃，湯少勛，等.瀏陽黑山羊胃腸道不同部位重要功能微生物的數(shù)量分布特征研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，44（10）：1590-1599.

［10］ HOOK S E，NORTHWOOD K S，WRIGHT A D G，et al. Long-term monensin supplementation does not significantly affect the quantity or diversity of methanogens in the rumen of the lactating dairy cow［J］. Applied and Environmental Microbiology，2009，75 （2）：374-380.

［11］ DENMAN S E，MCSWEENEY C S.Development of a real-time PCR assay for monitoring anaerobic fungal and cellulolytic bacterial populations within the rumen ［J］.FEMS Microbiology Ecology，2006，58（3）：572-582.

［12］ STEVENSON D M，WEIMER P J.Dominance of Prevotella and low abundance of classical ruminal bacterial species in the bovine rumen revealed by relative quantification real-time PCR［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2007，75（1）：165-174.

［13］ ZHOU M，HERNANDEZ-SANABRIA E，GUAN L L. Assessment of the microbial ecology of ruminal methanogens in cattle with different feed efficiencies ［J］.Applied and Environmental Microbiology，2009，75（20）：6524-6533.

［14］ TAN Z L，LU D X，HU M，et al. Effect of dietary structural to nonstructural carbohydrate ratio on rumen degradability and digestibility of fiber fractions of wheat straw in sheep［J］. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences，2002，15（11）：1591-1598.

［15］ TAN Z L，LU D X，HU M，et al.Effects of dietary nitrogen sources on fiber digestion and ruminal fluid characteristics in sheep fed wheat straw［J］. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences，2001，14 （10）：1374-1382.

［16］ CUMMINGS J H.Short chain fatty acids in the human colon［J］.Gut，1981，22（9）：763-779.

［17］ JIAO J Z，WANG P P，HE Z X，et al.In vitro evaluation on neutral detergent fiber and cellulose digestion by post-ruminal microorganisms in goats［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2014，94（9）：1745-1752.

［18］ 張英杰，劉月琴，孫洪新，等.羔羊小腸pH及主要消化酶發(fā)育規(guī)律的研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，36（2）：149-152.

［19］ M?NDAR R，MIKELSAAR M. Transmission of mother’s microflora to the newborn at birth［J］.Biology of the Neonate，1996，69（1）：30-35.

（責(zé)任編輯王智航）

［20］ HUNT K M，F(xiàn)OSTER J A，F(xiàn)ORNEY L J，et al.Characterization of the diversity and temporal stability of bacterial communities in human milk［J］.PLoS One，2011，6（6）：e21313.

［21］ ?RSKOV E R，BENZIE D，KAY R N B.The effects of feeding procedure on closure of the oesophageal groove in young sheep［J］. British Journal of Nutrition，1970，24（3）：785-795.

［22］ FAUBLADIER C，JULLIAND V，DANEL J，et al. Bacterial carbohydrate-degrading capacity in foal faeces：changes from birth to pre-weaning and the impact of maternal supplementation with fermented feed products［J］.British Journal of Nutrition，2013，110（6）：1040-1052.

Developmental Changes in Bacterial Colonization and Digestive Function in Ileum of Lambs

LI Xiaopeng1，2JIAO Jinzhen1，2YAN Qiongxian1TAN Zhiliang1?
（1. Key Laboratory for Agro-Ecological Processes in Subtropical Region，Hunan Provincial Engineering Research Center for Healthy Livestock and Poultry Production，South-Central Experimental Station of Animal Nutrition and Feed Science in Ministry of Agriculture，Institute of Subtropical Agriculture，The Chinese Academy of Sciences，Changsha 410125，China；2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

Abstract：The objective of this study was to investigate the developmental changes in bacterial colonization and digestive function in ileum of lambs. Forty four Xiangdong black lambs were used in this trial，and 4 of them were randomly slaughtered at 1，7 and 14 days of age（nonrumination period），28 and 42 days of age（transition period），and 56 and 70 days of age（rumination period），respectively. The ileal chymus was sampled to determine acetate content，activities of amylase，cellulase and xylanase，as well as general bacteria number and selected functional bacterial species（Prevotella，methanogen，and cellulolytic and amylolytic bacteria）. The results showed as follows：acetate could be detected in ileal chymus of lambs since at 25 days of age，and the content was significantly increased with increasing days of age（P＜0.05）；the increase of days of age significantly increased the activities of cellulase and xylanase（P＜0.05 or P＜0.01）；the increase of days of age significantly increased general bacterial number and the percentages of Prevotella，Prevotella ruminocula and methanogen（firstly detected at 7 days of age）in general bacterial（P＜0.01）；cellulolytic（Fibrobacter succinogenes and Ruminococcus flavefaciens）and amylolytic bacteria（Ruminobacter amylophilu）were firstly detected at 28 days of age. In conclusion，the fiber-degrading capacity in ileum of lambs is established at 28 days of age and then gradually achieved；a great number of methanogen can be detected at 7 days of age，and then the number gets stable.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2016，28（3）：731-738］

Key words：bacterial colonization；functional establishment；ileum

Corresponding author?，professor，E-mail：zltan@isa.ac.cn

通信作者:?譚支良，研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail：zltan@isa.ac.cn

作者簡介:李小鵬（1990—），男，山東濰坊人，碩士研究生，從事動(dòng)物營養(yǎng)與飼料學(xué)研究。E-mail：lixiaopeng123lover@163.com

基金項(xiàng)目:中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)（XDA05020700）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31320103917）

收稿日期:2015-09-25

doi：10.3969/ j.issn.1006-267x.2016.03.013

中圖分類號(hào):S826

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1006-267X（2016）03-0731-08