鄭秀娟, 解慧芳, 曹紅瑞, 楊桂英, 謝長(zhǎng)榮, 梁康逕, 孫新立

(1.福建農(nóng)林大學(xué)作物遺傳育種與綜合利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.福建農(nóng)林大學(xué)作物遺傳改良研究所作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用研究室，福建 福州 350002)

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水稻秈粳亞種分化關(guān)聯(lián)性狀的QTL分析

鄭秀娟1, 解慧芳1, 曹紅瑞1, 楊桂英2, 謝長(zhǎng)榮2, 梁康逕2, 孫新立1

(1.福建農(nóng)林大學(xué)作物遺傳育種與綜合利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.福建農(nóng)林大學(xué)作物遺傳改良研究所作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用研究室，福建 福州 350002)

摘要:亞洲栽培稻分為秈粳兩個(gè)亞種，程氏形態(tài)指數(shù)法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于秈粳分類的研究和生產(chǎn)實(shí)踐中，但秈粳分化相關(guān)性狀的遺傳基礎(chǔ)還多不清楚.本研究以典型粳稻牡丹江8號(hào)和典型秈稻明恢63的雜交F2群體為材料，構(gòu)建遺傳連鎖圖，檢測(cè)到了11個(gè)秈粳分化相關(guān)性狀(稃毛長(zhǎng)、粒長(zhǎng)、粒寬、倒一節(jié)間長(zhǎng)和抽穗期)的QTL.同時(shí)定位了13個(gè)與這些性狀高度相關(guān)的株高、穗長(zhǎng)和護(hù)穎長(zhǎng)的QTL.結(jié)果表明，檢測(cè)到5個(gè)控制稃毛長(zhǎng)的QTL，最大貢獻(xiàn)率為25.57%；4個(gè)控制穗長(zhǎng)的QTL,總貢獻(xiàn)率為47.13%；4個(gè)控制抽穗期的QTL，分別位于第3、第7染色體上；控制粒長(zhǎng)和控制粒長(zhǎng)的QTL各檢測(cè)到1個(gè)，貢獻(xiàn)率分別為38.03%、20.56%.本研究為相關(guān)性狀基因的克隆打下了基礎(chǔ)，并加深了人們對(duì)秈粳分化的認(rèn)知.

關(guān)鍵詞:水稻; 秈粳分化; 遺傳連鎖圖; QTL

亞洲栽培稻(OryzasativaL.)是最重要的糧食作物之一，約8000-9000年前從普通野生稻馴化而來(lái)[1,2].亞洲栽培稻分為秈、粳兩個(gè)亞種，秈稻進(jìn)一步分為秈型和aus型；粳稻分為溫帶粳稻和熱帶粳稻[3].秈粳兩亞種在長(zhǎng)期的自然和人工選擇下，表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性.在秈、粳兩亞種的鑒別上，眾多學(xué)者依據(jù)二者之間的差異，建立了不同分類標(biāo)準(zhǔn).程侃聲等[4]提出了“程氏形態(tài)指數(shù)法”，通過(guò)對(duì)水稻稃毛、酚反應(yīng)、谷粒長(zhǎng)寬比、抽穗時(shí)穎殼色、倒一節(jié)間長(zhǎng)、葉毛有無(wú)等6個(gè)性狀區(qū)分秈粳亞種，其中前4個(gè)性狀可以區(qū)分95%以上的品種[4].此方法簡(jiǎn)單快速，但需要豐富的經(jīng)驗(yàn).Oka[5]提出采用判別式進(jìn)行秈粳分類，判別因子包括酚反應(yīng)、氯酸鉀抗性、稃毛長(zhǎng)度和低溫敏感性.這一判別式可以將誤分率降低到0.4%，但操作變得復(fù)雜.同工酶技術(shù)及電泳技術(shù)的發(fā)展使得秈粳分化的研究深入到蛋白質(zhì)水平.Glaszmann et al[6]利用15個(gè)同工酶位點(diǎn)，將亞洲栽培稻分為6組，其中Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ屬于秈稻，Ⅳ，Ⅴ和Ⅵ屬于粳稻.孫新立等選擇6個(gè)秈粳分類表現(xiàn)好的位點(diǎn)，建立了同工酶分類的判別式[7].

隨著RFLP、SSR和SNP等分子標(biāo)記技術(shù)的飛速發(fā)展和應(yīng)用，為秈粳的分類、分化提供了更深一步的證據(jù)[3,8,9].首個(gè)克隆、涉及秈粳分類性狀的基因是控制酚反應(yīng)的基因—Phr1[10].該基因在粳稻中編碼一個(gè)失活的氧化酶，因而酚反應(yīng)不能使粳稻谷粒著色[10].水稻稃毛長(zhǎng)度是劃分秈粳稻的主要性狀之一，秈稻短而整齊、粳稻長(zhǎng)而密，且多集中在谷粒頂部[4].Sato et al[11,12]認(rèn)為稃毛長(zhǎng)度受一個(gè)隱性主效基因控制，并將該基因位于第6染色體，命名為aph與Est-2和Pgi-2連鎖.錢等也在第6染色體定位了一個(gè)數(shù)量性狀座位(quantitative trait locus, QTL)，但位置與Sato et al[13]研究結(jié)果不同.而Cai et al[14]發(fā)現(xiàn)稃毛長(zhǎng)度受多個(gè)基因控制并檢測(cè)到11個(gè)QTL.喬寶健等[15]利用秈粳雜交的BIL群體在2個(gè)不同地點(diǎn)，分別檢測(cè)到5個(gè)和7個(gè)控制水稻倒一節(jié)間長(zhǎng)度的QTL，其中有4個(gè)相同.He et al[16]利用單染色體片段代換系，檢測(cè)出4個(gè)控制水稻倒一節(jié)間長(zhǎng)QTL.但僅有第1染色體上的QTL可能與喬等的相同.目前，尚未見到克隆控制該性狀QTL的報(bào)道.但基于對(duì)株高或倒一節(jié)間長(zhǎng)的突變體的分析，克隆了3個(gè)(OsLIS1、EUI1和SUI1)調(diào)控該性狀的基因[17-19].但根據(jù)這3個(gè)基因突變體的性狀分析，似乎與涉及秈粳分類無(wú)關(guān).籽粒長(zhǎng)寬比是另一個(gè)重要的涉及秈粳分類的性狀，分別由粒長(zhǎng)和粒寬基因控制，這類基因已有多個(gè)被克隆，但不清楚哪幾個(gè)基因涉及秈粳分類性狀[20-27].故秈粳分化相關(guān)性狀的遺傳基礎(chǔ)，除酚反應(yīng)外，還所知甚少.

本研究以典型粳稻牡丹江8號(hào)和典型秈稻明恢63雜交的F2群體為材料，選取122個(gè)SSR標(biāo)記構(gòu)建分子連鎖圖，定位了多個(gè)秈粳分化相關(guān)性狀(稃毛、粒長(zhǎng)、粒寬、生育期和倒一節(jié)間長(zhǎng)等)的主效QTL，為這些性狀的基因克隆奠定了基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1種植方法及性狀考察

本研究以典型秈稻品種明恢 63(MH63)與典型粳稻品種牡丹江8號(hào)(MDJ8)為親本，構(gòu)建含有186個(gè)株系的F2群體.供試材料于2012年4月10日浸種，催芽露白后隨機(jī)點(diǎn)播于25 cm×20 cm塑料育秧盤中，5月5日移栽至福建農(nóng)林大學(xué)作物遺傳改良研究所作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用研究室網(wǎng)室內(nèi)，株行距18 cm×20 cm，采用常規(guī)的田間栽培管理，力求均勻一致，并及時(shí)進(jìn)行病蟲害防治.

田間考察MDJ8/MH63的F2群體的抽穗期、株高、穗長(zhǎng)、倒一節(jié)間長(zhǎng)；收獲種子后，加標(biāo)尺，用帶MP-E 65 mm鏡頭的CANON相機(jī)放大3-5倍拍照，Image J軟件輔助測(cè)量稃毛、粒長(zhǎng)、粒寬、外護(hù)穎和內(nèi)護(hù)穎的長(zhǎng)度，記錄數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

1.2性狀表型值及相關(guān)性分析

采用SPSS 13.0軟件的頻率分布對(duì)F2群體各性狀表型值進(jìn)行分析(P<0.05)，得出性狀分析表和頻率分布圖，同時(shí)通過(guò)該軟件計(jì)算兩兩性狀的相關(guān)系數(shù)(P<0.05)，分析各個(gè)性狀的相關(guān)性.

1.3PCR檢測(cè)、SSR遺傳連鎖圖和QTL定位

選取群體中約20天的幼嫩葉片，采用Dellaporta et al[28]提出的SDS抽提法提取水稻基因組DNA.并將每份DNA稀釋至20 ng·μL-1，進(jìn)行PCR檢測(cè).

選取均勻分布于水稻12條染色體上的SSR分子標(biāo)記612對(duì)，分別對(duì)MDJ 8號(hào)、MH 63及F1代進(jìn)行多態(tài)性篩選.利用多態(tài)性分子標(biāo)記分別對(duì)F2群體進(jìn)行檢測(cè)，并統(tǒng)計(jì)帶型.運(yùn)用JoinMap 4.0作圖軟件，以LOD=2.5為閾值，采用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化成遺傳圖距(cM)，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜.QTL分析采用QTL IciMapping version 3.2(www.isbreeding.net)軟件中ICIM-ADD和Windows QTL Cartographer 2.5[29](簡(jiǎn)寫WinQTLCart 2.5)軟件中CIM，各個(gè)性狀的LOD閾值采用Permutation test(1000次，Type I error小于0.05)獲得.

2結(jié)果與分析

2.1F2群體及親本表型值分析

MH 63和MDJ 8分別是典型的秈稻和粳稻，其F2群體變化范圍廣，株高、穗長(zhǎng)、倒一節(jié)間長(zhǎng)、稃毛長(zhǎng)等各性狀都存在一定程度的超雙親分離(圖1).F2群體中，穗長(zhǎng)、稃毛長(zhǎng)、粒長(zhǎng)、粒寬的峰度和偏度的絕對(duì)值接近于0，最接近正態(tài)分布.群體株高、倒一節(jié)間長(zhǎng)均值超越了高值親本MH 63.所研究的性狀表現(xiàn)明顯的數(shù)量性狀遺傳特征.

2.2所考察性狀間的相關(guān)性分析

為證實(shí)抽穗期、株高、倒一節(jié)間長(zhǎng)、穗長(zhǎng)、粒長(zhǎng)和內(nèi)外護(hù)穎間可能存在的相關(guān)性.本研究采用SPSS 13.0，計(jì)算了所研究性狀間的相關(guān)系數(shù)(表1).結(jié)果表明，抽穗期、株高、倒一節(jié)間長(zhǎng)和穗長(zhǎng)4個(gè)性狀間存在極顯著的正相關(guān)，穗長(zhǎng)和株高間相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.7.內(nèi)外護(hù)穎長(zhǎng)度之間相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.81，可能受相同的基因控制.護(hù)穎長(zhǎng)度與粒長(zhǎng)存在極顯著的正相關(guān)(表1).

表1　F2群體各個(gè)性狀相關(guān)分析1)

1)**表示P<0.01，*表示P<0.05.

2.3分子遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和QTL分析

采用122個(gè)SSR標(biāo)記構(gòu)建水稻全基因組遺傳連鎖圖，總圖距為1660.0 cM，相鄰標(biāo)記平均遺傳距離為13.5 cM，每個(gè)連鎖群上的標(biāo)記數(shù)為8~14個(gè)，遺傳距離為89.4~202.9 cM(圖2).

依據(jù)構(gòu)建的遺傳連鎖圖，本研究采用2種方法對(duì)所考察的9個(gè)性狀進(jìn)行QTL分析.采用ICIM-ADD共檢測(cè)到24個(gè)QTL(圖2，表2)，分布在第1~7染色體上，單個(gè)表型貢獻(xiàn)率從6.12%到38.03%.第3染色體上檢測(cè)到9個(gè)QTL.本研究亦用WinQTLCart 2.5-CIM檢測(cè)相關(guān)性狀，共檢測(cè)到26個(gè)QTL(資料未顯示)，其中有21個(gè)QTL為2種方法同時(shí)檢測(cè)到.而僅有1種方法檢測(cè)到的QTL，貢獻(xiàn)率均較低.

表2　QTL定位和效應(yīng)分析

結(jié)合文獻(xiàn)分析和搜索NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)本研究定位的QTL區(qū)間包含已經(jīng)克隆的相關(guān)基因.MH63含有突變的GS3[20]，而MDJ8含有突變的Ghd7[25].在二者所在的位置，都檢測(cè)到相關(guān)的QTL.因控制粒寬的QTL區(qū)間包含GW5/qSW5基因，因此，本研究測(cè)序分析了MDJ8的GW5/qSW5基因，發(fā)現(xiàn)它帶有粒寬基因gw5/qsw5[25,30].此外，第3染色體RM22-RM231區(qū)間，包含抽穗期基因Hd6或Hd16[31,32].RM520-RM3329區(qū)間包含抽穗期基因OsMADS50(表2)[33]. 上述研究表明，QTL的分析結(jié)果和主效QTL的定位是非?？煽康?

第3染色體前端和第7染色體的兩個(gè)區(qū)段，存在多個(gè)QTL聚集的密集區(qū)(圖2，表2).第3染色體前端檢測(cè)到控制株高、倒一節(jié)間長(zhǎng)、抽穗期和內(nèi)外護(hù)穎的QTL在同一區(qū)間；第7染色體上，控制穗長(zhǎng)，株高和抽穗期的基因在同一區(qū)間(圖2).然而，第3染色體的QTL密集區(qū)，包含OsMADS50，該基因的突變，改變了水稻的抽穗期、株高[33].Ghd7基因包含在第7染色體的RM214-RM7-39區(qū)段內(nèi)，該區(qū)段抽穗期QTL波峰覆蓋RM481-RM7-39，包含株高和穗長(zhǎng)QTL.此外，這些QTL聚集在一起，較好的解釋了株高、穗長(zhǎng)、倒一節(jié)間長(zhǎng)和抽穗期間的相關(guān)性(表2).

3討論

本研究采用兩種方法檢測(cè)了MDJ8/MH63 F2群體中的秈粳分化相關(guān)的QTL，兩種檢測(cè)方法檢測(cè)到的QTL多數(shù)重疊.另外，一些MDJ8和MH63中已可隆的基因，如GS3、GW5和Ghd7，在定位結(jié)果中均檢測(cè)出來(lái)，這些說(shuō)明本研究的QTL分析結(jié)果，特別是主效QTL的定位是非常可靠的.

稃毛長(zhǎng)度是秈粳程氏指數(shù)分類法中的重要指標(biāo)之一，只采用稃毛長(zhǎng)度對(duì)秈粳分類，86.5%的品種可以正確的分到相應(yīng)的亞種中[5].對(duì)稃毛長(zhǎng)度QTL的定位可以為秈粳分類指標(biāo)提供遺傳依據(jù).本研究采用帶有高分辨率、高放大倍數(shù)鏡頭的相機(jī)拍照，Image J軟件輔助，精確測(cè)量稃毛長(zhǎng)度，共檢測(cè)到4個(gè)控制稃毛長(zhǎng)度的QTL，能解釋54.0% 的群體總變異.其中，貢獻(xiàn)率最大的兩個(gè)QTL分別位于第3和6染色體，與Cai et al[14]檢測(cè)到的QTL重疊.位于第4、第5染色體上的QTL可能是新的控制稃毛長(zhǎng)的QTL.

籽粒長(zhǎng)寬比是秈粳分類的另一指標(biāo)，若單采用該指標(biāo)的誤分率高達(dá)39.0%[5].本研究分別定位了控制籽粒長(zhǎng)度和寬度的QTL，各檢測(cè)到1個(gè)貢獻(xiàn)率較大的QTL(表2).這兩個(gè)QTL很可能是gs3和gw5/qsw5[20,25,30].本研究也嘗試直接采用復(fù)合性狀谷粒長(zhǎng)寬比定位QTL，分別在粒長(zhǎng)和粒寬QTL區(qū)檢測(cè)到控制長(zhǎng)寬比的2個(gè)QTL(結(jié)果未顯示).這些結(jié)果表明，用于秈粳分類的長(zhǎng)寬比指標(biāo)可分解為粒長(zhǎng)和粒寬兩個(gè)因素.MH63中的GS3突變類型廣泛存在于栽培稻中，Takano-Kai等[23]對(duì)235份栽培稻和284份野生稻的分析發(fā)現(xiàn)，34%的栽培稻和4%普通野生稻帶有該基因的突變體.其中，這一突變體主要分布在熱帶粳稻和秈稻中.GW5/qSW5的突變體主要分布在粳稻和寬粒秈稻中[25,30].這些結(jié)果暗示，這兩個(gè)基因可能是控制秈粳分類的主要基因.錢前等分別在第1、2和3染色體上檢測(cè)到控制籽粒長(zhǎng)寬比的QTL，分析其定位結(jié)果，在其QTL所覆蓋的物理區(qū)間，與本研究檢測(cè)到的不同，同時(shí)也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)已克隆的基因處在這些區(qū)間[13].這些表明可能還有其它粒形基因涉及秈粳分類.

水稻光周期基因不僅影響水稻的抽穗期，而且影響水稻的株高、倒一節(jié)間長(zhǎng)和穗長(zhǎng)[25,34].分布于不同緯度的品種，因其涉及光周期基因的序列及表達(dá)差異，表現(xiàn)出不同的光溫反應(yīng)[35,36].本研究分別在第3染色體的RM22-RM231區(qū)間，第7染色體的兩個(gè)區(qū)間檢測(cè)到涉及光溫反應(yīng)的QTL.其中第3染色體的該QTL區(qū)間包含OsMADS50[33]，而第7染色體的一個(gè)區(qū)間包含Ghd7基因[25].這兩個(gè)基因都屬于多效基因，同時(shí)影響抽穗期、株高和穗長(zhǎng)[30,33,37].然而，本研究?jī)H檢測(cè)到一個(gè)涉及倒一節(jié)間長(zhǎng)的QTL，在第3染色體的RM22和RM231區(qū)，但貢獻(xiàn)率只有10.9%.這一結(jié)果是否意味著秈粳稻間倒一節(jié)間長(zhǎng)的差異，是由于其對(duì)光溫反應(yīng)的不同造成的呢？這些，尚待深入研究.

用于秈粳分類的形態(tài)及生理性狀，除酚反應(yīng)外，都是由多基因控制.Cai et al[14]研究表明，可以區(qū)分97.1%的秈粳品種的氯酸鉀抗性，亦由多基因控制.這為相關(guān)基因的克隆增加了難度.本研究的QTL定位，尤其是稃毛QTL的定位，為其進(jìn)一步的克隆奠定了基礎(chǔ)；同時(shí)抽穗期、倒一節(jié)間長(zhǎng)、株高和穗長(zhǎng)間的相互關(guān)系的揭示，加深了人們對(duì)秈粳分化性狀的認(rèn)知.

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(責(zé)任編輯:吳顯達(dá))

QTL analysis of the differentiation characteristics ofindicaandjaponicarice and associated traits

ZHENG Xiujuan1, XIE Huifang1, CAO Hongrui1, YANG Guiying2,

XIE Changrong2, LIANG Kangjing2, SUN Xinli1

(1.Fujian Agriculture and Forestry University, Provincial and Ministerial Key Laboratory of Crop Genetics Breeding and Comprehensive Utilization; 2.Fujian Agriculture and Forestry University, Institute of Plant Genetics and Breeding, Fuzhou, Fujian, 350002)

Abstract:Morphological index method has been widely applied in distinguishing two subspecies of Asian cultivated rice, indica and japonica, and in production. But genetic bases of characteristics that related to differentiation of indica and japonica is still unclear. Therefore, we constructed a genetic linkage map of the F2 population that crossed between a typical japonica Mudanjiang 8 and a typical indica Minghui 63 and identified 11 QTLs of indica-japonica differentiation traits, including apiculus length, first internode length, grain length, grain width and heading date. We also detected 13 QTLs that associated with plant height, panicle length, and empty glume length, which highly correlated with one or two upper traits. To summarize, among the 13 QTLs, 5 QTLs related to apiculus length and the highest contribution rate is 25.57%; 4 QTLs controlled panicle length with a total contribution rate of 47.13%; 4 QTLs controlled heading date which located in chromosome 3 and 7; 1 QTL related to grain length and 1 to grain width, whose contribution rate was 38.03% and 20.56%, respectively. The study may facilitate the map-based cloning, and offer deeper insight to the indica-japonica differentiation.

Key words:rice; indica-japonica differentiation; linkage-map; QTL

DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.01.001

中圖分類號(hào):S511

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1671-5470(2016)01-0001-07

作者簡(jiǎn)介:鄭秀娟(1987-)，女，研究實(shí)習(xí)員，碩士.研究方向：分子生物學(xué).Email：chenxizxj@126.com.通訊作者孫新立(1965-)，男，教授，博士.研究方向：植物分子生物學(xué).Email:xinlisun@hotmail.com.

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(31371557).

收稿日期：2015-04-07修回日期：2015-05-20