黃娟，楊俊青，陳松潤，仇凱（1.國家青少年食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，廣東東莞520808；2.中食檢測研究院有限公司，廣東東莞520808；.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027）

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HPLC法測定嬰幼兒配方乳粉中羧甲基賴氨酸

黃娟1，2，楊俊青1，2，陳松潤1，2，仇凱3
（1.國家青少年食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，廣東東莞520808；2.中食檢測研究院有限公司，廣東東莞520808；3.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027）

摘要：乳由于熱損傷而發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生羧甲基賴氨酸（CML）。研究顯示，CML與糖尿病、動脈粥樣硬化、人體細(xì)胞老化等均呈正相關(guān)。本文建立了HPLC方法對嬰幼兒乳粉中羧甲基賴氨酸的測定方法。樣品經(jīng)預(yù)處理，采用高效液相色譜儀（HPLC）進(jìn)行測定，色譜柱為C(18)柱，柱溫為35℃，流動相為甲醇和醋酸鈉緩沖液（pH 6.50，0.048 mol/L）（96∶4，體積比），流速為0.8 mL/min，熒光檢測器，激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長455 nm，外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示，CML在0.2 μg/mL～35.0μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9991。最低檢出濃度為0.16 μg/mL。選擇市售2種品牌奶粉進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，回收率分別為92%和107%。

關(guān)鍵詞：HPLC；嬰幼兒乳粉；羧甲基賴氨酸（CML）

嬰幼兒乳粉的生產(chǎn)工藝過程中需要加熱干燥，在這個過程中乳由于熱損傷而發(fā)生美拉德反應(yīng)，羧甲基賴氨酸（CML）是美拉德反應(yīng)進(jìn)入晚期階段的一種產(chǎn)物[1]。研究顯示，乳加工過程中受熱損傷程度與產(chǎn)生的羧甲基賴氨酸含量之間存在正相關(guān)性[2]。而且在生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，已經(jīng)有大量的研究表明，CML與糖尿病、動脈粥樣硬化、人體細(xì)胞老化等均呈正相關(guān)。食源性CML作為一種潛在危害物，也引發(fā)了人們的關(guān)注。目前，國內(nèi)罕見對于乳粉中羧甲基賴氨酸（CML）定量測定的研究報道，醫(yī)學(xué)臨床上常用ELISA方法對樣品進(jìn)行檢測，但由于不同樣品的制備過程差異較大，定量檢驗結(jié)果穩(wěn)定性差[3]。本文嘗試采用HPLC方法對嬰幼兒乳粉中羧甲基賴氨酸進(jìn)行測定。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

1.1.1儀器

U-3000高效液相色譜儀（帶熒光檢測器）、OMS100電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：Thermo；EV311旋蒸儀：Labtech；AL204精密電子天平：Mettler-Toledo；DC-24氮吹儀：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；帶螺蓋耐熱試管（50 mL）。

1.1.2試劑

甲醇（色譜純）：Honeywell；0.1 mol/L鹽酸溶液、0.1 mol/L氫氧化鈉、冰醋酸鈉緩沖液（pH = 6.50，0.048 mol/L）：廣州試劑廠；0.2 mol/L硼酸鈉緩沖溶液：A液[稱取1.24 g硼酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），蒸餾水定容至100mL]，B液[稱取1.91g硼酸鈉（NaB4O7· H2O，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），蒸餾水定容至100 mL，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH = 9.5]；0.4 mol/L硼酸鈉緩沖溶液（pH=9.5）；1mol/L硼酸化鈉溶液；OPA試劑：提前24 h配制，貯存在4℃[配制方法：取0.134 3 g o-鄰苯二醛（Aladdin）溶于2.5 mL的甲醇中，加入125 μL的β-巰基乙醇（西亞試劑），用0.4 mol/L硼酸鈉緩沖溶液（0.4 mol/L，pH=9.5）定容至25 mL]。

1.1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液

稱取羧甲基賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98 %）2.5 mg左右（精確至0.1 mg），溶于0.2 mol/L pH 9.5硼酸鈉緩沖溶液中，定容至10.00 mL，配制成500 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，放置于4℃可保存3個月。

1.2色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD，5 μm，250 mm×4.6 mm；柱溫：35.0℃；波長：熒光檢測器，激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長455 nm；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；流動相：甲醇（A）：醋酸鈉緩沖液（B）（pH 6.50，0.048 mol/L）= 96∶4（體積比），等度洗脫。

1.3樣品前處理

1.3.1樣品的制備

水解前先進(jìn)行還原反應(yīng)：稱取0.1 g試樣，至于帶螺蓋的耐熱試管中，加入4 mL 0.2 mol/L硼酸鈉緩沖溶液和2 mL 1 mol/L硼酸化鈉溶液，振蕩溶解后，室溫下反應(yīng)4 h。

水解：加入6 mL濃HCl，充N2置換空氣后密封，在110℃下水解20 h。

除鹽酸：水解后，樣品中剩余的鹽酸通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出去（至體積為4 mL～5 mL），樣品轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用水定容，進(jìn)樣前使用0.22 μm水相濾膜過濾。

樣品衍生：將上述水解液進(jìn)行衍生，方法是：取100 μL的標(biāo)品溶液或樣品水解液與500 μL OPA試劑，置于1.5 mL小瓶中，渦旋混合。準(zhǔn)確反應(yīng)90 s后進(jìn)樣。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的配置

吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液，并用0.2 mol/L pH 9.5硼酸鈉緩沖溶液定容，得到50 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液中間液。分別吸取中間液20、200、1.00、2.00、4.00、6.00、7.00 mL，用0.2 mol/L pH 9.5硼酸鈉緩沖溶液定容至10.00 mL容量瓶中，得到標(biāo)準(zhǔn)工作液：0.10、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、35.0 μg/mL。以其標(biāo)準(zhǔn)溶液峰的保留時間為依據(jù)定性，以其峰面積求出樣液中目標(biāo)物質(zhì)含量。

羧甲基賴氨酸（CML）的標(biāo)準(zhǔn)品在檢測器上的響應(yīng)譜圖見圖1。

圖1羧甲基賴氨酸（CML）標(biāo)準(zhǔn)品譜圖Fig.1 Standard spectrum of CML

嬰幼兒配方乳粉中羧甲基賴氨酸（CML）在檢測器上的響應(yīng)譜圖見圖2。

圖2嬰幼兒配方乳粉中羧甲基賴氨酸（CML）譜圖Fig.2 Standard spectrum of CML in infant formula milk powder

2　結(jié)果與分析

2.1線性范圍

標(biāo)準(zhǔn)工作液在上述色譜條件下進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，考察目標(biāo)物的線性范圍。

根據(jù)羧甲基賴氨酸（CML）的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度和色譜儀的響應(yīng)值所得標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

在目標(biāo)物濃度為0.2 μg/mL～35 μg/mL的范圍內(nèi)，回歸線性方程y=251 576.5x+126 259.3，r2=0.999 1。2.2檢出限

按1.3中所述對樣品（嬰幼兒奶粉）進(jìn)行處理后，取接近噪音（信噪比S/N>3）濃度的樣液進(jìn)按上述色譜進(jìn)行測定，目標(biāo)物的最低檢出濃度為0.16 μg/mL。

圖3羧甲基賴氨酸（CML）標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of CML

2.3精密度

在上述色譜條件下，考察樣品中嬰幼兒奶粉（目標(biāo)物含量在普通含量水平），重復(fù)測定6次，檢測結(jié)果分別為14.76、16.23、15.38、14.90、15.17、15.28 mg/kg，精密度（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差）RSD %為3.4 %。

2.4回收率

稱取2種不同品牌的嬰幼兒乳粉各0.1 g，均加入500 μL的500 μg/mL羧甲基賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在上述色譜條件下測定回收率分別為92 %和107 %。

3　結(jié)論

實現(xiàn)了嬰幼兒配方乳粉中的羧甲基賴氨酸（CML）的定量測定。通過測定，可考察嬰幼兒乳粉生產(chǎn)工藝過程中乳成分的熱損傷情況，也是對嬰幼兒乳粉質(zhì)量的嚴(yán)格控制所提出的又一潛在新指標(biāo)。但是，在檢測實驗過程中發(fā)現(xiàn)羧甲基賴氨酸衍生后易降解，衍生后需立即上機(jī)測定，這對于日常檢測工作增加了難度。如何實現(xiàn)批量檢測，對測定方法和流程進(jìn)行優(yōu)化，是今后研究的方向。

參考文獻(xiàn)：

[1]韓立鵬,李琳,李冰,等.油脂引發(fā)的OH·對食源性羧甲基賴氨酸生成的影響[J].華南理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2013(1):139-144

[2]韓榮偉,王加啟,鄭楠.熱處理對牛乳成分的變化影響及熱損標(biāo)識物的選擇[J].中國食物與營養(yǎng),2011,17(7):22-29

[3]魏芹,劉乃豐.羧甲基賴氨酸的研究進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2005,24(4):269-273

Determination of Carboxymethyl Lysine in Infant Formula Milk Powder

HUANG Juan1，2，YANG Jun-qing1，2，CHEN Song-run1，2，CHOU Kai3
（1. China National Adolescent Food Quality Supervision and Inspection Center，Dongguan 520808，Guangzhou，China；2. China Foods Detection and Research Institute Co. Ltd.，Dongguan 520808，Guangzhou，China；3. China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015，China）

Abstract：Maillard reaction produced carboxymethyl lysine（CML）when milk had been heat injury. Research showed that positive correlation between CML and diabetes mellitus，atherosclerosis and aging cells of people. This paper established high performance liquid chromatography（HPLC）method for determination of carboxymethyl lysine in infant formula products. After pre-treating the sample was quantified with external standard method used C(18)chromatographic column with the temperature 35℃and methanol-Sodium acetate buffer（pH 6.50，0.048 mol/L）（96∶4，volume ratio）as mobile phase at a flow rate of 0.8 mL/min by FLD detector at 340 nm and 455 nm as excitation and emission wavelength. The result showed that CML had a good linearity in the range of 0.2 μg/mL-35.0 μg/mL，and the correlation coefficient was 0.999 1. The limit concentration of detection was 0.16 μg/mL. The recovery rate were 92 % and 107 % in standard recovery test which choosed two brands of milk powder.

Key words：HPLC；infant formula milk powder；carboxymethyl lysine（CML）

收稿日期：2014-10-13

作者簡介：黃娟（1983—），女（漢），工程師，碩士研究生，主要從事食品安全檢驗工作。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.044