王 尉，林 楠，周曉晶，3，樂勝鋒，杜 寧，3，張經(jīng)華

（1.北京市理化分析測試中心，北京 100089；2.有機材料檢測技術(shù)與質(zhì)量評價北京市重點實驗室，北京 100094；3.全國標準樣品技術(shù)委員會天然產(chǎn)物標準樣品專業(yè)工作組，北京 100094）

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表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）標準樣品的研制

王 尉1，2，林 楠1，2，周曉晶1，2，3，樂勝鋒1，2，杜 寧1，2，3，張經(jīng)華1，3

（1.北京市理化分析測試中心，北京 100089；2.有機材料檢測技術(shù)與質(zhì)量評價北京市重點實驗室，北京 100094；3.全國標準樣品技術(shù)委員會天然產(chǎn)物標準樣品專業(yè)工作組，北京 100094）

依據(jù)GB/T 15000.3—2008《標準樣品工作導(dǎo)則（3）標準樣品：定值的一般原則和統(tǒng)計方法》，開展表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）國家標準樣品研制工作。以綠茶樣品作為研究材料，采用溶劑提取、萃取、高速逆流色譜分離純化，制備得到EGCG。通過紫外-可見吸收光譜、紅外光譜、質(zhì)譜和核磁共振波譜等方法對EGCG樣品進行結(jié)構(gòu)鑒定，并進行均勻性、穩(wěn)定性檢驗。采用8 家實驗室進行聯(lián)合定值，并對定值結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果：EGCG標準樣品均勻性和穩(wěn)定性良好，定值結(jié)果為99.29%，置信度95%的擴展不確定度為0.16%。結(jié)論：所制備得到的EGCG樣品滿足GB/T 15000.3—2008的要求，可用于綠茶相關(guān)產(chǎn)品中EGCG的質(zhì)量控制和方法驗證。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯；綠茶；標準樣品；均勻性；穩(wěn)定性；定值

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是黃烷醇類化合物，是多酚類物質(zhì)的主要成分。EGCG是綠茶中含量最高、活性最強的多酚類化合物，占多酚類總量40%以上［1-2］。EGCG不僅對茶葉的滋味具有重要的影響，而且大量的研究表明EGCG等茶多酚成分具有重要的生物活性，如抗氧化［3-4］、清除自由基［5］、抗輻射［6］、抗病毒［7］、抗炎［8］、修復(fù)細胞損傷［9-10］、降血壓血脂［11］和預(yù)防癌癥［12-17］等。目前，EGCG的制備分離常以色譜技術(shù)為核心，運用多種化學(xué)方法達到分離純化EGCG的目的。王霞等［18］通過對茶多酚原料萃取，采用制備液相色譜的方法制備得到了純度大于99%的EGCG。孫東魁等［19］從茶多酚中提取全乙?；腅GCG，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法跟蹤水解過程，優(yōu)化水解條件，以較高收率得到高純度的EGCG樣品。朱斌等［20］選擇聚酰胺為柱填料對茶多酚樣品進行分離，通過對洗脫劑pH值、溫度等條件優(yōu)化，制備得到了純度大于93%的EGCG。

市場上綠茶相關(guān)的產(chǎn)品種類繁多，其中EGCG作為綠茶主要的化學(xué)成分，其含量的檢測需要該標準樣品作為檢測對照；同時，在綠茶相關(guān)活性研究和產(chǎn)品開發(fā)中，EGCG也是重要的研究對象，因此迫切需要開展該標準樣品的研制工作。本研究采用溶劑提取、萃取、高速逆流色譜（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）技術(shù)制備EGCG，通過紫外-可見吸收光譜（ultraviolet-visible absorption spectrometry，UV-VIS）、紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）、質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波譜等方法進行結(jié)構(gòu)鑒定，并開展均勻性檢驗、穩(wěn)定性檢驗、定值研究，最終得到純度大于98%、擴展不確定度小于0.5%的EGCG標準樣品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍井綠茶 北京吳裕泰茶業(yè)股份有限公司。

乙醇、乙酸乙酯、正己烷、甲醇、乙酸（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）美國Fisher Scientific公司；EGCG對照品（純度＞99%）上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A型HPLC系統(tǒng)（配SPD-M20A和ELSD-LTⅡ檢測器）、UV-2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司；1100 Series LC/MSD Trap型液相MS儀 美國安捷倫公司；Spectrum400傅里葉變換紅外-近紅外光譜儀 德國珀金埃爾默公司；AVANCE 600超導(dǎo)脈沖傅里葉變換NMR儀 德國Bruker公司；ALPHA 1-2 plus冷凍干燥機德國Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 EGCG樣品制備和分裝

將綠茶粉碎過0.3 mm篩（60 目），稱取綠茶粉末200 g，加入80%乙醇溶液2 L，60 ℃回流提取3 次，每次1 h，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇得提取物浸膏。所得浸膏用蒸餾水分散，乙酸乙酯萃取3 次，合并萃取液，減壓回收溶劑得乙酸乙酯浸膏，備用。

通過市售對照品跟蹤EGCG，采用HSCCC進行EGCG樣品的分離制備。將選定的溶劑體系充分混合后，靜置分層，上相為固定相，下相為流動相。先以10 mL/min的流速泵入固定相，待固定相充滿管道后。打開主機調(diào)整轉(zhuǎn)速為900 r/min，主機正轉(zhuǎn)，當(dāng)達到設(shè)定轉(zhuǎn)速時，以3 mL/min的流速泵入流動相。主機溫度控制在25 ℃，檢測波長設(shè)定為280 nm，當(dāng)流動相從主機出口流出時進樣。選定的HSCCC溶劑體系分別為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（0.8∶5∶1∶5，V/V）和乙酸乙酯-乙醇-水（25∶1∶25，V/V），收集EGCG的色譜峰，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，冷凍干燥，最終得到高純度EGCG樣品。

將EGCG樣品采用進口2 mL棕色樣品瓶進行分裝。分裝是在相對獨立和潔凈空間進行的，以每瓶10 mg分裝，用十萬分之一天平稱量，樣品共100 瓶，以1～100號計。分裝好的樣品瓶放在4 ℃冰箱中長期保存。

1.3.2 純度分析

配制質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的EGCG樣品溶液，采用HPLC峰面積歸一法對EGCG進行純度分析。采用不同色譜柱，相同分析條件：色譜柱分別為Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Zorbax SBC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：1%乙酸-乙腈（85∶15，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：273 nm。采用Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）HPLC-二極管陣列檢測器-蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)用，流動相：1%乙酸（A）-乙腈（B），線性梯度洗脫，10%～60% B（0～30 min）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：273 nm；蒸發(fā)光散射檢測器分析條件：載氣壓力350 kPa，漂移管溫度40 ℃，增益值5。

1.3.3 結(jié)構(gòu)鑒定

采用UV、IR、MS和NMR方法對EGCG進行結(jié)構(gòu)鑒定。UV分析條件：甲醇作為溶劑，掃描范圍200～800 nm；IR分析條件：KBr壓片法，掃描范圍400～4 000 cm-1。MS分析條件：離子源為電噴霧，采用正、負離子模式，噴霧器壓力50 psi，脫溶劑氣為氮氣，溫度350 ℃，流量10 L/min。NMR分析條件：氘代溶劑為氘代丙酮（Acetone-d6）和重水（D2O）的混合溶劑，采集13C-NMR和1H-NMR譜圖。

1.3.4 均勻性、穩(wěn)定性、定值測定

依據(jù)GB/T 15000.3—2008《標準樣品工作導(dǎo)則（3）標準樣品：定值的一般原則和統(tǒng)計方法》［21］開展均勻性、穩(wěn)定性、定值研究工作。均勻性：隨機抽取10個樣品，采用單因素多水平試驗方差分析法進行純度均勻性檢驗，判斷EGCG的均勻性是否合格。穩(wěn)定性：將EGCG樣品避光貯存于4 ℃，開展12 個月長期穩(wěn)定性的研究。分別于0、3、6、9、12 個月取樣檢測，采用直線作為經(jīng)驗?zāi)Ｐ?，觀察斜率值是否有顯著變化，預(yù)測EGCG的穩(wěn)定性變化。定值：采用多個實驗室協(xié)作實驗的聯(lián)合定值方式，分別對隨機抽取8 個樣品進行檢測，對所采集的測定結(jié)果采用格拉布斯（Grubbs）檢驗法進行檢驗，計算EGCG標準樣品的標準值和不確定度。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG制備及純度分析

圖 1 EGCG制備分離的HSCCC圖Fig. 1 HSCCC of EGCG

采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（0.8∶5∶1∶5，V/V）溶劑體系連續(xù)上樣，富集EGCG組分，經(jīng)乙酸乙酯-乙醇-水（25∶1∶25，V/V）溶劑體系二次分離純化得到高純度的EGCG樣品（圖1）。經(jīng)HPLC分析，應(yīng)用峰面積歸一法計算純度值，其純度為99.30%（圖2a）。

圖 2 EGCG的HPLC圖Fig. 2 HPLC chromatograms of EGCG

2.2 EGCG結(jié)構(gòu)鑒定

采用UV-VIS、IR、MS和NMR對EGCG進行結(jié)構(gòu)鑒定。UV-VIS最大吸收波長為273 nm（圖3a）；IR吸收峰：3 224（—O—H）、1 692（—C=O）、1 613（—C=C）、1 518、1 450（Ar）、1 237（酯—C—O）、1 144、1 096、1 037（醚—C—O） cm-1（圖3b）。UV、IR數(shù)據(jù)與文獻［22-23］比較，光譜特征一致。通過ESI-MS正負離子模式掃描（圖4）可得：［M+H］+= 459.2，［M-H］-=457.1，故測定的相對分子質(zhì)量為458，與EGCG相對分子質(zhì)量相符［24］。1H和13C-NMR測試結(jié)果見圖5，通過對數(shù)據(jù)進行歸屬（表1），并與文獻［25］比較，其核磁譜數(shù)據(jù)與報道的EGCG化合物基本一致，確定該樣品為EGCG。

表3 均勻性檢驗方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis for the homogeneity of EGCG

根據(jù)均勻性檢驗結(jié)果，計算瓶間和瓶內(nèi)方差分析的均方，并計算F值為1.57。查F臨界值表，得F0.05（9，20）=2.39，由于F的計算值小于F臨界值，所以可以認為本樣品是均勻的。通過計算瓶間方差，取其平方根可得均勻性檢驗引入的不確定度u均=7.73×10-4。

2.4 穩(wěn)定性檢驗

按1.3.2節(jié)純度分析方法，對避光貯存的EGCG樣品進行穩(wěn)定性檢驗。每個樣品平行檢測3 次，以面積百分比讀取樣品的純度值（表4），采用直線作為經(jīng)驗?zāi)Ｐ停窗l(fā)現(xiàn)斜率值發(fā)生顯著變化，可以確定EGCG樣品在12 個月時間內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表4 穩(wěn)定性檢驗結(jié)果Table 4 Results for stability evaluation of EGCG %

采用直線作為經(jīng)驗?zāi)Ｐ?，觀察斜率值是否有顯著變化，以此對標準樣品的穩(wěn)定性變化進行預(yù)測。斜率：

2.4 治療效果與表達的關(guān)系比較 ER高表達患者總有效率為62.9%，低表達患者總有效率為31.0%，表明ER 高表達者治療有效率明顯高于低表達者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PR高表達患者總有效率為51.8%，低表達患者總有效率為51.4%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明PR表達與治療效果無相關(guān)性。見表5。

直線上的點的標準偏差計算：

取其平方根s=0.14%，與斜率相關(guān)的不確定度計算：

自由度為n-2和95%置信水平的分布t因子等于3.128，由于|b1|＜t0.95（n-2）·s（b1）=3.128×0.002 1%= 0.006 7%，故斜率是不顯著的，因而未觀測到該樣品的不穩(wěn)定性。12個月的長期穩(wěn)定性的不確定度為：u穩(wěn)= s（b1）·t=0.002 1%×12=2.52×10-4。

2.5 定值

對聯(lián)合定值的8 家實驗室所采集的測定結(jié)果，采用Grubbs檢驗法進行檢驗，未發(fā)現(xiàn)異常值。經(jīng)過數(shù)據(jù)統(tǒng)計，計算得出EGCG樣品的標準值和不確定度。不同實驗室檢測和方差分析結(jié)果見表5、6。

表5 不同實驗室檢測結(jié)果Table 5 Results from different laboratories %

表6 不同實驗室方差分析結(jié)果Table 6 Results of variance analysis for different laboratories

總平均值（標準值）計算：

制備所得標準樣品定值結(jié)果的不確定度（uCRM）由以下幾部分組成：1）均勻性檢驗引入的不確定度（u均）；2）穩(wěn)定性檢驗引入的不確定度（u穩(wěn)）；3）多個實驗室定值引入的不確定度（）。

uCRM2=，故uCRM=8.17×10-4= 0.082%，在置信概率為95%時，k=2，則擴展不確定度UCRM=2uCRM=0.082%×2=0.16%。

故EGCG定值結(jié)果為（99.29±0.16）%。

3 結(jié) 論

本研究在成功建立了EGCG樣品制備方法的基礎(chǔ)上，開展了該標準樣品的研制工作。并依據(jù)GB/T 15000.3—2008，對制備得到的EGCG樣品進行均勻性檢驗、穩(wěn)定性檢驗及定值研究，最終申報獲批成為國家標準樣品（標準樣品證書編號GSB 11-1439-2012）。

EGCG標準樣品的標準值為99.29%，擴展不確定度（95%置信區(qū)間）為0.16%。該標準樣品符合GB/T 15000.3—2008的要求，填補了國內(nèi)該研究領(lǐng)域的空白。EGCG標準樣品不僅可以滿足茶葉及相關(guān)產(chǎn)品分析檢測、質(zhì)量控制工作的需求，同時，也為檢測結(jié)果的準確性、可比性，以及溯源性提供了技術(shù)支持。

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Development of EGCG Reference Material

WANG Wei1，2， LIN Nan1，2， ZHOU Xiaojing1，2，3， LE Shengfeng1，2， DU Ning1，2，3， ZHANG Jinghua1，3
（1. Beijing Centre for Physical and Chemical Analysis， Beijing 100089， China；2. Beijing Key Laboralory of Detection Technology & Quality Evaluation of Organic Material， Beijing 100094， China；3. Specialistic Group on Natural Product of National Technical Committee on Reference Materials， Beijing 100094， China）

Objective: This study aimed to prepare epigallocatechin gallate （EGCG） reference material according to the Directives for the Work of Reference Materials （3）: Reference Materials—General and Statistical Principles for Certifcation（GB/T 15000.3—2008）. Methods: EGCG from green tea was separated by extraction and high speed counter current chromatography （HSCCC）. Its chemical structure was identified by ultraviolet-visible （UV） spectroscopy， infrared （IR）spectroscopy， mass spectrometry （MS） and nuclear magnetic resonance （NMR） spectroscopy. The homogeneity and stability were systematically checked. A cooperative validation was conducted in 8 laboratories and the results of certifcation for EGCG were analyzed. Results: The homogeneity and stability of the reference material of EGCG were excellent， and the certified value was 99.29% with an expanded uncertainty of 0.16% at confidence coefficient of 95%. Conclusions: The reference material of EGCG conforms to the requirement of the Directives for the Work of Reference Materials （3） and can be used for validation of analytical methods for quality control of green tea products.

epigallocatechin gallate （EGCG）； green tea； certifed reference material； homogeneity； stability； certifed value

10.7506/spkx1002-6630-201614019

TS272.7

A

王尉， 林楠， 周曉晶， 等. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）標準樣品的研制［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（14）: 110-115.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614019. http://www.spkx.net.cn

WANG Wei， LIN Nan， ZHOU Xiaojing， et al. Development of EGCG reference material［J］. Food Science， 2016， 37（14）: 110-115.

（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614019. http://www.spkx.net.cn

2015-11-13

國家質(zhì)檢總局公益性行業(yè)科研發(fā)展專項（201210209）

王尉（1984—），男，助理研究員，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物分離純化。E-mail：wangwei_1217@126.com