黃曉蕾，周國(guó)興，王博成，吳金亮，薛楊，蔡伶伶，邢進(jìn)，宗根林，詹青，趙江民*

SPIO標(biāo)記BMSCs移植治療局灶性腦梗死的MRI示蹤研究

黃曉蕾1，周國(guó)興2，王博成1，吳金亮1，薛楊1，蔡伶伶1，邢進(jìn)1，宗根林2，詹青3*，趙江民1*

目的 通過(guò)采用磁共振技術(shù)示蹤在體超順磁性氧化鐵(super paramagnetic iron oxide, SPIO)標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)，觀察SPIO標(biāo)記的BMSCs在局灶性腦梗死模型中的遷移及治療情況。材料與方法 28只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(CON, n=4)、假手術(shù)組(SHAM, n=4)、局灶性腦梗死對(duì)照組(MCAO+SPIO，n=10)和SPIO標(biāo)記BMSCs治療組(MCAO+SPIO-BMSC, n=10)。通過(guò)普魯士藍(lán)染色法及CCK8法選取SPIO標(biāo)記BMSCs的最佳濃度，并使用立體定向注射方法進(jìn)行最佳濃度SPIO及SPIOBMSC的移植，術(shù)后第1、9、20、30、43天行1.5 T MRI掃描，檢測(cè)兩者在局灶性腦梗死中的生物學(xué)行為，普魯士藍(lán)染色觀察細(xì)胞遷移分布情況。結(jié)果 當(dāng)SPIO標(biāo)記濃度為50 μg/m l時(shí)，BMSCs普魯士藍(lán)染色效率為100%，CCK8檢測(cè)增殖活性較對(duì)照組及75 μg/m l組均有明顯差異(P＜0.05)。使用T2WI和SWI序列均能明確檢測(cè)到MCAO+SPIO組和MCAO+SPIO-BMSC 組中移植區(qū)域信號(hào)減低。與T2WI序列相比，SW I序列顯示低信號(hào)范圍更廣，示蹤時(shí)間更長(zhǎng)。與MCAO+SPIO組比較，MCAO+SPIO-BMSC 組可見SPIO標(biāo)記的BMSCs向缺血梗死區(qū)遷移。普魯士藍(lán)染色檢查發(fā)現(xiàn)：普魯士藍(lán)染色陽(yáng)性的細(xì)胞聚集在梗死區(qū)域周圍。結(jié)論 MRI技術(shù)能夠有效示蹤50 μg/m l SPIO標(biāo)記的BMSCs，顯示BMSCs在局灶性腦梗死模型中隨時(shí)間變化發(fā)生的生物學(xué)行為，并對(duì)BMSCs在局灶性腦梗死中的遷移治療情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀測(cè)。

超順磁性氧化鐵；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；腦梗死；磁共振成像

Received 4 Jan 2016, Accepted 11 Mar 2016

ACKNOW LEDGMENTSThis work was part of key projects of Shanghai Municipal Science and technology innovation action plan (No. 10411953400); Project of Medicine School of Shanghai Jiaotong University (No. 12XJ30061); Project of Shanghai health and Fam ily Planning Commission (No. 20124194); Scientific research project of Science and Technology Comm ittee of Baoshan District Shanghai (No. 14-E-4).

缺血性腦梗死是一種常見的血管性疾病，占全部腦血管病的70%。腦細(xì)胞對(duì)缺血缺氧狀態(tài)非常敏感，因此血流中斷30分鐘以上神經(jīng)細(xì)胞即會(huì)出現(xiàn)不可逆損傷。且腦缺血時(shí)間越長(zhǎng)，血管再通后的再灌注損傷越重。加之成熟神經(jīng)元不可再生，容易導(dǎo)致永久性的神經(jīng)功能缺陷。因此，盡管有不斷完善的早期診斷方法及溶栓技術(shù)，但缺血性腦卒中的致死致殘率一直較高[1]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)能向損傷部位定向遷移，分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子調(diào)控梗死區(qū)微環(huán)境穩(wěn)定，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。且不涉及倫理問(wèn)題，是細(xì)胞替代治療的理想種子[2-3]。但BMSCs在缺血性腦梗死病灶中的生物學(xué)行為有待活體監(jiān)測(cè)。MRI是一種常用的無(wú)創(chuàng)影像檢查方法，能夠?yàn)閷?shí)驗(yàn)性干細(xì)胞移植后的生物學(xué)行為提供非侵入性的活體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。還可對(duì)同一研究對(duì)象進(jìn)行縱向研究，可視化監(jiān)測(cè)病理生理過(guò)程[4]。筆者通過(guò)觀察MRI示蹤超順磁性氧化鐵(super param agnetic iron oxide, SPIO)標(biāo)記BMSCs在局灶性腦梗死模型中的遷移情況，比照缺血梗死病灶不同時(shí)間段的影像學(xué)進(jìn)展情況，評(píng)估MRI技術(shù)示蹤SPIO標(biāo)記BMSCs的可行性，進(jìn)而評(píng)估干細(xì)胞在局灶性腦梗死模型中的遷移治療情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要儀器與試劑

選取體質(zhì)量(80±20) g雄性清潔級(jí)SD大鼠6只，體質(zhì)量(280±20) g雄性清潔級(jí)SD大鼠28只，由解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：2008001646859，使用許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-0016。

DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))，胎牛血清(Gibco公司，美國(guó))，細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning，美國(guó))，CCK-8試劑盒(上海復(fù)申生物)，普魯士藍(lán)染料(上海復(fù)申生物)，微量注射器(Ham ilton，瑞士)，大鼠專用5 cm四通道線圈(上海辰光公司)，1.5 T MRI(GE，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BMSC的分離與培養(yǎng)

取SD大鼠(80±20) g脫頸處死，置于碘伏中浸泡20 m in。用無(wú)菌手術(shù)剪刀分離取出股骨、脛骨及肱骨，置于酒精中浸泡10 m in，PBS緩沖液中洗2遍。取無(wú)菌手術(shù)剪暴露長(zhǎng)骨骨髓腔，用10 m l無(wú)菌注射器吸取含體積分?jǐn)?shù)15% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，以2×108個(gè)/m l的細(xì)胞密度接種于10 cm培養(yǎng)皿中，放置于5% CO2、37℃恒溫箱中培養(yǎng)。接種后8 h首次換液，以后隔天換液1次。7 d后待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合狀態(tài)時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，傳代。實(shí)驗(yàn)選用3～5代細(xì)胞。

1.2.2 SPIO標(biāo)記BMSCs的生物學(xué)特性檢測(cè)

普魯士藍(lán)檢測(cè)標(biāo)記效率：取四代BMSCs計(jì)數(shù)后接種于6孔板中，每孔約5000個(gè)細(xì)胞。使用含15%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)液，除一孔為正常對(duì)照外，其余均加入0.75 μg/m l多聚賴氨酸，SPIO濃度分別調(diào)整至25 μg/m l、50 μg/m l、75 μg/m l。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞全部貼壁后，PBS沖洗三遍，用4%多聚甲醛固定20 m in后行普魯士藍(lán)染色，在倒置顯微鏡下觀察染色情況并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。計(jì)3個(gè)低倍鏡視野內(nèi)200個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算標(biāo)記效率(陽(yáng)性細(xì)胞比率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)×100%)。

CCK8方法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性：將標(biāo)記三種不同濃度SPIO的BMSCs及正常對(duì)照細(xì)胞接種于96孔板中，每孔約1×104個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞全部貼壁后，加入正常培養(yǎng)液置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h。加入CCK8液后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔的OD值。

1.2.3 分組與給藥方法

實(shí)驗(yàn)分組：28只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法，分為正常對(duì)照組(CON，n=4)、假手術(shù)組(SHAM，n=4)、局灶性腦梗死對(duì)照組(MCAO+SPIO，n=10)和SPIO標(biāo)記BMSCs治療組(MCAO+SPIO-BMSC，n=10)。局灶性腦梗模型的制作采用右側(cè)大腦中動(dòng)脈線栓法。重(280±20) g(n=20)大鼠行腹腔麻醉(10%水合氯醛，0.3 m l/100g)，備皮、消毒。暴露頸前鼠毛，鈍性分離皮下組織，分離右側(cè)動(dòng)脈鞘，結(jié)扎頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，眼科剪剪口，置入肝素化魚線(直徑2.4 mm)，魚線深度1.8～2.0 cm至大腦中動(dòng)脈分叉處。栓塞術(shù)后2 h拔除線栓，制備大鼠局灶性腦梗死模型。假手術(shù)組僅結(jié)扎頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈。在大腦中動(dòng)脈栓塞術(shù)后第3天，正常對(duì)照組及假手術(shù)組不做處理，MCAO+SPIO組大鼠通過(guò)立體定向注射方法注射6 μl濃度為50 μg/m l SPIO，MCAO+SPIO-BMSC 組取5.0×105個(gè)SPIO標(biāo)記BMSCs于EP管中，用50 μl PBS混勻，共注射6 μl細(xì)胞懸液。立體定向注射的進(jìn)針位置位于海馬區(qū)(前囟后3.5 mm，中線右旁2.5 mm，距顱骨表面3.0 mm)，注射速率為0.02 μl/m in。注射完成后，針頭留置10 m in,以避免注射液從針頭周圍漏出。

1.2.4 SPIO標(biāo)記BMSC的在體MRI掃描

大腦中動(dòng)脈栓塞術(shù)后第3天，行MRI檢查明確模型有無(wú)梗死及梗死范圍。于大鼠腦立體定向注射術(shù)后第1、9、20、30、43天，分別對(duì)MCAO+SPIO組及MCAO+SPIO-BMSC組行1.5 T MRI(GE公司)掃描，所用線圈為上海辰光公司5 cm四通道大鼠專用線圈。掃描MRI序列包括T2W I、彌散加權(quán)成像(diffusion weighted imaging, DW I)、磁敏感加權(quán)成像(suscep tibility weighted im aging, SW I)。大鼠采取尾先進(jìn)，俯臥位，頭顱中心點(diǎn)與線圈中心點(diǎn)重合。MRI掃描序列及參數(shù)如下：(1)T2W I采用快速自旋回波FSE序列，TR/TE=2050/80 ms，NEX= 4，F(xiàn)OV 10 mm，層厚2.0 mm。(2)SW I采用SWAN序列，TR/TE=87.2/44.3 ms，NEX=1，F(xiàn)lip angle 15°，層厚1.0 mm。(3)DW I采用DW-EPI序列，TR/TE=3200/85.9 ms，b值為0和800 s/mm2，NEX=4，層厚2.0 mm。

1.2.5 大鼠腦切片的普魯士藍(lán)染色

在MRI檢測(cè)43天結(jié)束后，將大鼠腦組織放入10%的甲醛溶液中固定，距額極2.5 mm處向后切取2.5 mm腦組織，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片(厚約4 μm)、干燥，普魯士藍(lán)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察梗死區(qū)周圍染色情況。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用G raphpad p rism 5 軟件進(jìn)行分析與作圖，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 普魯士藍(lán)染色標(biāo)記效率及細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

光學(xué)顯微鏡下，正常對(duì)照組未見明顯陽(yáng)性染色結(jié)果(圖1A)，SPIO標(biāo)記組均可見細(xì)胞胞漿內(nèi)被染成藍(lán)黑色的鐵顆粒，散在分布于細(xì)胞核周圍(圖1B～D)。對(duì)不同濃度SPIO的標(biāo)記情況進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，BMSCs內(nèi)鐵含量隨SPIO孵育濃度的增加而增加，50 μg/m l和75 μg/m l兩組的SPIO標(biāo)記率可達(dá)100%。25 μg/m l組有少量細(xì)胞未被染色，標(biāo)記效率為80%。CCK 8法結(jié)果顯示，25 μg/m l組、50 μg/m l組與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖受到一定抑制(P＜0.05)，75 μg/m l組與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖受到明顯抑制(P＜0.05)，見圖2。

綜合普魯士藍(lán)染色和CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，50 μg/m l濃度的SPIO能夠有效標(biāo)記BM SCs，且對(duì)BMSCs增殖活性影響較小，可用于標(biāo)記BMSCs進(jìn)行MRI在體示蹤的研究。

2.2 局灶性腦梗死模型制備及其MRI表現(xiàn)

使用1.5 T M RI于大腦中動(dòng)脈栓塞術(shù)后第3天，對(duì)正常對(duì)照組、假手術(shù)組及手術(shù)組行MRI檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組與假手術(shù)組在DW I、SW I及T2W I上無(wú)明顯異常信號(hào)(圖3A)。而手術(shù)組第3天在DW I及T2W I上可見右側(cè)大腦半球斑片狀高信號(hào)，SWI序列未見明顯高信號(hào)(白色箭頭所指)，提示大鼠發(fā)生急性腦梗死，梗死范圍主要為大腦皮質(zhì)和紋狀體區(qū)腦組織。10天后再次行MRI檢查發(fā)現(xiàn)梗死灶DWI及T2W I高信號(hào)更加明顯，提示腦組織液化壞死。

2.3 局灶性腦梗死局部腦注射SPIO的MRI表現(xiàn)

MCAO+SPIO組于第1、9、20、30天行MRI掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后第1天MCAO+SPIO組移植部位在T2W I及SWAN上均有明顯低信號(hào)改變。隨著時(shí)間推移，低信號(hào)范圍未見明顯擴(kuò)大且低信號(hào)強(qiáng)度逐漸減低，說(shuō)明SPIO仍停留在注入部位，未發(fā)生明顯遷移。大鼠右側(cè)梗死腦皮質(zhì)邊緣T2W I信號(hào)隨時(shí)間逐步增高，與MCAO 10天后的梗死面積及信號(hào)強(qiáng)度變化大致相仿，提示SPIO對(duì)腦梗死預(yù)后無(wú)明顯影響(圖3B)。

2.4 局灶性腦梗死局部腦注射SPIO-BMSC的MRI表現(xiàn)

大鼠腦立體定向注射術(shù)后第1、9、20、30、43天行MRI掃描，MCAO+SPIO-BMSC組在T2W I和SWAN序列上均能清楚檢測(cè)到移植側(cè)SPIO標(biāo)記的BMSCs，移植細(xì)胞在兩個(gè)序列的圖像上表現(xiàn)為右側(cè)海馬區(qū)明顯的信號(hào)減低，且SW I較T2W I顯示范圍更廣(圖3C)。MCAO+SPIO-BMSC組9天后行MRI發(fā)現(xiàn)低信號(hào)區(qū)以移植部位為基礎(chǔ)沿周圍神經(jīng)纖維束向右側(cè)腦皮質(zhì)及紋狀體區(qū)梗死灶遷移，影像學(xué)上表現(xiàn)為右側(cè)腦梗死灶邊緣斑片狀低信號(hào)(圖3B)，提示BMSCs在腦組織內(nèi)發(fā)生了向損傷區(qū)域的定向遷徙與擴(kuò)散。與MCAO+SPIO組相比，右側(cè)梗死腦皮質(zhì)邊緣T2WI、DW I腦梗死高信號(hào)范圍及強(qiáng)度隨時(shí)間逐漸減弱，說(shuō)明局灶性腦梗死程度在影像學(xué)上有所改善。

2.5 大鼠腦切片的普魯士藍(lán)染色結(jié)果

腦立體定向注射移植術(shù)后43天，取梗死灶周圍腦組織切片行普魯士藍(lán)染色，每張切片選取局灶性腦梗死區(qū)域內(nèi)5個(gè)不連續(xù)視野進(jìn)行顯微鏡下觀察，移植側(cè)普魯士藍(lán)染色可見陽(yáng)性染色細(xì)胞分布于局灶性梗死區(qū)域周圍，提示部分SPIO存留于BMSCs內(nèi)(圖4)。

3 討論

本研究的主要目的在于通過(guò)采用MRI技術(shù)示蹤在體SPIO標(biāo)記BM SC s，觀察SPIO標(biāo)記的BMSCs在局灶性腦梗死模型中的遷移及治療情況。本實(shí)驗(yàn)中，筆者采用腦內(nèi)立體定向注射方法將50 μg/m l SPIO標(biāo)記的BMSCs移植到右側(cè)腦梗死大鼠海馬區(qū)，利用BMSCs能向炎性病灶趨化及SPIO能夠縮短T2信號(hào)的特性，研究MRI示蹤活體實(shí)驗(yàn)性干細(xì)胞移植后的遷移及行為學(xué)的可行性。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的治療機(jī)制主要包括：移植細(xì)胞向損傷部位定向遷移并分化成神經(jīng)元，在損傷部位促進(jìn)血管生成，抗膠質(zhì)細(xì)胞增生，抗細(xì)胞凋亡等。BM SCs能夠分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)等促進(jìn)側(cè)腦室周圍神經(jīng)干細(xì)胞向損傷部位的遷移分化，即促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)修復(fù)[1, 5-7]。這些均能明顯改善缺血性腦梗死大鼠的神經(jīng)損傷情況。

大腦中動(dòng)脈閉塞導(dǎo)致的腦組織損傷主要集中于大腦皮質(zhì)及紋狀體等[8]。通過(guò)MRI示蹤SPIOBMSC后發(fā)現(xiàn)，BMSCs沿神經(jīng)纖維束向右側(cè)大腦皮質(zhì)及紋狀體移行，說(shuō)明大腦皮質(zhì)及紋狀體缺血梗死形成的炎性環(huán)境促使移植細(xì)胞發(fā)生了趨化。腦梗死發(fā)生后病灶微環(huán)境紊亂，營(yíng)養(yǎng)成分匱乏，氧自由基較多，這些不利條件使BMSCs在梗死區(qū)域難以存活，但功能恢復(fù)情況又與損傷區(qū)域存活的神經(jīng)元數(shù)量密切相關(guān)[9]。通過(guò)立體定向注射方法進(jìn)行BMSCs移植能夠避免細(xì)胞首過(guò)效應(yīng)，特別是肺組織吞噬的影響，保證移植數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)。確保移植細(xì)胞準(zhǔn)確到達(dá)腦實(shí)質(zhì)，且移植過(guò)程不會(huì)破壞血腦屏障完整性，保證內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性，有效促進(jìn)梗死區(qū)域的血管生成、樹突塑形及軸突出芽[10-11]。

SPIO以單晶體氧化鐵為基礎(chǔ)，具有超順磁性。能產(chǎn)生較強(qiáng)的T2負(fù)性對(duì)比效應(yīng)，很低濃度即可被MR檢測(cè)到，且易生物降解。超順磁性氧化鐵標(biāo)記干細(xì)胞具有簡(jiǎn)單易行、無(wú)創(chuàng)、可進(jìn)行個(gè)體的持續(xù)縱向研究的特點(diǎn)。筆者前期通過(guò)全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs，并對(duì)SPIO標(biāo)記的BMSCs進(jìn)行了體外MRI表現(xiàn)探究[12]。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)對(duì)BMSCs進(jìn)行標(biāo)記的SPIO濃度為50 μg/m l時(shí)，相比于其他濃度，BMSCs的標(biāo)記效率高且對(duì)生長(zhǎng)、增殖情況無(wú)明顯影響，與多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道相符[8, 13-14]。以往報(bào)道的關(guān)于SPIO示蹤BM SCs的時(shí)間多為3周以內(nèi)，超高場(chǎng)強(qiáng)(≥7 T)小動(dòng)物專用MRI可延長(zhǎng)一定時(shí)間的示蹤時(shí)間窗。筆者研究所用1.5 T MRI對(duì)SPIOBMSC的活體檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)43 d。本研究中，筆者選用大劑量的BMSCs注射，移植的SPIO-BMSCs數(shù)量為6×104個(gè)[15]，但SPIO在BMSCs內(nèi)隨細(xì)胞有絲分裂及外周巨噬細(xì)胞的吞噬，濃度不斷減低，導(dǎo)致其在T2上的低信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間逐漸減弱。MRI檢測(cè)不到SPIO信號(hào)后，只能通過(guò)病理學(xué)檢查評(píng)估BMSCs的生物學(xué)行為。Bon Chul Ha等[16]通過(guò)尾靜脈注射方法向局灶性腦梗死大鼠中移植2.5×105個(gè)SPIO標(biāo)記的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，應(yīng)用3 T MRI定期檢測(cè)干細(xì)胞遷移情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SW I序列較T2W I、T2*W序列能夠更敏感、更早期、更長(zhǎng)期地檢測(cè)到SPIO信號(hào)。但現(xiàn)有的影像學(xué)方案對(duì)SPIO的可探測(cè)程度仍然有限，導(dǎo)致我們不能對(duì)增殖迅速的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞做長(zhǎng)期縱向觀察研究。目前課題組正在研究使用Fth1(鐵蛋白合成基因)轉(zhuǎn)染的BMSCs進(jìn)行活體移植，以期進(jìn)行長(zhǎng)期示蹤研究。

圖1 A～D分別為正常對(duì)照組、25 μg/m l、50 μg/m l、75 μg/m l 三種不同濃度SPIO標(biāo)記BMSCs的普魯士藍(lán)染色情況(40×)圖2 CCK8法測(cè)定不同濃度SPIO標(biāo)記BMSCs 增殖活性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：與對(duì)照組相比，①P＜0.05；與25 μg/m l SPIO組相比，②P＞0.05；與50 μg/m l SPIO組相比，③P＜0.05；與75 μg /m l SPIO組相比，④P＜0.05 圖3 A：從左至右依次為正常對(duì)照組、假手術(shù)組及MCAO后3、10天的MRI掃描序列DW I、SW I、T2W I圖像；B：MCAO+SPIO組MRI掃描序列DW I、SW I、T2WI圖像；C：MCAO+SPIO-BMSC組MRI掃描序列DW I、SWI、T2W I圖像圖4 大鼠腦組織普魯士藍(lán)染色觀察(100×) (A、B為不同位置局灶性腦梗死灶周圍普魯士藍(lán)分布情況)Fig. 1 Efficiency of Prussian blue staining in different concentrations of BMSCs labled w ith SPIO. Fig. 2 Statistic analysis of CCK8 method in detecting effects of different concentrations of SPIO in proliferative activity of BMSCs. Compared w ith the control group,①P＜0.05; Compared w ith the 25 μg/m l SPIO group,②P＞0.05; Compared w ith the 50 μg/m l SPIO group,③P＜0.05; Compared with the 75 μg/m l SPIO group,④P＜0.05. Fig. 3 A: From left to right: MR images (DW I, SW I, T2W I sequences) of CON, SHAM, MCAO groups in day3, day10; B: MR im ages (DW I, SW I, T2W I sequences) of MCAO+SPIO group; C: MR images (DW I, SWI, T2W I sequences) of MCAO+SPIO-BMSC group. Fig. 4 Prussian blue staining observation of rat brain (100×) (A, B for different locations of focal cerebral infarction in the surrounding area of the distribution of the blue)

Ishizaka等[5]選取三個(gè)不同的移植時(shí)間點(diǎn)(梗死后第1、4、7天)進(jìn)行局灶性腦梗死模型的干細(xì)胞治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第1、4天移植的干細(xì)胞能廣泛遷移到梗死灶周圍，且模型神經(jīng)功能評(píng)分明顯改善。而第7天移植的干細(xì)胞只有極少數(shù)能遷移到梗死區(qū)域且神經(jīng)功能無(wú)明顯改善。其機(jī)制可能與早期行干細(xì)胞移植能夠明顯降低活化小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，增加反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，下調(diào)MMP-9的表達(dá)有關(guān)。MMP-9與腦缺血損傷后血腦屏障破壞、血管源性水腫及炎性反應(yīng)呈正相關(guān)。因此移植治療時(shí)間窗的選擇影響到宿主微環(huán)境的穩(wěn)定性，影響治療效果。筆者選擇在梗死后第3天做移植治療，影像學(xué)評(píng)估顯示，與MCAO+SPIO組相比，MCAO+SPIO-BMSC組T2W I高信號(hào)梗死病灶的范圍及強(qiáng)度隨時(shí)間逐漸減弱，說(shuō)明BMSCs對(duì)局灶性腦梗死具有一定的治 療作用，這一作用可以通過(guò)影像學(xué)方法進(jìn)行評(píng)估。腦缺血后血管擴(kuò)張能夠加重?fù)p傷區(qū)域的炎癥，不排除SPIO是通過(guò)巨噬細(xì)胞的吞噬遷移至腦梗死區(qū)域，因?yàn)橛醒芯匡@示鐵沉積的區(qū)域均分布于血管周圍[8]。筆者研究的不足之處在于動(dòng)物樣本量較少，缺乏對(duì)SPIO-BMSC治療缺血性腦梗死病理機(jī)制的深入研究。

本實(shí)驗(yàn)采用50 μg/m l濃度的 SPIO標(biāo)記BMSCs，觀測(cè)到MCAO+SPIO-BMSC組各時(shí)間點(diǎn)缺血梗死灶內(nèi)斑片狀T2WI低信號(hào)，且MCAO+SPIO-BMSCs組較M CAO+SPIO組各時(shí)間點(diǎn)腦梗死病程進(jìn)展輕，提示BMSCs立體定向移植有助于減緩或改善局灶性腦梗死病情，而磁共振技術(shù)可對(duì)BMSCs在局灶性腦梗死中的遷移治療情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀測(cè)，有助于對(duì)BMSCs的在體生物學(xué)行為進(jìn)行更深入的認(rèn)識(shí)。但探測(cè)SPIO標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的MRI敏感性受多種因素的影響，如MRI方案及軟件。筆者的影像學(xué)方案可能對(duì)某些移植細(xì)胞或小的細(xì)胞聚集簇不敏感，需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步證明。

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MRI tracking study of SPIO labeled bone marrow stromal cells transp lantation for treatment of lacunar stroke

HUANG Xiao-lei1, ZHOU Guo-xing2, WANG Bo-cheng1, WU Jin-liang1, XUE Yang1,
CA I Ling-ling1, XING Jin1, ZONG Gen-lin2, ZHAN Qing3*, ZHAO Jiang-m in1*1The Nine Peop le's Hospital A ffiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 201999, China
2Department of M edical Im aging, Oriental Hospital of Shanghai City, Shanghai 200120, China
3Shanghai Seventh People’s Hospital, Shanghai 200137, China

Objective: To explore the feasibility of MRI technology in tracing bone marrow mesenchymal stem cells labeled w ith SPIO, and observe m igration and therapeutic condition of BMSCs in focal cerebral infarction model. M aterials and M ethods: Investigate label efficiency and proliferation activity of three different concentrations of SPIO (25 μg/m l, 50 μg/m l, 75 μg/m l ) by Prussian blue staining and CCK 8 method. A total of 28 male SD rats w ere random ly divided into normal control group (CON, n=4), sham operation group(SHAM, n=4), focal cerebral infarctiongroup treated w ith SPIO only (MCAO+SPIO, n=10), and focal cerebral infarction treated w ith op tmal SPIO-BMSCs (MCAO+SPIO-BMSC, n=10), MRI scan was underwent on 1 day, 9 days, 20 days, 30 days, 43 days after cell transplantation. Distribution of cell m igration were observed by Prussian blue staining. Resu lts: When label concentration was 50 μg/m l, Prussian blue staining efficiency was 100%. Compared w ith control group and 75 μg/m l group, 50 μg/m l group was significantly different (P＜0.05). In MCAO+SPIO and MCAO+SPIO-BMSC groups, transplanted cells on T2W I and SW I sequences obviously showsignal reducing area. Compared with T2W I sequences, SW I sequences show a longer, w ider range of low signal. Compared w ith MCAO+SPIO group, MCAO+SPIO-BMSC group can observe that bone marrow mesenchymal stem cells m igrate into infarction areas. Prussian blue staining showed that positive cells gathered around the infarction area. Conclusion: MRI techniques can effectively trace mesenchymal stem cells labeled with 50 μg /m l SPIO, monitor m igration and therapeutic condition of BMSCs in focal cerebral infarction model, and evaluate the imaging improvement of focal cerebral infarction.

Superparamagnetic iron oxides; Bone marrow mesenchymal stem cells; Stroke; Magnetic resonance imaging

上海市科委科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào)：10411953400)；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院項(xiàng)目(編號(hào)：12XJ30061)；上海市衛(wèi)生計(jì)生委項(xiàng)目(編號(hào)：20124194)；上海市寶山區(qū)科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研項(xiàng)目(編號(hào)：14-E-4)

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，上海 201999

2. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院，上海 200015 3. 上海市第七人民醫(yī)院，上海 200137

詹青，E-mail: zhanqing@#edu.cn；趙江民，E-mail: johnmzhao@sjtu.edu.cn

2016-01-04接受日期：2016-03-11

R445.2；R743.3

A

10.12015/issn.1674-8034.2016.04.012

黃曉蕾, 周國(guó)興, 王博成, 等. SPIO標(biāo)記BMSCs移植治療局灶性腦梗死的MRI示蹤研究. 磁共振成像, 2016, 7(4): 303–309.

*Correspondence to: Zhan Q, E-mail: zhanqing@#edu.cn; Zhao JM, E-mail: johnmzhao@sjtu.edu.cn