蘇會(huì)嵐,張瑞林

（成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系,四川成都610500）

殼聚糖-普魯士藍(lán)-石墨烯（CS-PB-GR）復(fù)合物用于高靈敏電化學(xué)免疫傳感器研究

蘇會(huì)嵐*,張瑞林

（成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系,四川成都610500）

合成了CS-PB-GR復(fù)合物，并將其修飾在玻碳電極表面，通過共價(jià)作用結(jié)合Pt/Au納米合金，進(jìn)一步固載甲胎蛋白（AFP抗體），采用HRP進(jìn)行封閉，構(gòu)建高靈敏電化學(xué)免疫傳感器。采用示差脈沖伏安法（DPV）和循環(huán)伏安法（CV）對電極修飾過程及響應(yīng)性能進(jìn)行研究。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，電流響應(yīng)值與AFP濃度在0.1~200 ng/mL的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限為0.03 ng/mL，具有重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對免疫分子的高靈敏檢測。

石墨烯；普魯士藍(lán)；電化學(xué)免疫傳感器；甲胎蛋白

0 引言

原發(fā)性肝癌（PHC）早期癥狀不明顯，臨床上發(fā)現(xiàn)時(shí)多處于中晚期，且疾病發(fā)展迅速，治療困難，預(yù)后差。有效的早期診斷是提高患者5年生存率的重要手段。甲胎蛋白（AFP）是臨床上原發(fā)性肝癌早期診斷、療效觀察和預(yù)后判斷的重要指標(biāo)。因此，建立一種簡便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好、成本低的檢測方法對肝癌的早期篩查和預(yù)后判斷具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。而電化學(xué)免疫傳感器因其具有靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤標(biāo)志物的檢測中被廣泛關(guān)注。

電化學(xué)免疫傳感器的信號通常是通過將電活性物質(zhì)固定在電極表面或放入檢測底液中來指示電信號變化的。普魯士藍(lán)（PB）是電化學(xué)分析過程中常用的電活性物質(zhì)，在傳感器構(gòu)建中可通過包埋、電沉積及制備納米材料等方式將其修飾在電極表面，但普魯士藍(lán)在傳感界面上易脫落，導(dǎo)致免疫傳感器的穩(wěn)定性降低[1-2]。2010年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)授予了石墨稀的發(fā)現(xiàn)者Andre Geim和Konstantin Novoselov教授，使石墨烯作為一種新型納米材料登上材料科學(xué)的舞臺。石墨烯具有高的比表面積(2630 m2/g)、強(qiáng)導(dǎo)電性(103～104 S/m)、高韌性等特點(diǎn)，在電化學(xué)免疫傳感器的研究中可用于增大電極比表面積和提高電極表面的電子傳輸能力[3-6]，基于石墨烯的復(fù)合納米材料因其具有各材料的協(xié)同效應(yīng)也引起廣泛關(guān)注[7]。基于此，該研究制備了基于殼聚糖（CS）-普魯士藍(lán)（PB）-石墨烯（GR）（CS-PB-GR）復(fù)合物的AFP免疫傳感器，通過Pt/Au納米合金、辣根過氧化酶（HRP）、PB對底物過氧化氫的催化作用放大響應(yīng)信號。該研究優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件，并對該免疫傳感器的電化學(xué)特性及其響應(yīng)性能進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

EC 6800電化學(xué)分析儀 （上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），78AW-1恒溫磁力攪拌器（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠），S04H超聲波清洗儀 （致微儀器有限公司），低速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司），PHS-320PH計(jì)，優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。AFP甲胎蛋白診斷試劑盒購于鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司，HRP、氯鉑酸、氯金酸、殼聚糖購于將來實(shí)業(yè)，石墨烯購于先豐納米。

1.2 免疫傳感器的制備

1.2.1 CS-PB-GR的制備

準(zhǔn)確稱量六水合氯化亞鐵6.000 mg，鐵氰化鉀8.000 mg，氯化鉀37 mg，用5 mL超純水溶解，調(diào)節(jié)pH至1.5。將1 mg/mL GR加入上述溶液中，攪拌24 h，離心洗滌，即得PB-GR復(fù)合物。將1 mL 1 mg/mL的CS懸浮液加到PB-GR溶液中，攪拌，洗滌，分散于蒸餾水中。

1.2.2 Pt/Au的制備

將1 mL 1%的氯金酸溶液加入到100 mL攪拌中的沸水，迅速加入1.5 mL檸檬酸鈉（1%），20 min后，再向其中依次加入維生素C溶液和氯鉑酸（1%），繼續(xù)加熱30 min即得Pt/Au納米合金。

1.2.3 免疫傳感器的制備

用α-氧化鋁拋光粉將玻碳電極打磨拋光，然后分別用無水乙醇和超純水超聲清洗。氮?dú)獯蹈珊?，滴?0.0 μL CS-PB-GR復(fù)合物，晾干。將上述電極在納米Pt/Au復(fù)合液中浸泡6 h，然后放于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫傳感器檢測原理及方法

采用示差脈沖伏安法（DPV）和循環(huán)伏安法（CV）對免疫傳感器進(jìn)行表征。以修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為對電極。掃描電位區(qū)間為-0.2~0.8 V，掃速為50 mV/s。測試底液為磷酸緩沖溶液PBS。

2 結(jié)果與討論

2.1 免疫傳感器制備過程的電化學(xué)表征

采用DPV研究了免疫傳感器制備過程的電化學(xué)行為（圖1）。從圖1可知，GCE表面修飾上一層CS-PB-GR后，可以觀察到PB的特征峰（曲線a），此時(shí)連續(xù)掃描30圈，其峰電流基本不變，說明殼聚糖具有良好的成膜性，可穩(wěn)定的修飾在電極表面。在電極表面共價(jià)修飾上Pt/Au納米合金后，峰電流明顯升高（曲線b），這是由于Pt/Au納米合金提高了電極表面的電子傳輸效率。進(jìn)一步通過Pt/Au對蛋白質(zhì)的共價(jià)吸附作用，修飾上anti-AFP，由于蛋白質(zhì)的電化學(xué)惰性使峰電流明顯下降 （曲線c），最后用HRP封閉GCE表面的非特異性吸附位點(diǎn)，峰電流進(jìn)一步減小（曲線d），說明該免疫傳感器得以成功構(gòu)建。

圖1 不同修飾電極的DPV表征圖：（a）CS-PB-GR/ GCE;（b）Pt/Au/CS-PB-GR/GCE；（c）anti-AFP/Pt/Au/CSPB-GR/GCE；（d）HRP封閉Fig.1 DPV of different electrodes:（a）CS-PB-GR/GCE;（b）Pt/Au/CS-PB-GR/GCE；（c）anti-AFP/Pt/Au/CS-PBGR/GCE；（d）HRP block

2.2 免疫傳感器電化學(xué)特性

為了研究該免疫傳感器的電子傳遞過程，用循環(huán)伏安法測試了其在50~300 mV/s掃速下的循環(huán)伏安響應(yīng)情況（圖2）。由圖2可知，隨著掃速的不斷增加，氧化還原峰均不斷增大。由插圖可知，氧化還原峰電流的增大與掃速成正比，可說明該氧化還原行為由表面控制。

圖2 傳感器在不同掃速（mV/s）下的循環(huán)伏安圖（a）50（b）100（c）150（d）200（e）250（f）300（插圖：氧化還原峰電流與掃速的關(guān)系）Fig.2 CVs of the modified electrode at scan rate of(from inner to outer):（a）50（b）100（c）150（d）200（e）250（f）300 mV/s;Inset:plot of peak current vs scan rate

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.3.1 pH優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)用循環(huán)伏安法探討了不同pH對免疫傳感器響應(yīng)的影響。由圖3可知，當(dāng)測試底液的pH從4.5到7.0變化，氧化還原峰電流均隨之增大。由于低pH會(huì)降低蛋白質(zhì)的分子活性，并且對PB的電化學(xué)響應(yīng)也有影響，而過高的pH又會(huì)降低免疫傳感器的靈敏度。因此，實(shí)驗(yàn)選擇pH7的PBS作為測試底液。

圖3 測試底液pH對免疫傳感器的影響Fig.3 the CVs of the modified electrode in detection solution with different pH

2.3.2 孵育時(shí)間優(yōu)化

特異性免疫識別完成程度與免疫反應(yīng)的時(shí)間有關(guān)。實(shí)驗(yàn)采用循環(huán)伏安法將制備好的免疫傳感器在AFP抗原溶液中分別孵育5、8、10、12、18、20 min，其響應(yīng)電流隨孵育時(shí)間增加而降低（圖4）。當(dāng)孵育時(shí)間為12 min以后，電流變化不明顯，表明12 min時(shí)免疫反應(yīng)完全。故實(shí)驗(yàn)選用12 min為孵育時(shí)間。

2.3.3 底物催化對免疫傳感器的信號增強(qiáng)作用

實(shí)驗(yàn)研究了H2O2對免疫傳感器響應(yīng)電流的增強(qiáng)效應(yīng)。將制備好的電極與2.5 ng/mL AFP孵育，研究測試底液中H2O2對傳感器響應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，加入4 mmol/L H2O2后，響應(yīng)電流增加14 μA，證明該免疫電極對H2O2有明顯的催化作用。

圖4 孵育時(shí)間對免疫傳感器的影響Fig.4 the effect of incubation time on the response of the biosensor

2.4 免疫傳感器響應(yīng)性能研究

將制備好的免疫傳感器在最優(yōu)條件下與不同濃度的AFP抗原溶液孵育，測定傳感器響應(yīng)電流與AFP濃度之間的關(guān)系，結(jié)果如圖5所示。由圖中可以看出，隨著AFP濃度增加，傳感器上的免疫復(fù)合物也越多，使其氧化還原峰電流逐漸減小，抗原濃度在0.1~200 ng/mL范圍內(nèi)與響應(yīng)值成正比，檢測限為0.03 ng/mL。

圖5 AFP抗原濃度與響應(yīng)電流之間的關(guān)系Fig.5 linear relationship between the peak current and concentration of AFP

2.5 免疫傳感器其他性能研究

2.5.1 選擇性

實(shí)驗(yàn)將免疫傳感器分別與100 ng/mL AFP抗原、100 ng/mL AFP抗原與干擾物質(zhì) （100 ng/mL的癌胚抗原、25 ng/mL HRP、0.25%的牛血清白蛋白）等體積混合液孵育。結(jié)果顯示，免疫傳感器在混合樣品與相同濃度AFP的標(biāo)準(zhǔn)品種的響應(yīng)基本相同，說明干擾物對響應(yīng)信號的干擾很小，證明該傳感器的選擇性良好。

2.5.2 重現(xiàn)性

實(shí)驗(yàn)用 5只免疫傳感器同時(shí)與 20 ng/mL AFP抗原孵育，測定5只免疫傳感器對相同濃度抗原的響應(yīng)差異。結(jié)果顯示，5只免疫傳感器的響應(yīng)電流的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.8%，證明該免疫傳感器具有良好的重現(xiàn)性。

2.5.3 穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)對該免疫傳感器的穩(wěn)定性開展研究。將免疫傳感器與5 ng/mL AFP抗原孵育后4℃保存。每5 d測試一次，連續(xù)測試5次。結(jié)果表明，響應(yīng)電流標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%，說明該免疫傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

該研究采用超聲合成法制備了CS-PB-GR復(fù)合物，有效提高了PB在電極表面的穩(wěn)定性。同時(shí)，利用殼聚糖的良好成膜性及生物相容性，可使該復(fù)合物穩(wěn)定的修飾在電極表面。另外，GR的摻雜可有效增大電極的比表面積，同時(shí)利用GR的強(qiáng)導(dǎo)電性可有效提高電極敏感膜的導(dǎo)電性能，提高電子傳輸效率，增強(qiáng)檢測靈敏度。同時(shí)，采用化學(xué)合成法制備了Pt/Au納米合金，基于氨基共價(jià)作用將anti-AFP抗體固定在傳感器界面，用HRP封閉非特異吸附位點(diǎn)，制得免疫傳感器。該免疫傳感器中，Pt/Au納米合金、HRP、PB對過氧化氫的氧化還原具有催化作用[8-10]，在測試底液中加入過氧化氫，可獲得明顯增強(qiáng)的電流響應(yīng)信號，實(shí)現(xiàn)對甲胎蛋白的高靈敏檢測。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，該文采用甲胎蛋白為免疫分析模型，對傳感器的性能進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，該傳感器電極響應(yīng)的電流值與AFP濃度在0.1~200.0 ng/mL的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限為0.03 ng/mL，在免疫分子的高靈敏檢測中有廣泛的應(yīng)用前景。

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High sensitive electrochemical immunosensor based on the conductive composites:chitosan-prussian blue-graphene(CS-PBGR)

Su Hui-lan*，Zhang Rui-lin
（The department of public health,Chengdu medical college,Chengdu 610500,China）

The synthesis of chitosan-Prussian blue-graphene(CS-PB-GR)was conducted firstly,followed by the colvantly linked Pt/Au nanomaterials.Then,anti-AFP could be absorbed to the electrode surface by the reaction between Au and amino.After HRP blocked,the electrochemical immunosensor was prepared successfully,which were demonstrated by differential pulse voltammetry(DPV)and cyclic voltammetry(CV).The effects of experimental parameters and the performance of the biosensor were also been investigated.under the optimal experiment conditions,the prepared immunosensor displayed a liner relationship between 0.1~200 ng/mL with a detection limit of 0.03 ng/mL.The proposed immunosensor could be used for the detection of immune molecular with high sensitivity,good stability and selectivity.

graphene;prussian blue;electrochemical immunosensor;AFP

國家自然科學(xué)基金（81401757），發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（SYS16-004）

*通信聯(lián)系人,Tel：028-62739576，E-mail：suhuilan1986@163.com